PI3K—Akt—eNOS信號通路在間歇性低氧減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的作用

王媛媛　　曹建　　萬建華

[摘要] 目的 探討間隙性低氧環境下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶信號通路（PI3K-Akt-eNOS）在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的作用機制。 方法 64只大鼠隨機分為4組，假手術組（n=16）、缺血/再灌注組（n=16）、缺血/再灌注組-間歇性低氧組（n=16）、間歇性低氧-缺血/再灌注-磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑組（n=16）。采用球囊結扎冠狀動脈方法制作心肌缺血再灌注動物模型，將老鼠暴露在低氧循環制作間隙性低氧動物模型，實驗處理結束后，通過TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡指數，Western-Blot方法檢測磷酸化AKT蛋白（p-Akt）、磷酸化eNOS（p-eNOS）蛋白表達。 結果 與缺血/再灌注組比較，間歇性低氧+缺血/再灌注組心肌細胞凋亡指數為（21.73±4.56）%，心肌細胞凋亡指數減少，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白分別為（1.228±0.269）、（1.427±0.375），表達均升高，各組差異均有統計學意義（P<0.05）；與間歇性低氧+缺血/再灌注組比較，間歇性低氧-缺血/再灌注組大鼠+磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑組大鼠心肌為（30.84±3.65），凋亡指數升高，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白分別為（0.624±0.146）、（0.842±0.246），表達均降低，各組差異均有統計學意義（P<0.05）。 結論 在間歇性低氧狀態下，PI3K-Akt-eNOS信號通路可以減少心肌細胞凋亡，在心肌缺血/再灌注損傷中具有保護機制。

[關鍵詞] 磷酯酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶；間歇性低氧；心肌缺血/再灌注

[中圖分類號] R541 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）27-0035-03

Effect of PI3K-Akt-eNOS signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 WAN Jianhua3

1.Department of Cardiology， Nanchang Third Hospital， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， Nanchang University Second Affiliated Hospital， Nanchang 330001， China； 3.Department of Anesthesiology， Jingdezhen Hospital of TCM in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS） signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats. Methods 64 rats were randomly divided into 4 groups： sham operation group（n=16）， ischemia-reperfusion group（n=16）， ischemia-reperfusion-intermittent hypoxia group（n=16）， intermittent hypoxia-ischemia-reperfusion-phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group（n=16）. The animal model of myocardial ischemia and reperfusion was established by balloon ligation of coronary artery. The rats were exposed to hypoxic circulation to produce intermittent hypoxic animal models. After the end of the experiment， the apoptotic index of myocardial cells was detected by TUNEL method， and the expression of phosphorylated Akt protein （p-Akt） and phosphorylated eNOS （p-eNOS） protein was detected by Western-Blot method. Results Compared with ischemia-reperfusion group， the apoptotic index of myocardial cells was（21.73±4.56）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group. The myocardial cell apoptosis index was decreased， and phosphorylated Akt protein and phosphorylated eNOS protein were（1.228±0.269）， （1.427±0.375） respectively. The expressions were all increased， and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）； compared with intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group， the myocardium of rats was（30.84±3.65）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group+phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group. The apoptosis index was increased， and the phosphorylated AKt protein and phosphorylated eNOS protein were（0.624±0.146）， （0.842±0.246） respectively. The expressions were all decreased and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Under the status of intermittent hypoxia， PI3K-Akt-eNOS signaling pathway can reduce myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing the apoptosis of myocardial cells.endprint

[Key words] Phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS）； Intermittent hypoxia； Myocardial ischemia-reperfusion

缺血的心肌再灌注時會起一系列心臟及其血管的惡性事件，例如嚴重的再灌注心律失常、組織水平無復流及心肌舒縮功能障礙等不良事件。對急性心肌梗死預后有直接影響的就是心肌缺血/再灌注損傷。缺血/再灌注損傷發生可能與炎性反應、細胞凋亡、氧反常、鈣反常、pH 反常等原因有密切關系[1-3]，尋求再灌注治療時保護心肌的新靶點至關重要。目前研究表明，間歇性低氧對心肌缺血/再灌注損傷有保護作用，可以通過增加心臟對缺血、缺氧的耐受性來達到心臟保護的目的，在抗心肌缺血/再灌注損傷中發揮重要作用。本實驗擬討論在間歇性低氧狀態下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信號通路在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

本實驗已通過南昌大學醫學院動物倫理委員會審查，許可證號[SCXK（贛）2009-0001]。選取8～10周健康清潔級SD大鼠64只，雌雄各半，體重（200±20）g，由南昌大學動物實驗中心提供。磷酯酰肌醇-3激酶抑制劑（Wortmannin）渥曼青霉素購自天津藥業焦作有限公司，Tunel 凋亡試劑檢測盒購自德國Roche公司；小鼠p-eNOSp-Akt單克隆抗體、p-Akt抗體購自美國Santa Cruz公司；蛋白濃度測定標準品購自普利萊公司；兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Sigma公司。

