普通小麥Trx59基因的克隆及功能驗證

張鵬鈺，袁 珍，王國瑞，王同朝，尹 鈞，3，衛 麗，3，劉毓俠

(1.河南糧食作物協同創新中心，河南 鄭州 450002；2.河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450002；3.國家小麥工程技術研究中心，河南 鄭州 450002；4.河南省農業科學院，河南 鄭州 450002)

普通小麥Trx59基因的克隆及功能驗證

張鵬鈺1，2，袁 珍2，王國瑞2，王同朝1，2，尹 鈞2，3，衛 麗2，3，劉毓俠4

(1.河南糧食作物協同創新中心，河南 鄭州 450002；2.河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450002；3.國家小麥工程技術研究中心，河南 鄭州 450002；4.河南省農業科學院，河南 鄭州 450002)

為進一步挖掘小麥春化相關基因，探明小麥春化發育調控機制，從不同春化發育特性小麥品種春化響應轉錄組高通量測序結果中篩選并克隆到1個EST序列，命名為Trx59，該基因的開放閱讀框為372 bp，編碼124個氨基酸，保守結構域分析顯示，Trx59基因有1個Thioredoxin結構域。利用qRT-PCR分析了在春化處理過程中Trx59基因在不同春化發育特性小麥品種的表達特性，并利用VIGS技術進行基因功能的初步驗證。結果表明：隨著春化處理時間的延長，Trx59基因的表達量逐漸升高，從表達量和表達時間來看，Trx59基因的表達量和表達時間表現為春性品種高于且早于冬性品種。構建BSMV：Trx59重組載體并接種于小麥植株，14 d后出現明顯的光漂白現象，Trx59基因的表達水平急劇降低，說明Trx59基因已被顯著抑制；BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化明顯晚于陰性對照組，初步判斷Trx59基因與小麥發育有關。

小麥；春化；表達分析；病毒誘導的基因沉默；功能驗證

硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類高度保守的低分子量蛋白。自Andersen等[1-2]在大腸桿菌中發現硫氧還蛋白作為核苷酸還原酶的氫供體以來，人們相繼在動、植物中發現硫氧還蛋白并對其功能進行了諸多研究。硫氧還蛋白擁有多種生物學功能，其中包括參與調節細胞生長、基因轉錄等，對維持體內穩定的氧化還原狀態起著十分重要的作用[3-4]。有研究認為，Trxh在谷物種子萌發過程中起非常重要的作用。任江萍等[5-6]通過基因槍法將反義Trxs基因導入普通小麥中，發現在種子萌發過程中轉Trxs基因小麥植株的Trxh活性明顯低于對照，脫支酶活性也低于對照從而增強小麥抗穗發芽的能力。反義Trxs基因對小麥籽粒淀粉積累也有一定的正效應，轉基因株系的總淀粉和支鏈淀粉的積累速率較對照顯著提高[7]。硫氧還蛋白通過還原儲藏蛋白和其他胚乳蛋白分子內部的二硫鍵進而增加儲藏蛋白對水解作用的敏感性，同時還直接或間接通過抑制蛋白抑制因子來改變酶的活性[8-10]。任江萍和Guo等[11-12]報道，轉反義Trxs基因小麥植株在種子發芽過程中谷蛋白降解速度明顯慢于對照植株。Trx與植物抗逆性也密切相關，如抗旱、耐熱、抗氧化和低溫等脅迫。干旱誘導產生的硫氧還蛋白CDSP32，通過保護葉綠體的結構來對抗由干旱引起的氧化脅迫[13]。夏德習等[14]報道，轉硫氧還蛋白M1 型基因能夠增強植物對逆境的耐受力，尤其是氧化脅迫。在低溫脅迫下，水稻中的Trx23被誘導表達從而抑制了MPK3和MPK6的活性[15]。

