立枯絲核菌不同融合群G蛋白β亞基基因克隆與分子進化分析

舒燦偉，曹琦琦，趙 美，江紹鋒，周而勛

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，植物病理學(xué)系，廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.貴州省出入境檢驗檢疫局，貴州 貴陽 550081)

立枯絲核菌不同融合群G蛋白β亞基基因克隆與分子進化分析

舒燦偉1，曹琦琦2，趙 美1，江紹鋒1，周而勛1

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，植物病理學(xué)系，廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.貴州省出入境檢驗檢疫局，貴州 貴陽 550081)

為了揭示立枯絲核菌不同融合群菌株G蛋白β亞基基因的差異，利用同源克隆的方法，克隆了立枯絲核菌8個融合群共13個菌株的G蛋白β亞基基因，并進行分子進化分析。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同融合群的立枯絲核菌的G蛋白β亞基基因的內(nèi)含子和開放閱讀框數(shù)目一致，編碼氨基酸均為347個。但氨基酸序列存在14個位點的突變。同源性分析表明，立枯絲核菌各個融合群G蛋白β亞基基因之間的同源性較高，同一亞群的菌株同源性達到100%，不同融合群之間存在差異。分子進化分析表明，不同物種的G蛋白β亞基基因在進化上仍具有一定的保守性，不同融合群菌株的G蛋白β亞基基因序列聚為一個分枝且與同屬擔(dān)子菌門的物種同源性最高。該研究揭示了立枯絲核菌不同融合群G蛋白β亞基基因的特征，為該菌基因功能和分子檢測研究奠定了基礎(chǔ)。

立枯絲核菌；融合群；G蛋白；基因克隆；分子進化

絲核菌(Rhizoctoniasolani)在自然界中廣泛存在于土壤及各種不同類型的寄主植物上，引起多種植物的嚴重病害[1]。但它們在致病性、形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀及生理特征等諸多方面均有所不同。目前國際上普遍采用Ogoshi的融合群標準菌株對立枯絲核菌進行分類[2]。到目前為止，立枯絲核菌的融合群已有14個；同一個融合群內(nèi)的菌株由于相互之間融合頻率不同，或具有獨特特性(如特異的寄主范圍、營養(yǎng)要求或分子標記在遺傳上的不同)而劃分為融合亞群[3-4]。

近年來，隨著分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)方法的迅速發(fā)展，結(jié)合菌絲融合群與分子生物學(xué)手段對絲核菌進行研究已是主要方向[5]。G蛋白β亞基編碼的蛋白作為重要的信號傳導(dǎo)蛋白，對致病機理起著非常重要的作用[6]。目前，全世界已利用同源克隆的方法成功地對30多個物種G蛋白β亞基基因進行了克隆，其中哺乳動物G蛋白β亞基基因4個，植物G蛋白β亞基基因5個，真菌G蛋白β亞基基因20個，其他類型G蛋白β亞基基因7個，并研究了這些基因的功能[7]。在真核生物中，G蛋白β亞基基因參與信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致基因表達、細胞功能受到影響[5-8]。在植物病原真菌中，G蛋白β亞基參與了病原菌的致病過程[9-12]。Kasahara等[13]對板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)的研究發(fā)現(xiàn)，喪失β亞基基因功能導(dǎo)致菌絲缺乏明顯分叉，對寄主植物的侵染和致病力明顯降低，并影響孢子的形成。但目前對水稻紋枯病菌(R.solaniAG-1 IA)G蛋白β亞基基因功能分析的有關(guān)報道還比較少。

本研究利用同源克隆的方法，克隆立枯絲核菌8個融合群及其亞群菌株的G蛋白β亞基基因，分析不同融合群之間以及與其他物種的G蛋白β亞基基因之間在分子進化上的關(guān)系，為G蛋白β亞基基因在立枯絲核菌不同融合群中的功能分析和分子檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1供試菌株

供試菌株為立枯絲核菌8個融合群11個融合亞群的11個國際標準融合群菌株(AG-1 IA、AG-1 IB、AG-1 IC、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8、AG-9和AG-BI)以及國內(nèi)分離鑒定的屬于AG-1 IA的強致病力菌株GD-118和C-30，共13個菌株。其中AG-1 IA(GD-118)和AG-1 IA(C-30)菌株由廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室保存，其余菌株由日本北海道大學(xué)Ogoshi教授惠贈。