1.2 實驗分組及模型建立

64只實驗動物隨機分為4組，制作大鼠缺血/再灌注損傷模型，實驗前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，通過氣管插管、人工呼吸，然后開胸結扎冠脈左前降支，收緊結扎線，30 min 后輕拉松結線，擴開血管，縫合[4]。通過低氧循環制作大鼠間歇性低氧模型：每日4次在低氧氧艙分別接受減壓低氧處理，每次接受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再行氧和處理，循環5次，在低氧氧艙進行間歇性低氧處理14 d，對照組選取含氧量正常的老鼠。假手術組（n=16），選取尾靜脈注射生理鹽水，絲線穿過冠狀動脈左室支，不結扎；缺血/再灌注組（對照組，I/R）（n=16），制作大鼠缺血/再灌注模型。間歇性低氧+缺血/再灌注組（n=16，IH+I/R）：建立間歇性低氧動物模型后，制作缺血/再灌注損傷模型；間歇性低氧+缺血/再灌注+PI3K抑制劑組（n=16，IH+I/R+PI3K抑制劑），建立間歇性低氧模型，制作缺血/再灌注模型時，在冠狀動脈左前降支閉塞15 min前注射磷脂酰肌醇酯3激酶抑制劑（渥曼青霉素）（24 μg/kg，ip）。

1.3 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡

依據試劑盒說明書操作，檢測各實驗組心肌細胞凋亡指數。使用標記液做陰性對照，陽性對照選取脫氧核糖核酸酶處理切片。隨機在每張切片上選取10 個視野，計數凋亡細胞個數。心肌細胞凋亡指數=凋亡細胞個數/所有細胞個數的百分比。

1.4 通過Western blot法檢測p-eNOS、p-Akt蛋白表達

動物模型制備結束后，處死存活大鼠。選取各組缺血區左心室全層心肌組織約20 mg，添加蛋白裂解液，隨后按步驟勻漿、裂解、提取總蛋白。各組提取蛋白樣品，先通過SDS-PAGE電泳轉膜，室溫下5%封閉2 h，再與稀釋的Actin抗體、p-Akt、p-eNOS在4℃孵育過夜（稀釋比例為1∶1000）。洗膜后孵育2 h（稀釋比例為1∶3000）；再次洗膜，通過電化學發光顯色曝光、拍照。以Actin作為內對照，通過BIORAD 軟件分析蛋白條帶。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各實驗組心肌細胞凋亡指數

TUNEL 試劑盒檢測心肌細胞凋亡指數，與假手術組比較，缺血/再灌注組可見較多TUNEL陽性凋亡細胞，凋亡指數明顯升高（38.46±0.82）%；間歇性低氧處理后，心肌凋亡細胞明顯減少、心肌細胞凋亡指數下降（21.73±4.56）%；間歇性低氧+缺血/再灌注組+ PI3K抑制劑（渥曼青霉素）組處理后，凋亡指數增加（29.84±3.65）%，各實驗組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1及表2。

2.2心肌組織p-Akt、p-eNOS蛋白水平表達

Western blot 法檢測各實驗組Akt、p-eNOS蛋白表達，與假手術組比較，p-Akt、p-eNOS表達升高（P<0.05）；與IH+I/R組比較，IH+I/R+PI3K抑制劑組p-Akt、p-eNOS蛋白表達下降（P<0.05）。見表1、表2及封三圖4。

3 討論

目前缺血性心臟病的發病率位于原發性心臟病之首，其中心肌缺血再灌注損傷約占50%，是冠狀動脈內溶栓、冠脈搭橋以及介入治療中常見的嚴重并發癥[4-6]，如何減少心肌缺血/再灌注損傷已成為心肌保護的研究建立熱點之一。低氧是心肌缺血的主要因素，基礎和臨床醫學研究所關注的熱點是如何通過增加心臟對低/缺氧及對缺血耐受性而達到保護心臟的目的。研究認為通過長期（如慢性低氧適應）或短期缺血預適應可以對心臟缺血出現保護作用[7]。但是對于相關信號通路、受體途徑以及信號轉導等深層次的作用機制研究較少。

蘇氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸（PI3K-Akt）可以抑制細胞凋亡，參與細胞增殖分化，是細胞生存的一種重要信號通路之一，在心肌缺血再灌注損傷機制中發揮重要作用。PI3K活化底物PI-3，4，5- P3（PIP3）與Akt結合，Akt被磷酸化而激活生成P-Akt，磷酸化的Akt具有抗凋亡、促細胞生存及促蛋白合成及等活性[8-10]。eNOS是合成NO的限速酶，含1203個氨基酸，其分子量為133 kDa，是由位于人類 7號染色體7q35～7q36的NOS3基因編碼的蛋白，是p-Akt下游的重要底物之一，可激活蛋白激酶及線粒體ATP敏感性鉀離子通道，通過抑制線粒體通透性轉換孔的開放，降低線粒體膜通透性。還通過抑制鈣超載，同時抑制線粒體釋放下游Caspase-9等凋亡因子的表達，改善線粒體功能，并促進Bcl-2等抗凋亡因子的表達，減少細胞凋亡[11-13]。同時eNOS是Akt下游的重要底物之一，有研究者認為Akt磷酸化位點激活，是一氧化氮的重要來源，一氧化氮在血管舒張、血管重構及生成及創傷愈合等方面發揮作用。在缺氧情況下，NO可通過磷脂酰肌醇3激酶或絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK） 信號通路誘導HIF-1產生，促進新生血管，干擾代謝性適應反應以重新適應缺血的生理環境[14]。還發現eNOS源性的一氧化氮可以減輕血小板和白細胞和血小板在細胞壁的粘附，減少細胞凋亡[15]。eNOS的高表達可參與血流的調節，減少炎性細胞的浸潤及抑制血管痙攣、防止細胞內鈣超載等再灌注損傷。endprint