普通小麥是我國麥類作物的主要栽培種，其發育特性決定了小麥的種植區域[16-17]。本研究從不同春化發育特性小麥品種遼春10和京841春化響應轉錄組Illumina高通量測序結果中，篩選到1個Unigene59候選基因，經生物學信息分析該基因含有1個Thioredoxin結構域，暫命名為Trx59。本研究系統分析了該基因在不同發育特性小麥品種中的表達特性；并利用VIGS的方法進行基因初步功能驗證，以期為研究硫氧還蛋白在低溫脅迫下的作用提供依據。

1 材料和方法

1.1試驗材料及處理方法

本試驗所用小麥品種為春性品種遼春10號(LC10)和冬性品種京841(J841)，均由國家小麥工程技術研究中心提供。

春化材料處理方法：挑取籽粒飽滿且大小均一的遼春10號和京841小麥種子，用75%酒精浸泡30 s，重復1次，用蒸餾水浸泡5 min，置于黑暗處25 ℃浸泡12 h，待種子萌動后腹溝朝下置于培養皿中放入4 ℃的春化箱中進行低溫處理，分別于春化處理7，14，21，28，35，42，49 d后取小麥葉片，液氮速凍后-80 ℃保存。

BSMV病毒沉默材料處理方法：挑選籽粒飽滿且大小均一的京841種子，種子消毒處理同春化材料處理方法，待種子萌動出芽1～2 cm后移植萌動沙土∶草炭土=1∶1的花盆中，并放入光照培養箱中培養(25 ℃/18 ℃、16 h光照/8 h黑暗、光照強度350 μmol/(m2·s)，當小麥長至兩葉一心時，挑選長勢一致的小麥植株進行大麥花葉條紋病毒(BSMV)的接種。

1.2總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取上述保存葉片在液氮中細研，采用TRIzol試劑(Invitrogen)提取葉片總RNA。參照反轉錄試劑盒PrimerScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的操作說明進行cDNA第一鏈的合成。

1.3目的基因克隆

分別以J841和LC10的cDNA為模板，Trx59-F1和Trx59-R1為引物(表1)，進行PCR擴增。反應體系25 μL，包含LATaq(5 U/μL)0.2 μL、2×GC BufferⅡ 2 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L) 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA模板1 μL，用ddH2O補齊至25 μL。PCR反應程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃10 min，4 ℃保存。將PCR擴增產物回收純化后，連接至pMD18-T載體后轉化DH5α，經菌液PCR檢測挑取陽性單克隆，送往北京華大基因有限公司測序。

1.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

將不同春化處理7～49 d所取的遼春10號和京 841 的葉片混合后提取RNA，以反轉錄的cDNA為模板，Trx59-F2和Trx59-R2為引物(表1)進行實時熒光定量 PCR 分析，參照TaKaRa熒光定量PCR SYBR?Green Ⅰ試劑盒說明書進行操作。反應在 Bio-red CFX96 熒光定量 PCR 儀上運行，PCR反應體系為 20 μL，反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個循環；95 ℃ 15 s。以小麥的β-Actin基因為內參基因，每個樣品設3 個重復，采用2-ΔΔCt法進行定量分析。

1.5BSMV病毒沉默載體的構建及接種

1.5.1 BSMV病毒沉默載體的構建 選取J841 的cDNA作為模板，用表1中的引物對Trx59-F3和Trx59-R3擴增出Trx59的cDNA編碼區全長，連入pMD18-T載體后轉化至DH5α，挑取陽性單克隆，經 PCR 檢測為陽性后測序鑒定。測序正確的菌液提取質粒，用NheⅠ 酶切BSMV-Trx59-pMD18-T質粒得到目的片段以及BSMV-γ：GFP載體。然后將目的片段與經NheⅠ酶切后的BSMV-γ：GFP載體大片段連接，轉化至大腸桿菌DH5α，挑取白色菌斑置于 37 ℃搖菌，提取質粒酶切檢測，選取陽性克隆測序驗證。將BSMV-α、BSMV-γ和BSMV-γ重組質粒用MluⅠ進行線性化、BSMV-β載體用SpeⅠ限制性內切酶進行線性化及回收純化。純化后的BSMV線性化產物，用Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7和Ribo m7G Cap Analog的試劑盒進行體外轉錄，以試劑盒中線性化的DNA template為陽性對照。反應結束后，每個體系取2.5 μL體外轉錄產物進行1%的凝膠電泳檢測。