1.2主要試劑和儀器

真菌核酸提取試劑盒(貨號9765、9108)、高保真酶、克隆載體pMD20-T、大腸桿菌JM109、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自TaKaRa公司；引物合成和測序由奧科生物公司完成。PCR擴增儀veriti 96-well Thermal cycle 9902購自美國Torrey Pines Scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)Alpha Imager EP購自美國Alpha Innotech 公司。

1.3菌株純化及菌絲收集

將保存于斜面上的菌種移到水瓊脂平板活化后，在PDA上生長2 d。用內(nèi)徑5 mm的打孔器在菌落邊沿打取菌餅，將5塊菌餅接入到100 mL PDB培養(yǎng)基中，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)3～4 d。菌絲體用無菌濾紙過濾后，用ddH2O洗滌2～3次，吸干水分后馬上用液氮冷凍，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4核酸提取和PCR擴增

核酸提取的具體步驟詳見產(chǎn)品說明書。以DNA為模板，用高保真酶進行PCR擴增，所用引物序列為：F：5′-TGGCTTGTTGGGTTGA-3′；R：5′-TGACCACGACCAAATGAA-3′。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火溫度下復(fù)性40 s，72 ℃延伸1 min(35個循環(huán))；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。同樣以RNA為模板，用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR擴增，所用引物序列為：F：5′-ATG

TCGAACCAAGGAGATATT-3′；R：5′-TTACGCCCAGA

CCTTGAG-3′。擴增程序為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，退火溫度下30 s，72 ℃ 1 min(30個循環(huán))；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。分別將PCR與RT-PCR的產(chǎn)物切膠回收，連接到克隆載體pMD20-T，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109感受態(tài)細胞。通過藍白斑篩選和PCR驗證，將陽性克隆子送往奧科公司測序。

1.5序列分析

1.5.1 分子進化分析 利用DNAStar軟件分析13個菌株G蛋白β亞基基因DNA序列的相似度，并利用MEGA 7軟件和iIOL網(wǎng)站(http：//itol.embl.de/)構(gòu)建13個菌株以及與其他植物病原真菌G蛋白β亞基基因的分子進化樹。

1.5.2 開放閱讀框和內(nèi)含子分析 用DNAMAN軟件將13個菌株的gDNA序列和cDNA序列進行比對，分析內(nèi)含子的位置并進行氨基酸比對。用DNAStar軟件查找13個菌株G蛋白β亞基基因cDNA全長序列的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)。

2 結(jié)果與分析

2.1核酸的提取結(jié)果

立枯絲核菌13個菌株的DNA(圖1-A)和RNA(圖1-B)電泳結(jié)果表明，所提取的核酸條帶完整，沒有降解現(xiàn)象，電泳背景干凈，沒有雜質(zhì)殘留。通過微量紫外分光光度檢測，所有樣品的濃度和純度都能滿足后續(xù)的研究。

A.DNA；B.RNA。M.DL10000、DL2000；1.AG-1 IA；2.AG-1 IB；3.AG-1 IC；4.AG-2-1；5.AG-2-2ⅢB；6.AG-4；7.AG-5；8.AG-6；9.AG-8；10.AG-9；11.AG-BI；12.AG-1 IA(GD-118)；13.AG-1 IA(C-30)。圖2，4同。M.DL10000，DL2000；1.AG-1 IA；2.AG-1 IB；3.AG-1 IC；4.AG-2-1；5.AG-2-2ⅢB；6.AG-4；7.AG-5；8.AG-6；9.AG-8；10.AG-9；11.AG-BI；12.AG-1 IA(GD-118)；13.AG-1 IA(C-30).The same as Fig.2,4。

2.2PCR擴增結(jié)果

PCR的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，AG-1 IA、AG-1 IB、AG-1 IC、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-4、AG-6、AG-8、AG-9、AG-BI融合群標準菌株和GD-118、C-30這12個菌株擴增條帶大約為1 800 bp，而融合群AG-5標準菌株擴增條帶大約為1 500 bp(圖2-A)；RT-PCR的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，13個菌株均擴增出大約1 000 bp的目的條帶(圖2-B)。

