基于熒光免疫層析法建立甲型流感病毒快速檢測技術的研究*

常曉松，劉東澤，何 緯，趙書閣，陳肖瀟，史 蕾，余華麗，何建偉，樊 強，王志杰△.四川國際旅行衛生保健中心(成都 600)；.四川邁克生物科技股份有限公司(成都 67)；.深圳國際旅行衛生保健中心(深圳 580)；.四川出入境檢驗檢疫局(成都 600)

·論著·

基于熒光免疫層析法建立甲型流感病毒快速檢測技術的研究*

常曉松1，劉東澤2，何 緯1，趙書閣2，陳肖瀟1，史 蕾3，余華麗4，何建偉4，樊 強4，王志杰4△
1.四川國際旅行衛生保健中心(成都 610041)；2.四川邁克生物科技股份有限公司(成都 611731)；3.深圳國際旅行衛生保健中心(深圳 518033)；4.四川出入境檢驗檢疫局(成都 610041)

目的基于熒光免疫層析技術平臺，針對甲型流感病毒抗原，開發甲型流感病毒快速診斷試劑。方法利用熒光微球標記甲型流感病毒單克隆抗體、生物素標記甲型流感病毒單克隆抗體以及包被親和素和羊抗鼠IgG多克隆抗體的檢測卡，構建甲型流感病毒檢測體系。通過原料評價、校準曲線、空白限、準確度、線性范圍、重復性、熱穩定性及臨床比對，驗證試劑診斷性能。結果本研究得到的熒光免疫層析試劑具有準確度高、檢測范圍寬、重復性和熱穩定性好等優點，其正確率及敏感率均明顯高于經典的膠體金試劑。結論本研究應用將為國境口岸或醫院的甲型流感病毒快速篩查提供方便、快捷、靈敏的技術手段。

熒光免疫層析技術；甲型流感病毒抗原；快速篩查

熒光免疫層析技術作為近年來新興的診斷技術，因其操作簡便、成本低廉、適宜于快速診斷等優勢，在傳染性疾病中已得到大量使用[1-3]。熒光免疫層析技術應用于針對特定病原體的檢測，熒光微球標記該病原體的單克隆抗體1，生物素標記該病原體的單克隆抗體2，然后按一定比例混合組成反應液[4]。將待測樣本與反應液按照一定比例混合，并靜置發生免疫反應，形成熒光微球-單克隆抗體1-病原體抗原-單克隆抗體2-生物素的夾心復合物，將夾心復合物滴加在試劑卡加樣孔中，夾心復合物中標記單克隆抗體2的生物素與檢測線的親和素結合，過量的熒光微球標記的單克隆抗體1被質控線上的羊抗鼠IgG多克隆抗體捕獲。待測樣本中的抗原濃度越高，形成的夾心復合物就越多，檢測線上被親和素捕獲的熒光免疫復合物的量也就越多，待測樣本中抗原的濃度與檢測線信號成正相關。通過熒光檢測儀，對檢測卡進行掃描獲得檢測信號，根據抗原濃度與熒光檢測信號的校準曲線，獲得待測樣本中病原體抗原的準確濃度，從而具有高特異性、高靈敏度等優勢。

本研究利用熒光微球標記甲型流感病毒單克隆抗體、生物素標記甲型流感病毒單克隆抗體以及包被親和素和羊抗鼠IgG多克隆抗體的檢測卡，構建甲型流感病毒檢測體系。通過原料評價、校準曲線、空白限、準確度、線性范圍、重復性、熱穩定性及臨床比對，驗證試劑診斷性能。同時，與現有的檢測技術，如PCR技術及膠體金試劑，進行相應的臨床試驗比較，進而對本試劑的臨床性能進行評價。

1 材料與方法

1.1材料

熒光微球，硝酸纖維素膜，Flu A McAb 1、Flu A McAb 2，羊抗鼠IgG多克隆抗體，鏈霉親和素，生物素酯，Flu A 質控品，比對試劑：1)甲型流感病毒檢測試劑盒(膠體金法)；2)熒光定量PCR測定。

1.2儀器

干式熒光免疫分析儀(型號：R01，邁克生物股份有限公司)。

1.3臨床樣本來源

1)廣東檢驗檢疫局P3實驗室樣本：2009年和2013年熒光定量PCR確診甲型流感臨床樣本共216例，其中，PCR陽性標本124例，陰性標本92例；2)深圳國際旅行衛生保健中心樣本：2016年熒光定量PCR確診甲型流感臨床樣本168例，其中，陽性樣本118例，陰性樣本50例。所有樣本均為咽拭子取自口腔上皮細胞，用1.5 mL細胞培養液洗脫備用。

1.4原料驗證

采用BCA法測定Flu A NP濃度值；采用SDS-PAGE凝膠電泳法，上樣量為5 μg，經過跑樣、染色等步驟，最終用凝膠成像系統觀察Flu A McAb 及NP的純度。

