9個產地夏枯草主要化學成分的比較分析*

徐 銳，張雪絨，郭巧生Δ，劉 麗，趙 淼，秦 琴, 陳宇航,Δ.成都醫學院 藥學院(成都 60500)；．南京農業大學 中藥材研究所(南京 0095)

·論著·

9個產地夏枯草主要化學成分的比較分析*

徐 銳1，張雪絨2，郭巧生2Δ，劉 麗2，趙 淼1，秦 琴1, 陳宇航1,2Δ
1.成都醫學院 藥學院(成都 610500)；2．南京農業大學 中藥材研究所(南京 210095)

目的對9個產地夏枯草的主要化學成分進行測定，并進行主成分分析和聚類分析。方法用分光光度計法測定夏枯草多糖和總黃酮含量，HPLC法測定迷迭香酸含量。結果9個產地夏枯草多糖含量在6.81%～12.49%，總黃酮含量在3.29%～5.82%，迷迭香酸含量在1.0%～3.3%。夏枯草的主成分為多糖，聚類結果顯示地理位置相近的聚為一類。結論9個產地夏枯草的主要化學成分含量比較，差異具有統計學意義，建議夏枯草質量評價應結合多糖含量。

夏枯草；多糖；總黃酮；迷迭香酸；主成分分析；聚類分析

夏枯草為唇形科植物夏枯草(PrunellavulgarisL.)的干燥果穗，為我國常用中藥材，具有清肝瀉火，明目，散結消腫等功效[1]。現代研究表明，夏枯草含有多種活性成分，主要有黃酮類、甾醇類、三萜類、腦苷脂類等化合物[2]，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3-6]。夏枯草分布地區廣泛，主產區有江蘇、浙江、河南、安徽等地。不同的生態環境會導致藥材的成分含量不同，進而影響藥材的質量。本研究采用分光光度計法測定9個產區夏枯草多糖和總黃酮含量，HPLC法測定迷迭香酸含量，用主成分分析法和聚類分析法對9個產區的夏枯草質量進行比較分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑

Alpha-1900S 紫外-可見分光光度計(上海潽元儀器有限公司)；旋片式真空泵(上海博爾康真空電子有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海虞龍儀器設備有限公司)；電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；打粉機(上海霸輝工具有限公司)；FL2200-高效液相色譜儀(浙江福立分析儀器有限公司)；超聲波清洗器(北京科璽科技有限公司)；Rios純水器(密理博上海貿易有限公司)。

0.305 mg/mL葡萄糖對照品：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品30.50 mg，加入適量蒸餾水溶解于100 mL容量瓶中定容，搖勻備用；0.014 mg/mL蘆丁對照品：精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品2.10 mg，加入適量30%乙醇溶解，并于150 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻備用；0.530 mg/mL迷迭香酸對照品：精密稱取干燥至恒重的迷迭香酸對照品5.30 mg，置于10 mL容量瓶中，加入適量95%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻備用。其中葡萄糖對照品(批號：20130222)購于天津博迪化工股份有限公司，蘆丁對照品(批號：141208)和迷迭香酸對照品(批號：151203)購于成都普菲德生物技術有限公司，石油醚、苯酚、乙醇、濃硫酸、亞硝酸鈉、氯化鋁和氫氧化鈉等均為市售分析純，甲醇為國產色譜純，試驗用水為超純水。

供試夏枯草藥材分別購于湖北省廣水縣、陜西省漢陰縣、浙江省麗水市、河南省舞鋼市、貴州省甕安縣、廣西省賀州市、廣東省連南縣、福建省寧化縣和湖南省張家界9個產地(表1)，經成都醫學院藥學院李羿教授鑒定，為唇形科植物夏枯草P.vulgarisL.的干燥果穗。

1.2方法

1.2.1 夏枯草多糖的提取和含量測定[7]精密稱取干燥粉碎后的夏枯草粉末0.5 g，置于索氏提取器中，加95%乙醇在90 °C索氏提取3 h，陰干；加入適量石油醚在80 ℃索氏提取2 h，回收石油醚，陰干；將殘渣以固液比(1∶65)加入適量蒸餾水，在95 °C恒溫水浴提取3 h，抽濾，冷卻，濾液置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻；取5 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得到供試液。

y=0.014 1x +0.000 6+e R2=0.988 9

(1)