A.PCR；B. RT-PCR;M.DL2000。

2.3序列比對結(jié)果分析

將PCR和RT-PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序，序列分析結(jié)果表明，13個菌株G蛋白β亞基基因序列的總體相似性為88.93%，具有較高的同源性；其中AG-1 IA亞群的標準菌株與從我國分離到的同一個融合亞群的菌株AG-1 IA(GD-118)和AG-1 IA(C-30)(均分離自水稻)的相似度達到100%。融合群/亞群AG-1 IA、AG-1 IB、 AG-1 IA(GD-118)、AG-1 IA(C-30)、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-6、AG-8和AG-9的序列相似性達到99.55%，也表現(xiàn)出了很高的同源性。融合群AG-6、AG-8、AG-9的G蛋白β亞基基因序列的相似性達到99.74%，也具有很高的同源性。融合群AG-4和AG-5、AG-4和AG-6、AG-5和AG-6的相似性分別為69.48%，70.63%和64.85%，同源性較低。橋梁菌株AG-BI與AG-1 IA、AG-4、AG-5、AG-6和AG-1 IC的序列相似性分別81.75%，70.15%，64.44%，81.34%和79.58%。

2.4分子進化分析

本研究采用MEGA 7軟件和iTOL網(wǎng)站分析了立枯絲核菌不同融合群菌株的G蛋白β亞基基因與其他真菌G蛋白β亞基基因的親緣關(guān)系。結(jié)果表明(圖3)，立枯絲核菌的13個菌株與同屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)聚在一個大的分枝，其分子進化關(guān)系較其他真菌門的菌較近，并且同屬一門不同屬之間真菌之間表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，因而可知不同物種之間G蛋白β亞基基因在進化上具有保守性。從圖3還可看出，AG-BI、AG-1 IC、AG-4、AG-5這4個融合群/亞群菌株的親緣關(guān)系較遠。AG-6、AG-8、AG-9這3個融合群可聚在一個分支，AG-1 IA、AG-1 IB、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-1 IA(GD-118)、AG-1 IA(C-30)可分布成一支，因此它們的分子進化關(guān)系較近。

玉米黑粉菌.基因庫編號：AF536325.1；粗糙脈孢菌.基因庫編號：AF491286.1；大麗輪枝菌.基因庫編號：JQ665433.1；尖孢鐮刀菌.基因庫編號：AY219172.2；裂殖酵母.基因庫編號：L28061；異旋孢腔菌.基因庫編號：AY211190.2。Ustilago maydis.GenBank：AF536325.1； Neurospora crassa .GenBank：AF491286.1；Verticillium dahliae.GenBank：JQ665433.1；Fusarium oxysporum.GenBank：AY219172.2；Schizosaccharomyces pombe.GenBank：L28061；Cochliobolus heterostrophus.GenBank：AY211190.2.

2.5G蛋白β亞基基因全長序列和內(nèi)含子分析

用DNAStar軟件查找開放閱讀框(ORF)，得到一個完整的ORF，說明此序列是一個G蛋白β亞基基因的全長序列。 用DNAMAN軟件分析13個菌株G蛋白β亞基基因的gDNA序列和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)G蛋白β亞基基因均存在4個內(nèi)含子。

2.6氨基酸序列分析比對

把8個融合群13個菌株的G蛋白β亞基基因的cDNA全長序列翻譯成氨基酸序列再用DNAMAN軟件進行比對，發(fā)現(xiàn)該基因編碼347個氨基酸，比對結(jié)果表明，存在14個氨基酸的差異，其中第27，37，83，182，222，225，233，264，270，272，320，329位氨基酸存在1個位點的差異，而第31和35位存在2個氨基酸位點差異(圖4)。同屬一個融合亞群的序列沒有發(fā)生突變，序列保守性比較強；而發(fā)生氨基酸位點差異主要是AG-4、AG-5和AG-BI這3個融合亞群。

3 結(jié)論與討論

G蛋白是細胞內(nèi)一類重要的信號傳導(dǎo)蛋白，在高等動物、簡單真核生物、昆蟲及植物中普遍存在[14]。目前的研究表明，G蛋白的轉(zhuǎn)膜信號的中介作用，并且對該系統(tǒng)各組分的不斷研究已成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[6，13，15]。G蛋白β亞基編碼的蛋白作為重要的信號傳導(dǎo)蛋白，在致病機理方面起著非常重要的作用[13，16-18]。

關(guān)于植物病原真菌G蛋白β亞基基因的克隆與功能已有較多報道，這些研究發(fā)現(xiàn)，真菌G蛋白β亞基主要是在病菌交配過程中起作用，也發(fā)現(xiàn) G蛋白β亞基功能缺失后的菌株毒性喪失[19]。Nishimura等[20]研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟菌(Magnaporthegrisea) G蛋白β亞基基因MGB1 缺失突變體會表現(xiàn)出產(chǎn)孢量下降，致病力減弱。在尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和玉米赤霉(Gibberellazeae)中，G蛋白β亞基基因可影響真菌毒素產(chǎn)生和致病力[21]。Delgado-Jarana 等[22]發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的 G蛋白β亞基通過參與 cAMP或獨立于 cAMP 的代謝途徑控制病菌的生長、發(fā)育和致病過程。