1.5甲型流感病毒免疫熒光檢測試劑制備及校準曲線

包被NC膜：檢測線包被鏈霉親和素，質控線包被羊抗鼠IgG多克隆抗體，PVC板貼NC膜、樣品墊、吸水紙、組裝干燥后切條；梯度稀釋Flu A NP質控品，濃度分別為100、50、20、10、5、2、1、 0.5、0 ng/mL，裂解液稀釋標記甲型流感病毒單克隆抗體1的微球和標記甲型流感病毒單克隆抗體2的生物素，與各濃度質控品按體積比為4∶1混合，每個濃度平行檢測3個檢測卡，反應15 min后檢測，熒光定量檢測儀讀取檢測線信號值。取3個試紙卡的檢測線信號平均值，擬合校準曲線，根據校準曲線擬合濃度值。

1.6免疫熒光層析試紙條檢測

加樣本25 μL到反應液中，混勻后靜置1 min，吸取90 μL混勻后的樣本，滴加到測試卡的加樣孔中，室溫下放置15 min，將測試卡插入免疫熒光檢測儀的承載孔中，點擊“掃描”，儀器將自動對測試卡進行掃描計算結果。

1.7空白限

1.8準確度

取同一批號試劑檢測，選擇2 ng/mL的濃度樣本作為基質，基質濃度記為A, 按照1∶10比例分別添加1、10、50 ng/mL的Flu A質控品，檢測濃度記為C，添加濃度記為B，按照公式：(90×B+10×A)/(100×C)計算回收率。

1.9線性范圍

用陰性質控品將接近測定范圍上限的高值樣本(可在陰性臨床樣本中添加高值質控品作為高值樣本)，按一定比例稀釋為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 ng/mL。對每1濃度的樣本均重復測定3次，計算其平均值，用線性回歸方法計算結果平均值和對應濃度的相關系數r。

1.10重復性

1.11熱穩性

取同1批試劑，放置37 ℃條件下做熱破壞實驗，37 ℃加速10 d后檢測，計算測定范圍內濃度值變化幅度，計算公式△(0～10 d)/0 d。

1.12臨床檢測

取同1批試劑，隨機抽取臨床咽拭子Flu A樣本檢測，與熒光定量PCR法和甲型流感病毒抗原檢測試劑盒(膠體金法)比對。

2 結果

2.1原料驗證

BCA法測定Flu A NP濃度是2.5 μg/mL，原料純度電泳圖如下所示，原料純度均在90%以上，符合要求(圖1)。

圖1 原料純度電泳圖

2.2基于熒光免疫層析技術的甲型流感病毒檢測卡的構建

硝酸纖維素膜上包被有檢測線、質控線，檢測線固定有親和素，質控線固定有羊抗鼠IgG多克隆抗體。紙條結構和實物圖如下所示(圖2～3)。

圖2 甲型流感病毒檢測試紙條結構圖

2.3甲型流感病毒檢測試劑標準曲線的確定

每批次試劑調試制備完成后，分別測定不同濃度的Flu A 抗原，以抗原濃度為橫坐標，測定信號值為縱坐標，制作校準曲線(圖4)

2.4甲型流感病毒檢測試劑空白限的確定

每批次試劑分別測定空白樣本各20次，計算空白限，空白限均不高于0.1 ng/mL(表1)。

圖3 甲型流感病毒檢測試紙條實物圖

圖4 3批試劑校準曲線

表1 3批試劑空白限計算結果

2.5甲型流感病毒檢測試紙條準確度

準確度采用添加回收的方式檢測，公式如下：

回收率={C×(V0+V)-C0×V0}/(V×Cs)×100%

式中：C: 添加后檢測濃度；C0: 添加前樣本濃度；V0：添加前樣本體積；V: 添加標準液體積；Cs：添加標準液濃度。

計算3批試劑的回收率偏差，回收率偏差均在±15%以內(表2)。

2.6甲型流感病毒檢測試劑線性范圍

在線性范圍0.1～100 ng/mL，3批試劑檢測結果線性相關系數R2分別是0.999、0.999、0.999，擬合曲線如下所示(圖5)。

表2 回收率計算

圖5 線性回歸分析圖

2.7甲型流感病毒檢測試劑重復性

每批次試劑分別測定標示濃度為1.0 ng/mL和10.0 ng/mL的Flu A抗原，計算CV，CV值均在20%以內，說明試劑重復性較好(表3)。

表3 重復性測定結果

2.8甲型流感病毒檢測試劑熱穩定性

把3批次試劑盒分別放置在37 ℃環境中，10 d后檢測，與0 d時信號值比較，計算信號值變化幅度，除空白值以外，其他濃度熱破壞前后信號值變化均在±20%，說明試劑熱穩定性較好(表4)。