式中：y為對應的吸光度值；x為樣品葡萄糖的濃度。

多糖含量(%)=f×c×D×V/W×100%

(2)

式中：f為換算因子(f=1.96)；c為樣品葡萄糖的濃度(mg/mL)；D為稀釋倍數；V為供試液體積(mL)；W為供試品重量(mg)。

表1 夏枯草樣品的收集地與來源

1.2.2 夏枯草總黃酮的提取和含量測定[8]精密稱取干燥粉碎后的夏枯草粉末0.5 g，于錐形瓶中，加入35%乙醇20 mL，密封搖勻；86 °C水浴恒溫提取3.5 h；將錐形瓶取出并冷卻至室溫，稱重，補液；抽濾，用微孔濾膜過濾，濾液用35%乙醇定容至25 mL，搖勻，得到供試液。

以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法繪制標準曲線。精密量取蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL后加30%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度(mg/mL)為橫坐標，得回歸方程式(3)。將夏枯草總黃酮供試液用上述方法在510 nm處測定吸光度，總黃酮含量按式(3)計算。

y=11.500x+0.038 5+e R2=0.987 5 (3)

竹韻有些犯難了，自己跟海力不過是普通主雇關系，上班拿了工資獎金，豈能再收他如此貴重的禮物？從馬麗亞眼里的敵視來看，她已經隱隱感覺出了些什么。但是，不收又如何拒絕呢？何不暫時把電腦收下，今后努力工作來回報公司，或者今后用工資付帳也行，其實她也早就想給龍斌買臺電腦了。想到這里，她伸手接過電腦，臉上也露出了笑容。

式中：y為對應的吸光度值；x為總黃酮含量。

1.2.3 夏枯草迷迭香酸的提取和含量測定[9]精密稱取干燥粉碎后的夏枯草粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇50 mL，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，用0.45 μM的微孔濾膜過濾，濾液即為供試液。

以迷迭香酸為標準品，采用高效液相法繪制標準曲線。色譜條件為：色譜柱：島津ODS18柱；流動相：甲醇-0.1%甲酸(42∶58)；流速：0.6 mL/min；波長：330 nm；注溫：25 °C；進樣量：10 μL。精密吸取迷迭香酸對照品溶液2、4、6、8 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品的進樣量x(μL)為橫坐標，峰面積y為縱坐標，繪制出標準曲線，得迷迭香酸回歸方程式(4)。分別精密吸取不同產地夏枯草迷迭香酸供試液10 μL，每組樣品重復進樣3次，按上述方法測定峰面積數值，迷迭香酸含量按式(5)計算。

y=4.1E+6x-5.1E+6 R2=0.994 1 (4)

式中：y為對應的吸光度值；x為對照品的進樣量。

含量=CR×AX/AR(5)

式中：CR為對照品濃度；AX為供試品峰面積；AR為對照品峰面積。

1.3統計學方法

2 結果

2.1不同產地的夏枯草果穗中成分的含量分析

不同產地夏枯草果穗中成分含量測定結果表明，所測定9個地區的的夏枯草果穗多糖含量在6.81%～12.49%，不同產地的夏枯草藥材其果穗中的多糖含量不一致。其中，廣西省賀州市多糖含量為12.49%，河南省舞鋼市多糖含量為12.01%，皆明顯高于其他產區，而陜西省漢陰縣多糖含量較低，只達到6.81%；總黃酮含量在3.29%～5.82%，不同產地的夏枯草果穗總黃酮含量也不一致。其中，福建省寧化縣總黃酮含量最高，達到了5.82%，而廣東省連南縣總黃酮含量低于其他地方，只有3.29%；迷迭香酸含量在1.0%～3.3%，不同產地的夏枯草果穗迷迭香酸含量也不一致，廣西省賀州市迷迭香酸含量為3.3%，明顯高于其他產區，浙江省麗水市迷迭香酸含量較低，只有1.0%(表2)。

