鴨梨PbChiⅡ的克隆與表達分析

李朋朋，吳運東，葉 嘉，李丹花，喬莉娟，張玉星，董金皋

(1.邯鄲學院 生命科學與工程學院，河北 邯鄲 056005；2.河北農業大學，河北 保定 071001 )

鴨梨PbChiⅡ的克隆與表達分析

李朋朋1，吳運東1，葉 嘉1，李丹花1，喬莉娟1，張玉星2，董金皋2

(1.邯鄲學院 生命科學與工程學院，河北 邯鄲 056005；2.河北農業大學，河北 保定 071001 )

為明確幾丁質酶在鴨梨抗病過程中的作用，以鴨梨為試材，提取總RNA，采用RT-PCR方法克隆幾丁質酶基因PbChiⅡ，分析PbChiⅡ在梨黑星病菌誘導下的表達模式，構建原核表達載體pET30a-PbChiⅡ，在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達PbChiⅡ蛋白，分析重組蛋白在非生物脅迫下的生長能力。結果表明：PbChiⅡ基因全長(基因登錄號：KP876485)969 bp，實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)分析顯示，PbChiⅡ基因的表達受病原菌的調控，在供試的96 h內，梨黑星病菌可誘導該基因表達，且表達量在48 h達到最高。將PbChiⅡ基因成功克隆到原核表達載體pET30a上，SDS-PAGE分析表明，該重組蛋白在37 ℃，1.0 mmol/L IPTG誘導2 h，表達量最大。轉pET30a-PbChiⅡ載體的大腸桿菌BL21(DE3)菌株表達了分子量約35.53 kDa的重組蛋白。誘導的蛋白可增強菌體在NaCl、CuCl2、CdCl2和ZnSO4等非生物脅迫下的生長能力。為進一步探索PbChiⅡ基因的功能提供了基礎資料。

鴨梨；幾丁質酶基因；原核表達；非生物脅迫；表達模式

幾丁質酶 (Chitinase，Chi)作為一類病程相關蛋白，是植物遭受生物因素和非生物因素后誘導并產生的[1-3]。

目前已知的植物幾丁質酶都屬于小分子蛋白，分子量為25～40 kDa，最適pH值為6.0，多數以單體形式存在，50 ℃下仍穩定存在并保持酶活性，等電點為3～10[4-6]。細胞內、外均有分布，等電點偏酸或偏堿，常被稱為酸性幾丁質酶或堿性幾丁質酶。很多動物、植物、微生物都可產生幾丁質酶。由于植物自身缺乏有效的免疫系統，因此容易受到外界環境影響。當植物受到病原菌侵染時，植物會產生一系列的防御反應來保護自身[7]。幾丁質酶作為一類非常重要的病程相關蛋白，它能夠降解真菌細胞壁中的幾丁質[8-9]。

研究報道，幾丁質酶在植物的防御機制中起著重要作用，體內外試驗表明，單子葉植物和雙子葉植物中的幾丁質酶均能抑制真菌幾丁質的生長，植物幾丁質酶對真菌、細菌、病毒等生物脅迫和鹽害、冷害、凍害等非生物脅迫均有一定的抗性。

把植物中的幾丁質酶基因轉入酵母、大腸桿菌中進行表達并對表達產物進行分析、利用是植物幾丁質酶發展的一個重要方向。Fan等[10]從車前草中克隆得到幾丁質酶基因，其純化產物能水解幾丁質并可抑制香蕉炭疽盤長孢菌的生長。Xayphakatsa等[11]將水稻ClassⅡ類幾丁質酶基因轉入大腸桿菌進行表達，表達產物對綠色木霉具有一定的抑制效果。Chen等[12]將水稻幾丁質酶基因轉入大腸桿菌進行表達，表達產物可以降解幾丁質的活性。將植物幾丁質酶在微生物中進行表達存在許多問題，如產生包涵體、無抑菌活性、表達產物無活性等，導致后續無法對表達產物進行繼續研究。隨著蛋白表達技術研究的不斷深入，植物幾丁質酶在大腸桿菌、酵母等中進行表達、應用的前景十分廣闊。