表4 熱穩定性測定結果

2.9甲型流感病毒檢測試劑臨床試驗

2.9.1 廣東檢驗檢疫局P3實驗室樣本比對結果 該實驗室樣本共取124例核酸陽性標本(CT值為12.96～36.94)，92例陰性樣本。結果表明，本試劑敏感度是膠體金試劑的2倍多，正確率比膠體金法高，但誤診率有6.52%，數據上看均是在參考值附近的弱陽性,可能與樣本本身反復凍融或者樣本污染導致(表5)。

表5 廣東檢驗檢疫局本試劑與膠體金法性能比較

2.9.2 深圳國際旅行衛生保健中心樣本比對結果 該實驗室樣本共取118例核酸陽性標本(CT值為20.75～38.20)，50例陰性樣本。結果表明，本試劑正確率及敏感度均明顯高于膠體金法試劑(表6)。

表6 深圳國際旅行衛生保健中心本試劑與膠體金法性能比較

3 討論

2009年甲流疫情席卷全球，世界銀行專家以1968年香港流感和1918年西班牙流感為依據，估計甲流可能導致的全球經濟損失，介于全球GDP的0.7%～4.8%，或介于3 840億美元和26 330億美元之間[5-7]。甲型流感患者的早期發現對于控制疫情發展具有重要作用[8-9]。

目前，甲型流感病毒的確認一般采用雞胚或MDCK細胞分離培養和血凝抑制法，操作繁瑣且費時費力，難以滿足快速診斷需要[10-12]。隨著快速診斷技術的發展和應用，目前市場上甲型流感產品類型基本可以分為3大類：核酸診斷類(RT-PCR法)、酶聯免疫吸附法(ELISA法)和膠體金免疫層析法。RT-PCR法準確度最高，是確診的首選方法，但檢測成本較高，檢測時間較長[13-14]；ELISA法是醫院檢驗科和疾控系統實驗室的經典方法[15-16]；膠體金法速度最快，簡便易行，適合于普遍篩查[17-18]。目前，國境口岸快速篩查技術主要為膠體金技術，但由于膠體金檢測的靈敏度限制，導致較多的甲型流感病例漏檢[19]，不利于對甲流疫情的防控。

本項目開發的甲型流感病毒檢測試劑盒，采用免疫熒光層析技術，相對于膠體金技術，具有靈敏度高、特異性強等優點。通過本次驗證發現，免疫熒光層析檢測方法在操作的便利性方面與常規使用的膠體金檢測方法差異不大，樣本處理加檢測時間均控制在15 min以內，但正確率和敏感率均明顯優于膠體金方法，陽性樣品的陽性顯示較為客觀、明顯，易于判斷，陽性檢出率優于膠體金檢測方法，是一種新型的較為準確、靈敏度較高的快速檢測方法。在甲型流感爆發期，可以在口岸快速檢測流感樣患者，篩查可疑人群，防止疫情蔓延和擴大，且相對于膠體金法，在檢測敏感度上得到很大提高，降低了漏診風險；在非疫情爆發時期，亦可廣泛應用于醫院臨床、科研機構、衛生防疫部門、學校、醫院、大型運動會、展覽會等人員聚集場所。該技術已申請并授權實用新型專利，其后期應用轉化具有很好的市場前景。

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AStudyontheRapidDetectionTechnologyofInfluenzaAVirusBasedonFluorescenceImmunochromatography

ChangXiaosong1,LiuDongze2,HeWei1,ZhaoShuge2,ChenXiaoxiao1,ShiLei3,YuHuali4,HeJianwei4,FanQiang4,WangZhijie4△.
1.SichuanInternationalTravelHealthCareCenter,Chengdu610041,China; 2.SichuanMaccuraBiotechnologyCompanyLimited,Chengdu611731,China; 3.ShenzhenInternationalTravelHealthCareCenter,Shenzhen518033,China; 4.SichuanEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Chengdu610041,China

ObjectiveTo develop a rapid diagnostic kit for influenza A virus based on the platform of fluorescence immunochromatography.MethodsThe detection system for influenza A virus was constructed by using the fluorescent microsphere to label the influenza A virus monoclonal antibody, the biotin to label monoclonal antibody against influenza A virus, and the assaying card to detect the coated avidin and the goat-anti-mouse IgG polyclonal antibody. The diagnostic performance was validated by detecting the raw materials of the test strip, calibration curve, blank limit, accuracy, measurement range, repeatability and thermal stability and comparing the results of the clinical trials.ResultsThe fluorescence immunochromatographic strip obtained in the study has the advantages of high accuracy, wide measurement range and good repeatability and thermal stability, and its accuracy and sensitivity are significantly higher than those of immunochromatogragphic assay.ConclusionThe technology will provide a convenient, quick and sensitive diagnostic reagent for the rapid screening of influenza A virus in the frontier port or hospital.

Fluorescence immunochromatography; Influenza A virus; Rapid screening

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171009.1550.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.004

R446.5

A

四川省科技支撐計劃(No:2014SZ0032)；質檢公益性行業科研專項(No:201210046)

△

王志杰， E-mail：867523466@qq.com