1.5.2 BSMV病毒接種 取BSMV-α 45 μL，BSMV-β 45 μL，BSMV-γ/重組載體45 μL，2×GKP Buffer 135 μL，混合均勻用于病毒接種。接種液摩擦接種于第2葉片，每株5～10 μL，接種完畢后噴施少量0.1% DEPC水以保持濕潤，用保鮮膜覆蓋3 d，置于光照培養箱(25 ℃/18 ℃、16 h光照/8 h黑暗、光照強度350 μmol/(m2·s)中。BSMV病毒接種3 d后，揭開保鮮膜，定期澆水，觀察接種后小麥植株的表型，并于接種7 d開始每周取新生葉片直至第49天，提取總RNA，用于轉錄水平的檢測。

表1 基因克隆和載體構建引物Tab.1 The primers for gene cloning and vector construction

注：引物序列中下劃線標注部分為引入的酶切位點序列。

Note：The underline part in primer sequence is the enzyme loci.

2 結果與分析

2.1Trx59基因的克隆及序列分析

以LC10和J841的cDNA為模板，Trx59-F1和Trx59-R1為引物擴增均得到長度為718 bp的片段，與預期產物大小一致(圖1)。將PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒進行回收，連接至pMD19-T載體后轉化至大腸桿菌DH5α，提取質粒進行測序，結果表明，PCR產物與轉錄組測序結果一致，且J841和LC10的擴增測序結果完全一致。Trx59基因的ORF為372 bp，編碼124個氨基酸，保守結構域分析顯示，Trx59基因有1個Thioredoxin結構域，屬于Thioredoxin家族。

1.J841；2.LC10；M.DL2000。

2.2Trx59基因編碼氨基酸的同源序列及進化樹分析

運行NCBI軟件進行同源序列比對，搜索出多條與Trx59同源的氨基酸序列，用DNAMAN軟件對不同物種的氨基酸序列進行分析，發現所有參比序列均含有1個Thioredoxin結構域，Trx59基因編碼的氨基酸序列長度與其他物種Thioredoxin結構域序列長度相近，該結構域在序列上非常保守。Trx59基因編碼的氨基酸序列與烏拉圖小麥、山羊草、大麥、甘蔗、番薯、三葉草氨基酸序列同源性分別達59.0%，56.6%，50.7%，30.0%，29.0%，26.3%(圖2)。

運用MEGA5.1軟件對這些序列構建遺傳進化樹，分析不同物種Trx蛋白的進化關系。結果如圖3所示，Trx59與烏拉圖小麥和山羊草的Trx蛋白親緣關系最近，其次是大麥，和三葉草、柑橘、菜豆Trx蛋白親緣關系相對較遠。

2.3Trx59基因在不同春化發育特性小麥品種中的表達特性分析

春化處理過程中，Trx59基因在不同春化發育特性小麥品種中均呈拋物線型趨勢(圖4)。春化處理第14天，Trx59基因在春性品種LC10中表達量急劇升高，于春化42 d時達到峰值，隨后表達量下降；Trx59基因在冬性品種J841中表達量緩慢增加，從第35天時表達量急劇升高，于第49天達到最大值，但其表達量仍低于春性品種LC10。從表達量和表達時間來看，Trx59基因的表達在春性品種要高于且早于冬性品種。

圖2 Trx59基因編碼的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列比對Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences of Trx59 with other species