圖4 立枯絲核菌G蛋白β亞基氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of the amino acid sequences of G protein β subunit of Rhizoctonia solani

本研究比較了立枯絲核菌8個融合群13個菌株的G蛋白β亞基基因序列，發(fā)現(xiàn)它們之間相似度較高，但有些融合群的G蛋白β亞基基因之間存在一些差異。不同融合群菌株的G蛋白β亞基基因的同源性的高低與是否為同一融合群并沒有太大的聯(lián)系。融合群是根據(jù)菌絲融合測定的方法來劃分的，是在生物學(xué)水平上的分類，并不能代表其在分子水平的差異。但同一亞群菌株的G蛋白β亞基基因同源性達到100%，說明同一融合亞群菌株之間的G蛋白β亞基基因沒有出現(xiàn)遺傳分化[2-3]。為進一步直觀揭示這些差異，本研究構(gòu)建了立枯絲核菌G蛋白β亞基基因序列的分子進化樹，發(fā)現(xiàn)了AG-1 IA、AG-1 IB、AG-1 IA(GD-118)、AG-1 IA(C-30)、AG-2-1、AG-2-2ⅢB為一支，進化關(guān)系比較近。AG-6、AG-8和AG-9為一支，其進化關(guān)系最近。而AG-1 IC、AG-4、AG-5和AG-BI聚為一支，親緣關(guān)系較遠。比較立枯絲核菌不同融合群菌株與其他近緣真菌G蛋白β亞基基因的相似性及親緣關(guān)系的遠近，結(jié)果發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌和玉米黑粉菌同屬于擔(dān)子菌門，表現(xiàn)出的親緣關(guān)系較其他真菌門的真菌較近，并且同門真菌的屬之間也表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，因而可知不同物種之間G蛋白β亞基基因在進化上具有保守性，這可能提示其功能的保守性。本研究找出了立枯絲核菌G蛋白β亞基基因的4個內(nèi)含子，對立枯絲核菌不同融合群G蛋白β亞基基因的相關(guān)功能表達研究具有指導(dǎo)意義。同時，本研究比較了立枯絲核菌不同融合群G蛋白β亞基基因翻譯蛋白(氨基酸)全長序列的差異，對研究立枯絲核菌不同融合群G蛋白β亞基基因的分化和分子檢測具有重要意義。

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CloningandSequenceAnalysisofG-proteinBeta-subunitGenesinDifferentAnastomosisGroupsofRhizoctoniasolani

SHU Canwei1，CAO Qiqi2，ZHAO Mei1，JIANG Shaofeng1，ZHOU Erxun1

(1.College of Agriculture，South China Agricultural University，Department of Plant Pathology，Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control，Guangzhou 510642，China；2.Guizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People′s Republic of China，Guiyang 550081，China)

To study the genetic difference and molecular evolution of G protein beta-subunit gene ofRhizoctoniasolani. Full length of gDNA and cDNA sequences of G protein beta-subunit gene of 13 strains from 8 anastomosis groups (AGs) ofRhizoctoniasolaniwere cloned and analyzed by homology-based cloning method. It showed that the number of intron and open reading frames were consistent in different isolates，which encoded 347 amino acids with 14 point mutations. Homology analysis showed that the homology between AGs ofR.solaniwas high，and the similarity percent of isolates from the same intraspecific group was 100%. But there were genetic diverse among different AGs in homology. The phylogenetic analysis indicated that the G protein beta-subunit gene could effectively distinguish different AGs，and it also could differentiate all the AGs ofR.solanifrom other fungi. It revealed the characteristic of G protein beta-subunit gene in different AGs fromR.solani，and laid the foundation for the gene functional analysis and molecular detection of this fungus.

Rhizoctoniasolani；Anastomosis groups；G protein；Gene cloning；Molecular evolution

2017-06-21

廣東省自然科學(xué)基金(博士啟動)項目(2016A030310454)；國家自然科學(xué)基金項目(31470247)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(No. 201403075)

舒燦偉(1985-)，男，廣東潮安人，講師，博士，主要從事植物病原真菌及真菌病害研究。舒燦偉、曹琦琦為同等貢獻作者。

周而勛(1963-)，男，廣東高州人，教授，博士，主要從事植物病原真菌及真菌病害研究。

Q78

A

1000-7091(2017)05-0007-06

10.7668/hbnxb.2017.05.002