本研究利用RT-PCR技術克隆鴨梨幾丁質酶基因PbChiⅡ，分析其在梨黑星病菌處理下的表達情況，構建PbChiⅡ的原核表達載體并對PbChiⅡ在大腸桿菌(Escherichiacoli)中的表達情況和重組蛋白在非生物脅迫下的生長能力進行分析，為后續PbChiⅡ基因的功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1試驗材料

試驗所用果實采自滄州市肅寧縣鴨梨果園。 梨黑星病菌(Venturianashicola)由河北農業大學梨中心實驗室分離保存。載體pET30α、T4DNA連接酶、限制性內切酶SacⅠ和XhoⅠ等均購自大連TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1 鴨梨PbChiⅡ基因的克隆 根據已克隆得到的PbChiⅡ序列設計特異引物，根據pET30a載體圖譜上的酶切位點選擇適宜的限制性內切酶，設計基因的上下游引物，上下游引物分別加酶切位點SacⅠ和XhoⅠ，引物序列如下：F：5′-CGAGCTCATG

GAGAAAAAATGGCTTCTG-3′(下劃線部分是SacⅠ酶切位點，斜體為保護堿基)；R：5′-CCGCTCGAGA

GAAGACGAAGACGAAGAAGATG-3′(下劃線部分是XhoⅠ酶切位點，斜體為保護堿基)。

以鴨梨cDNA為模板，利用上述設計的特異引物進行PCR擴增。PCR體系為：cDNA 1.0 μL，10×Ex PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP(2.5 mol/L)2.0 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2 病原菌接種方法 將梨黑星病菌分生孢子制成孢子懸浮液，濃度約為1×106個/mL，噴施于7，14，21 d的幼果及成熟期果實，于噴施后0，3，6，12，24，48，72，96 h取樣，將樣品迅速置于液氮中，帶回實驗室，于-80 ℃保存備用。對照果實取樣時間及保存方法同上。

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)分析 RNA的提取采用CTAB法進行[13]。用qRT-PCR分析儀進行實時熒光定量分析。以梨β-Actin(GenBank登錄號：GU830958)為內參基因設計特異引物，上游引物：5′-TTGGGATGGGTCAGAAGG-3′，下游引物：5′-CTGTGAGCAGAACTGGGTG-3′。根據PbChiⅡ序列設計引物，上游引物：5′-ACTACAACTATGGAGAAACG

GGTG-3′和下游引物：5′-CAAAGACATCGTGGGCTG

AAG-3′。反應體系為TaKaRa公司的SYBR Master Mix 12.5 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL，加ddH2O補至25 μL。按以下程序進行PCR擴增：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，40個循環。每處理重復3次，用2-ΔΔCt法對數據進行分析[14]。

1.2.4 原核表達載體構建 將帶有酶切位點的PbChiⅡ連接到pMD19-T載體，轉化大腸桿菌感受態，涂布于含氨芐的LB平板，培養12 h，隨機挑取菌落接種于氨芐抗性的LB液體培養基進行培養，提取質粒，酶切鑒定后送上海生物工程有限公司測序。

將測序正確的PbChiⅡ片段連接載體pET30α，轉化Trans5α后提取質粒做雙酶切檢測，將獲得的PbChiⅡ片段與pET30α片段連接，構建表達載體pET30α-PbChiⅡ，提取質粒，將雙酶切鑒定為陽性的克隆送上海生工測序。

1.2.5 IPTG誘導下重組菌株的生長速度測定 將正確的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行培養表達時，經終濃度為1 mmol/L的 IPTG誘導后，與沒有進行誘導的菌體進行吸光度的比較。

1.2.6 目的蛋白的誘導表達 將測序正確的菌液接種于含卡那霉素的液體LB培養基中進行振蕩培養至菌液OD600=0.5時，向培養基中加入IPTG，使其終濃度為1 mmol/L，37 ℃條件下振蕩培養1，2 h，向菌體中加入50 μL 1×蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min后將樣品取出并冷卻至室溫，離心后取10 μL上清液于15%的分離膠和5%的濃縮膠中進行SDS-PAGE檢測[15]。以重組菌未誘導、空載菌BL21(pET30a)誘導2 h、空載菌BL21(pET30a)未誘導為對照。