圖3 Trx59遺傳進化分析Fig.3 A phylogenetic tree analysis of Trx59 with other species

2.4BSMV病毒接種后表型變化及基因表達特性分析

J841小麥植株長到兩葉一心時進行BSMV病毒接種，BSMV：Trx59病毒接種后7 d小麥植株第2葉片出現微弱的病毒癥狀和光漂白現象；接種14 d后，第2葉片光漂白現象明顯且進一步擴大，新生出的第3片葉出現白斑，說明病毒已成功侵染小麥植株(圖5)。病毒接種21 d后，陰性對照組BSMV：00出現微弱的光漂白現象，BSMV：Trx59接種的小麥植株第2片葉子已完全白化，第3片葉子白化癥狀非常明顯，新生的第4片葉也出現了微弱的失綠表型。BSMV：Trx59病毒接種后第35天，光漂白癥狀逐漸消失，新生葉片正常生長。

圖4 春化處理過程中Trx59基因在LC10和J841中的表達特性分析Fig.4 Relative expression analysis of Trx59 gene in LC10 and J841 under vernalization treatment

圖5 BSMV：Trx59接種14 d后小麥植株葉片表型的變化Fig.5 Changes of leaf phenotypes after BSMV：00 and BSMV： Trx59 inoculation at 14 days

BSMV病毒接種后每周挑取生長良好、病毒表型明顯的小麥植株葉片，提取總RNA并反轉錄成cDNA，檢測BSMV：Trx59轉錄本水平表達量變化。定量結果顯示：在BSMV病毒接種第7天時，Trx59基因的表達水平急劇降低，約為對照的0.7倍，隨著BSMV病毒接種時間的延長，Trx59基因的表達量繼續降低；在BSMV病毒接種后第21天，Trx59基因表

達量最低，為對照的36%，說明Trx59基因已被顯著抑制(圖6)。

圖6 BSMV：Trx59病毒接種后Trx59基因表達特性分析Fig.6 Expression analysis of Trx59 genes after the inoculation of BSMV：Trx59 recombinant vector

2.5BSMV-VIGS植株幼穗分化進程分析

小麥幼穗分化受多種因素如品種、光照、溫度等的影響。目前人們普遍認為二棱期是小麥通過春化作用的重要指標[18]。BSMV：00和BSMV：Trx59病毒接種14 d后，小麥植株的幼穗分化均處于單棱期；病毒接種21 d后，BSMV：00接種的小麥植株幼穗分化開始進入二棱初期，BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化仍處于單棱期。BSMV：00接種的小麥植株在病毒接種28 d后穗分化進入二棱中期，而BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化剛剛進入二棱初期，明顯晚于陰性對照組(表2)。

表2 接種BSMV病毒對小麥幼穗分化的影響Tab.2 Effect of BSMV virus inoculation on spike differentiation process of wheat

3 結論與討論

硫氧還蛋白廣泛存在于生物體內，參與多個生化代謝過程。盡管其有一個保守的活性中心CXXC，但也有不含該基序的蛋白，稱為TRX類似蛋白。本研究克隆的Trx59基因不含有CXXC，應歸屬于TRX類似蛋白。該基因編碼124個氨基酸，結構域分析結果顯示：該基因有1個Thioredoxin結構域，序列分析表明，不同發育特性小麥品種中該基因序列高度保守，且該基因沒有內含子。進化分析結果顯示，該基因與烏拉圖小麥和山羊草的Trx蛋白親緣關系最近。

據報道，在各種生物和非生物脅迫下，硫氧還蛋白均被誘導表達。He等[19]發現，馬鈴薯中的TRXh1基因在4 ℃低溫脅迫下表達量升高，從轉錄水平上調控馬鈴薯塊莖的糖含量。本研究中，Trx59基因在春化處理過程中在不同春化發育特性品種中均呈上調表達趨勢，且春性品種早于冬性品種，說明Trx59基因受低溫脅迫而被誘導表達，與Xie等[15]和Kocsy等[20]的研究結果一致。