本實驗建立了缺血/再灌注損傷及間歇性低氧模型，實驗發現通過間歇性低氧預處理，PI3K-Akt信號途徑激活，心肌細胞凋亡降低，p-Akt及eNOS蛋白表達增加。在使用PI3K抑制劑后，心肌細胞凋亡指數增加，-Akt及eNOS蛋白表達降低。實驗結果提示間歇性低氧處理后，激活PI3K-Akt信號途徑被激活，p-AKt表達增加，與此同時下游底物eNOS蛋白表達增加，減輕心肌細胞凋亡，這一效應可被PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素拮抗，提示在間歇性低氧狀態下，通過激活PI3K/Akt信號通路，激活P-Akt及活化內皮型一氧化氮合酶，這些下游底物可能通過提高抗凋亡蛋白表達，抑制促凋亡蛋白等機制降低心肌細胞凋亡率，從而在缺血/再灌注損傷中起到保護作用。

[參考文獻]

[1] Castedo E，Segovia J. Ischemia-Reperfusion Injury During Experimental Heart Transplantation. Evaluation of Trimetazidine's Cytoprotective Effect[J].Rev Esp Cardiol，2005，58（8）：941-950.

[2] Ruiz-Meana M，García-Dorado D.Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury：new therapeutic options for acute myocardial infarction[J].Rev Esp Cardiol，2009，62（2）：199-209.

[3] Lishmanov YB，Naryzhnaya NV，Maslov LN. Functional state of myocardial mitochondria in ischemia reperfusion of the heart in rats adapted to hypoxia[J].Bull Exp Biol Med，2014，156（5）：645-658.

[4] 趙秀梅，孫勝，劉秀華.墊扎球囊法復制大鼠在體心肌缺血/再灌注模型[J].中國微循環，2006，11（3）：206-208.

[5] Lu S. Heart protective effects and mechanism of quercetin preconditioning on anti-myocardial ischemia reperfusion（IR） injuries in rats[J].Gene，2014，4（22）：162-171.

[6] Meng XY，Yu HL，Zhang WC，et al. ZFP580，a Novel Zinc-Finger Transcription Factor，Is Involved in Cardioprotection of Intermittent High-Altitude Hypoxia against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury[J].PLoS One，2014，10（4）：231-237.

[7] Manukhina EB，Belkina LM，Terekhina OL，et al. Normobaric，intermittent hypoxia conditioning is cardio-and vasoprotective in rats[J].Exp Biol Med，2013，238（12）：1413-1420.

[8] Fulda S. Mitochondrion.Synthetic lethality by co-targeting mitochondrial apoptosis and PI3K/Akt/mTOR signaling[J].Mitochon drion，2014，4（26）：262-173.

[9] Mathew S， Sundararaj S，Mamiya H，et al.Regulatory interactions maintaining self-renewal of human embryonic stem cells as revealed through a systems analysis of PI3K/AKT pathway[J].Bioinformatics，2014，2（28）：421-523.

[10] Shin JM，Kim MY， Sohn KC，et al.Nrf2 Negatively Regulates Melanogenesis by Modulating PI3K/Akt Signaling[J].PLoS One，2014，9（4）：524-531.

[11] Yang XM，Krieg T，Cui L，et al. NECA and bradykinin at reperifusion reduce infarction in rabbit hearts by signaling through PI3K，ERK，and NO[J]. J Mol Cell Cardiol，2004，36：411-421.

[12] Huang JJ，Shi YQ，Li RL，et al.Angiogenesis effect of therapeutic ultrasound on HUVECs through activation of the PI3K-Akt-eNOS signal pathway[J].Am J Transl Res，2015，7：1106-1115.

[13] He F，Xu BL，Chen C，et al. Methylophiopogonanone A suppresses ischemia/reperfusion-induced myocardial apoptosis in mice via activating PI3K/Akt/eNOS signaling pathway[J].Acta Pharmacol Sin，2016，37（6）：763.

[14] Yinfeng Kang，Runyu Yuan.Transient activation of the PI13K/Akt pathway promotes Newcastle disease virus replication and enhances anti-apoptotic signaling responses[J].Oncotarget，2017，8（14）：23551-23563.

[15] Xubo Chen，Xueyan Zhao.The role of sodium hydrosulfide in attenuating the aging process via PI3K/AKT and CaMKK/AMPK pathways[J]. Redox Bilol，2017，12：987-1003.

（收稿日期：2017-06-15）endprint