1.2.7 重組菌株抵抗非生物脅迫能力 將重組菌株在LB液體培養基于28 ℃，220 r/min的條件下進行振蕩培養至OD600為0.6，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，37 ℃振蕩培養2 h，將菌液濃度稀釋成10-3和10-4，分別吸取10 μL菌液滴在含有NaCl(250，500，750 mmol/L)、CuCl2(250，500，750 μmol/L)、CdCl2(250，500，750 μmol/L)、ZnSO4(250，500，750 μmol/L)的LB平板上，10-3和10-42個不同濃度菌

液分別滴加在平板兩邊，以不添加NaCl、CuCl2、CdCl2、ZnSO4的LB平板作為對照。37 ℃靜置培養過夜，拍照。

2 結果與分析

2.1鴨梨PbChiⅡ基因的克隆

利用RT-PCR方法，從果實的cDNA模板上擴增出一條約900 bp大小的條帶，經進一步克隆測序得知片段大小為969個核苷酸，編碼322個氨基酸，雙下劃線表示起始密碼子。生物信息學分析發現，PbChiⅡ蛋白屬于第Ⅱ類幾丁質酶(圖1，2)。

圖1 PbChiⅡ基因的PCR擴增Fig.1 The PCR amplification of PbChiⅡ

圖2 PbChiⅡ的核苷酸序列和推導的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PbChiⅡ

2.2生物脅迫誘導鴨梨果實中PbChiⅡ的表達

對幼果和成熟期鴨梨果實進行病原菌處理，分析PbChiⅡ的表達情況。結果表明，從處理后3 h開始，PbChiⅡ的表達量開始升高，處理后48 h，PbChiⅡ的表達量達到最大值。7，14，21 d 的幼果和成熟期果實經黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達量分別是同期對照的3.58，10.18，9.51，6.37倍。7 d幼果經黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的2.80，2.13，1.46，1.42，1.62，2.06倍，14 d幼果經黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的2.61，1.29，1.27，1.11，1.23，1.74倍，21 d幼果經黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的3.09，2.45，1.45，1.41，1.35，1.51倍，成熟期果實經黑星病菌處理后48 h，PbChiⅡ的表達量分別是處理后3，6，12，24，72，96 h的1.99，1.49，1.41，1.19，1.49，1.55倍(圖3)。

A. 7 d幼果；B.14 d幼果；C.21 d幼果；D.成熟期果實。A. 7 d young fruit；B. 14 d young fruit；C. 21 d young fruit；D.Mature fruit.

2.3原核表達載體構建

將PbChiⅡ片段與pET30a質粒片段進行連接，轉化后提取陽性菌液質粒，用限制性內切酶SacⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，得到約5 kb和1 kb的條帶，表明PbChiⅡ已連接到pET 30a上。將重組質粒再次測序，結果表明，插入片段與克隆測序完全一致。表明pET30a-PbChiⅡ得以成功構建(圖4)。

圖4 PbChiⅡ基因原核表達載體的酶切驗證Fig. 4 Digestion of PbChiⅡ prokaryotic expression vector by two restriction enzymes

2.4重組菌在IPTG誘導下的生長速度測定

將正確的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，經1 mmol/L IPTG誘導后，與未誘導的菌體相比生長減慢。表明目的基因開始轉錄，使菌株生長減慢，目的基因得以表達(圖5)。

2.5目的融合蛋白的表達

SDS-PAG分析表明，重組菌株經IPTG誘導后出現一條分子量約35.53 kDa的融合蛋白條帶，重組菌未誘導、空載菌BL21(pET30a)未誘導及對應誘導的空載菌都未出現目的蛋白條帶。由此表明PbChiⅡ蛋白得以成功表達(圖6)。