VIGS作為新出現的功能基因組學研究方法，它是利用反向遺傳學研究基因的功能，克服了傳統功能基因組學研究方法的局限性，操作簡單，試驗周期短，能夠在短時間內產生一個失去目標基因功能的表型，從而進行基因功能驗證，所有工作都在一代植物中完成，不需要復雜的突變體篩選，不需要遺傳轉化，大大降低了成本和勞動強度，而且VIGS能瞬時沉默幼苗或成熟植株靶基因，即使是具有突變致死效應或與生長發育緊密相關的基因，也可用VIGS技術來鑒定功能[21-22]。本研究中采用VIGS方法將Trx59基因沉默后，植株葉片出現白色條紋狀帶，與空載相比，基因表達量明顯降低，進一步說明該基因被沉默。從穗分化進程來看，BSMV：Trx59接種的小麥植株穗分化明顯慢于空載，說明Trx59基因沉默后，小麥幼穗分化進程受到抑制，由此可以初步判斷Trx59基因與小麥春化發育有關，還需要進行進一步驗證。

[1] Andersen J K. Oxidative stress in neurode generation：cause or consequence[J].Nat Med，2004，10 (S1)：18-25.

[2] Lillig C H，Holmgren A. Thioredoxin and related molecules-from biology to health and disease[J]. Antioxidants & Redox Signaling，2007，9(1)：25-47.

[3] Lu J, Holmgren A.The thioredoxin superfamily in oxidative protein folding[J].Antioxidants & Redox Signaling,2014,27(3):457-470.

[4] Jortzik E, Becker K.Thioredoxin and glutathione systems inPlasmodiumfalciparum[J].International Journalof Medical Microbiology, 2012, 302(4-5):187-194.

[5] 任江萍，王振云，王新國，等. 反義trxs基因導入對小麥籽粒脫支酶活性的影響[J]. 西北植物學報，2007，27(5)：926-930.

[6] 任江萍，尹 鈞，牛洪斌，等. 反義trxs基因對轉基因小麥種子內源trxh基因表達的影[J]. 植物生理與分子生物學學報，2007，33(4)：325-332.

[7] 任江萍，王亞英，王新國，等. 反義trxs基因導入對弱筋小麥豫麥18淀粉積累及淀粉合成酶表達的影響[J]. 作物學報，2013，39(10)：1856-1863.

[8] Zhou C H, Bian M, Liao H, et al. Identification and immunological characterization of thioredoxin transmembrane-related protein fromClonorchissinensis[J].Parasitology Research, 2013, 112(4):1729-1736.

[9] Wang F B, Kong W L, Niu Y, et al.StTrxF, a potato plastidic thioredoxin F-type protein gene, is involved in starch accumulation in transgenicArabidopsisthaliana[J].Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2017, 31(3):486-492.

[10] Li Y B, Han L B, Wang H Y, et al. The thioredoxin GbNRX1 plays a crucial role in homeostasis of apoplastic reactive oxygen species in response toVerticilliumdahliaeInfection in Cotton [J]. Plant Physiology, 2016, 170(4):2392-2406.

[11] 任江萍，李 磊，王新國，等. 反義TrxS基因在小麥中的表達及對小麥種子蛋白酶活性和蛋白組分的影響[J]. 麥類作物學報，2008，28(6)：941-945.

[12] Guo H X，Yin J，Ren J P，et al. Changes in proteins within germinating seeds of transgenic wheat with an antisense construct directed against the thioredoxin[J]. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2007，33(1)：18-24.

[13] Sahrawy M，Hecht V，Lopez-Jaramillo J，et al. Intron position as an evolutionary marker of thioredoxins and thioredoxin domains[J]. Journal of Molecular Evolution，1996，42(4)：422-431.

[14] 夏德習，管清杰，金淑梅，等. 擬南芥硫氧還蛋白M1型基因(AtTRXm1)與環境逆境之間的關系[J]. 分子植物育種，2007，5(1)：21-26.