表2 不同產地夏枯草的主要化學成分含量

2.2主成分分析

主成分分析結果表明，夏枯草果穗主要成分是多糖，多糖特征值為1.94，方差累積貢獻率為64.69%。其中，廣西省賀州市得分最高，多糖含量為12.49%。按照藥典的規定，質量最優的也是廣西省賀州市，迷迭香酸含量達到3.3%，明顯高于其他產區。由此可以得出，在對夏枯草進行質量評價時，可以結合多糖含量(表3)。

表3 主成分分析解釋

注：提取方法：主成分分析

2.3聚類分析

聚類分析表明，陜西省漢陰縣和貴州省甕安縣是單獨的；廣西省賀州市和廣東省連南縣聚為一類；湖北省廣水縣、浙江省麗水市、河南省舞鋼市、福建省寧化縣、湖南省張家界聚為一類。地理位置相近的聚為一類，證明夏枯草果穗中化學成分含量和生態環境有關，包括氣候、土壤、日照、地形等因子；同時也和采收期等其他因素有關(圖1)。

圖1 不同產地夏枯草聚類分析圖

3 討論

本研究認為不同產地的夏枯草多糖、總黃酮和迷迭香酸含量存在明顯差異，是由于地理位置、光照、氣候、海拔、采收期等[10-11]多種因素的影響。通過聚類分析表明，陜西省漢陰縣和貴州省甕安縣是單獨的；廣西省賀州市和廣東省連南縣聚為一類；湖北省廣水縣、浙江省麗水市、河南省舞鋼市、福建省寧化縣、湖南省張家界聚為一類。地理位置相近的聚為一類，這與前人的研究具有一致性[12]。依據中國藥典的規定，試驗中9個產地夏枯草質量最優是廣西省賀州市；如果參考夏枯草多糖的含量，質量最優的也是廣西省賀州市。研究[13]證明，夏枯草各成分間的結構比與藥效緊密相關，所以單一的化學成分含量不足以證明該中草藥的藥用價值。對一種中草藥的藥用價值進行評價時，應結合該種中草藥的幾種主要化學成分進行綜合分析。不同研究[14-18]表明，多糖有較好的抗氧化、免疫和抗癌細胞增殖作用，夏枯草多糖的結構和組成的差異可能與夏枯草的產地、物種類別和分離純化方法等差異有關。

綜上所述，本研究認為在對夏枯草藥材質量進行評價時，應在考慮主要成分迷迭香酸含量的同時，再結合多糖的含量進行評價。

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ComparisonandAnalysisoftheMainChemicalComponentsofPrunellaVulgarisL.CollectedfromNineDifferentPlaces

XuRui1,ZhangXuerong2,GuoQiaosheng2Δ,LiuLi2,ZhaoMiao1,QinQin1,ChenYuhang1,2△.
1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.InstituteofChineseMedicinalMaterials,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210059,China

Objective To determine the main chemical components of the Prunella vulgaris L. collected from nine different places and carry out the principal component analysis and cluster analysis.MethodsThe polysaccharides and total flavonoids of Prunella vulgaris L. were determined by spectrophotometer and the rosmarinic acid was determined by HPLC.ResultsThe content of polysaccharides, total flavonoids and rosmarinic acid in the Prunella vulgaris L. collected from nine different places was 6.81%～12.49%, 3.29%～5.82%, and 1.0%-3.3% respectively. The polysaccharides proved to be the main chemical component of Prunella vulgaris L. The results of clustering analysis showed that the Prunella vulgaris L. with geographical proximity could be clustered together.ConclusionThere are significant differences among the Prunella vulgaris L. collected from nine different places in the main chemical components, so it is suggested that the content of Prunella vulgaris L. should be considered in the quality the quality evaluation of Prunella vulgaris L.

Prunella vulgaris L.; Polysaccharides; Total flavonoids; Rosmarinic acid; Principal component analysis; Cluster analysis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170525.1148.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.005

R282.71

A

國家自然科學基金項目(No:31500263；30772730；81072986); 國家中醫藥管理局中醫藥行業科研專項(No:201507002)；中國博士后科學基金(No:2014M560726；2016T90869)；國家級大學生創業項目(No:201413705026)；成都醫學院大學生創新實驗項目(No:CXXS201417)

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郭巧生, E-mail：gqs@njau.edu.cn；陳宇航，E-mail：chenyuhang221@126.com