圖5 重組菌的生長速度測定Fig.5 Determination of the growth rate of recombinant isolate

2.6重組菌株在非生物脅迫下的生長情況

植物幾丁質酶基因是一類與抗逆相關的基因，它受不同脅迫的誘導。本試驗中，與BL21(DE3)+pET30a相比，BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ在含有NaCl(250，500，750 mmol/L)、CuCl2(250，500，750 μmol/L)、CdCl2(250，500，750 μmol/L)、ZnSO4(250，500，750 μmol/L)等非生物脅迫因子的LB固體培養基中具有更強的生長能力(圖7)，但是由于原核生物與真核生物的基因表達系統存在很大差異，因此，該幾丁質酶基因在真核生物中是否存在相同現象還需進一步研究。

M.Protein molecular weight Marker；1.重組菌未誘導；2.空載菌BL21(pET30a)誘導2 h；3.空載菌BL21(pET30a)誘導1 h；4.空載菌BL21(pET30a)未誘導；5.誘導4 h；6.誘導3 h；7.誘導2 h；8.誘導1 h。

M.Protein molecular weight Marker；1. BL21(pET30a-PbChiⅡ ) without IPTG induction；2.BL21(pET30a) for 2 h cultivation with IPTG induction；3.BL21(pET30a) for 1 h cultivation with IPTG induction；4.BL21(pET30a) without IPTG induction；5.BL21(pET30a-PbChiⅡ ) for 4 h cultivation with IPTG induction；6.BL21(pET30a-PbChiⅡ) for 3 h cultivation with IPTG induction；7.BL21(pET30a-PbChiⅡ ) for 2 h cultivation with IPTG induction；8.BL21(pET30a-PbChiⅡ ) for 1 h cultivation with IPTG induction.

圖6重組載體pET30a-PbChiⅡ誘導蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.6TheinducedproteinofrecombinedvectorpET30a-PbChiⅡanalyzedbySDS-PAGE

3 討論與結論

由真菌引起的植物病害是農業生產中的一類重要病害，誘導植物產生抗病性是一個復雜的機制，它涉及不同的免疫反應。包括PR蛋白在內的許多抗性基因已經從植物中克隆并在植物中得到了廣泛應用，且在植物抗病中起了重要作用[16-17]。起初，僅在抗性植株和對真菌、細菌、病毒產生過敏反應的植株中發現了PR蛋白，后來，在被病原菌侵染的感病植株中和受非生物脅迫的植株中也發現了PR蛋白，在這些PR蛋白中，幾丁質酶能夠降解真菌幾丁質，在自然界中廣泛存在，且在植物抵抗病菌中起著重要作用[18]。幾丁質酶基因在植物抗逆過程中也起著重要作用[19]。

外源基因在大腸桿菌中的表達受多種因素影響，如載體類型、外源基因結構及培養條件等，因此，若想使外源基因得到最大程度的表達，必須對誘導條件進行優化。本研究所用表達載體為pET30a，在IPTG終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導2 h的條件下成功獲得了與預測蛋白分子量大小一致的蛋白條帶，這為進一步研究PbChiⅡ蛋白的功能奠定了基礎。

當菌液OD600=0.6時，分別向接種BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A)和BL21(DE3)+pET30a(B)的LB液體培養基中加入IPTG以誘導融合蛋白的表達，將BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A)和BL21(DE3)+pET30a(對照)(B)接種在含有NaCl、CuCl2、CdCl2和ZnSO4的LB平板上，LB平板上紅線的左側接種10-3的菌液，右側接種10-4的菌液，培養基中含有NaCl(250，500，750 mmol/L)、CuCl2(250，500，750 μmol/L)、CdCl2(250，500，750 μmol/L)和 ZnSO4(250，500，750 μmol/L)，以LB培養中不添加任何物質的為對照。

Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) was added to the cultures of BL21 (DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A)and BL21(DE3)+pET30a (B)to induce the expression of recombinant protein. The cultures were adjusted to OD600=0.6. Spot assays of BL21(DE3)+pET30a-PbChiⅡ(A) and BL21(DE3)+pET30a (control) (B)on Luria-Bertani (LB) plates with NaCl，CuCl2，CdCl2and ZnSO4，Ten microliters from 10-3(left side of the red line on the plate) to 10-4(right side of the red line on the plate) dilutions were spotted onto LB plates without any supplement (CK) or with NaCl (250，500，50 mmol/L)，CuCl2(250，500,750 μmol/L)，CuCl2(250，500,750 μmol/L) and ZnSO4(250，500,750 μmol/L)，respectively.