[15] Xie G S，Kato H，Sasaki K，et al. A cold-induced thioredoxin h of rice，OsTrx23，negatively regulates kinase activities of OsMPK3 and OsMPK6invitro[J].FEBS Letters，2009，583(17)：2734-2738.

[16] 尹 鈞. 小麥溫光發育研究進展I.春化和光周期發育規律[J]. 麥類作物學報, 2016，36(6): 681-688.

[17] 王 翔. 小麥溫光反應的分子生物學研究[D]. 北京: 中國農業科學院, 2014.

[18] Jin FF, Wei L. The expression patterns of threeVRNgenes in common wheat (TriticumaestivumL.) in response to vernalization [J]. Cereal Research Communications, 2016, 44(1):1-12.

[19] He T J, Song B T, Liu J,et al.A new isoform of thioredoxin h group in potato, SbTRXh1, regulates cold-induced sweetening of potato tubers by adjusting sucrose content [J]. Plant Cell Reports, 2012, 31(8):1463-1471.

[20] Kocsy G，Kobrehel K，Szalai G，et al. Abiotic stress-induced changes in glutathione and thioredoxin h levels in maize[J]. Environmental and Experimental Botany，2004，52(2)：101-112.

[21] Panwar V, Bakkeren G.Investigating gene function in cereal rust fungi by plant-mediated virus-induced gene silencing [J]. Methods in molecular biology, 2017, 1659:115-124.

[22] Bilichak A，Kovalchuk I.Increasing a stable transformation efficiency ofArabidopsisby manipulating the endogenous gene expression using virus-induced gene silencing[J]. Methods MolBiol, 2017, 1456:225-236.

CloningandFunctionalVerificationofTrx59GeneinCommonWheat

ZHANG Pengyu1，2，YUAN Zhen2，WANG Guorui2，WANG Tongchao1，2，YIN Jun2，3，WEI Li2，3,LIU Yuxia4

(1.Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops，Zhengzhou 450002，China；2.School of Agronomy，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；3.National Engineering Research Center for Wheat，Zhengzhou 450002，China；4.Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China)

In order to further excavate the related genes of wheat vernalization，explored the regulation mechanism of wheat vernalization，this study screened and cloned an EST sequence from a high-throughput RNA sequencing analysis comparing the transcriptomes with wheat varieties with different developmental characteristics under vernalization and non-vernalization treatment，and namedTrx59. The open reading frame (ORF) ofTrx59 gene was 372 bp，ecoding 124 amino acids，and contained one thioredoxin domain structure. Expression analysis was conducted by qRT-PCR and the gene function was verification by using VIGS technique. The result showed that the expression level ofTrx59 was gradually up-regulated during vernalizaton process；the expression level and time ofTrx59 gene in spring variety LC10 was higher and earlier than that in winter variety J841. BSMV：Trx59 recombinant vector was built and inoculated wheat plants of J841. After 14 days of inoculation，the leaves appeared visible light bleaching phenomenon，and the expression level ofTrx59 reduced sharply，indicating thatTrx59 gene had been significantly suppressed；the spike differentiation process of plants inoculated by BSMV：Trx59 was later than that of the negative control group，deducing that theTrx59 genes may be related to the wheat developmental characteristics.

Wheat；Vernalization；Expression analysis；VIGS；Functional verification

2017-08-05

國家重點研發計劃課題(2017YFD0301106)；國家自然科學基金項目(31471452)

張鵬鈺(1991-)，女，河南鄭州人，在讀博士，主要從事小麥發育研究。

衛 麗(1966-)，女，河南商丘人，研究員，博士，主要從事小麥發育研究。 劉毓俠(1965-)，女，河南商丘人，研究員，主要從事作物遺傳育種及期刊編輯工作。

Q78；S512.03

A

1000-7091(2017)05-0001-06

10.7668/hbnxb.2017.05.001