圖7重組蛋白在非生物脅迫下的生長
Fig.7Thegrowthofrecombinantproteinunderabioticstresses

植物在被病原菌侵染初期就產生了防衛反應[20-22]，本研究表明，梨黑星病菌侵染鴨梨果實3～96 h后，PbChⅡ的表達量均高于處理后0 h，表明PbChiⅡ在寄主被病原菌侵染的初期可能就開始發揮作用。

幾丁質酶不但受生物脅迫的誘導，也受非生物脅迫的誘導[23]。本研究中，重組蛋白在4種非生物脅迫下(NaCl、CuCl2、CdCl2、ZnSO4)表現出良好的生長特性，有研究報道[24-25]，在脅迫條件下，含有重組蛋白的E.coli在脅迫條件下生長良好，Chaurasia等[26]發現在鹽脅迫、熱脅迫等條件下，植物螯合態合成酶基因PCS在E.coli具有很好的表達特性。甘蔗dirigent蛋白基因SiDir的重組蛋白在NaCl和PEG脅迫下仍具有良好的生長特性[25]。甘蔗幾丁質酶基因ScChiⅢ的重組蛋白在鹽脅迫等條件下仍表現出良好的生長特性[27]。這表明在生物脅迫和非生物脅迫下，幾丁質酶基因在原核生物和真核生物中的調控機制是類似的。

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CloningandExpressionAnalysisofPbChiⅡfromPyrusbretschneideriYali

LI Pengpeng1，WU Yundong1，YE Jia1，LI Danhua1，QIAO Lijuan1，ZHANG Yuxing2，DONG Jingao2

(1.College of Life Science and Engineering，College of Handan，Handan 056005，China；2.Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China)

To clarify the role of chitinase in the process of pear resistance disease, the total RNA of Yali was extracted and specific primers were designed to amplify the coding region of PbChi Ⅱ protein by RT-PCR，analysed the expression pattern ofPbChiⅡ after treatment with pathogens. The prokaryotic expression vector pET30a-PbChiⅡ was constructed and the recombinant protein was expressed inE.coliBL21 (DE3). The recombinant protein growth ability was analyzed under abiotic stress. The results showed that the length ofPbChiⅡ(GenBank accession Number：KP876485) gene was 969 bp，Quantitative Real-time PCR ( qRT-PCR) analysis revealed that the expression ofPbChiⅡ was regulated by pathogens，and enhanced up to the peak at 48 h after treatment withVenturianashicoladuring 96 h. ThePbChiⅡ gene was successfully subcloned into the expression vector pET30a. SDS-PAGE analysis showed that a specific recombinant protein of approximately 35.53 kDa was produced in the BL21 (DE3) with the prokaryotic expression vector pET30a-PbChiⅡ in 37 ℃ with 1.0 mmol/L IPTG for 2 hours. This protein enhanced the stress of isolate with NaCl，CuCl2，CdCl2and ZnSO4. This research provided basic references for further study the function ofPbChiⅡ.

PyrusbretschneideriYali；Chitinase gene；Prokaryotic expression；Abiotic stresses；Expression pattern

2017-07-19

邯鄲學院自然科學基金項目(16101)；邯鄲市科技局項目(1627201054-2)；河北省高校冀南太行山區野生資源植物應用技術研發中心

李朋朋(1987-)，女，河北邯鄲人，講師，博士，主要從事植物病理學研究。

Q78

A

1000-7091(2017)05-0045-07

10.7668/hbnxb.2017.05.008