月季RhMYB61基因的克隆及表達特性分析

李紹翠，姜新強，丁愛琴，劉慶超，王奎玲，李 偉，劉慶華

(青島農業大學 園林與林學院，山東 青島 266109)

月季RhMYB61基因的克隆及表達特性分析

李紹翠，姜新強，丁愛琴，劉慶超，王奎玲，李 偉，劉慶華

(青島農業大學 園林與林學院，山東 青島 266109)

為了研究月季MYB類轉錄因子在月季花朵開放中的分子特征和表達特性，利用轉錄組測序獲得的序列信息，結合RACE技術，從切花月季薩蔓莎中分離獲得一個MYB類型的轉錄因子基因，命名為RhMYB61(登錄號KY921844)。該基因ORF區包含1 323 bp，編碼441個aa，分子量為49.1 kDa，等電點為7.66，公式C2123H3280N620O688S18。系統進化樹分析表明，RhMYB61與桃樹中的PpMYB86和枇杷EjMYB8聚為一類，屬于R2R3-MYB類型轉錄因子，進一步的蛋白序列多重比較發現，RhMYB61在N端具有保守的R2-MYB和R3-MYB區域，包含有7個保守的基序，在R3-MYB區域包含有核定位序列。利用實時定量PCR技術分析了RhMYB61的時空表達模式，結果顯示，隨著開花級數的增加，RhMYB61的表達特性呈逐漸增加的趨勢，在開花級數5級時表達倍數最高；失水12 h處理提高了RhMYB61的表達倍數；與對照相比較，乙烯處理6，12，24 h顯著提高了RhMYB61的表達特性，1-MCP則顯著抑制了其表達。上述結果為月季RhMYB61生物學功能的研究奠定了基礎，同時也為今后月季的分子育種研究提供了理論參考。

切花月季；RhMYB61；qRT-PCR；表達特性

MYB轉錄因子是植物體內最大的轉錄因子基因家族之一，成員眾多、功能多樣，廣泛參與了植物的次生代謝調控、激素和環境因子的應答，并對細胞分化、細胞周期、器官的形成以及植物葉片的形態建成具有重要的調節作用[1]。眾多植物中均分離獲得了與非生物脅迫應答相關的MYB類型轉錄因子，在草本植物擬南芥AtMYB32[2]、水稻[3]、菊花CmMYB1、CmMYB2[4]，木本植物蘋果MdSIMYB1[5]、楊樹PtoMYB170[6]中的MYB轉錄因子均能夠對非生物脅迫如高鹽、干旱、冷脅迫等做出積極的響應，MYB轉錄因子在對非生物脅迫中的應答方面作用突出。

月季(Rosahybrida)是我國傳統名花也是世界四大切花之一，其切花銷售量和銷售額在全球花卉貿易中均居切花之首[7]。因其花期長、花色豐富等特點，已逐漸成為花朵開放等方面研究的模式材料[8]。我國月季切花主產區為云南，主要消費區域集中在北京、上海和廣州等城市，需要經歷長時間長距離的干式運輸，極易遭受失水脅迫和乙烯誘導的花朵開放，流通損耗在30%～50%，易造成僵花、僵蕾、花朵不能正常開放和衰老過速，制約了商品價值的發揮，對花卉生產者造成巨大的經濟損失[9]。因此，系統研究月季切花失水脅迫耐性和乙烯作用調節的分子機理，對切花月季品質提高具有重要的理論和實踐意義。

迄今為止，在月季中獲得了3個MYB類型的轉錄因子，分別為RhMYB1[10]、RhMYBs4-1和RhMYBs6-1，它們在不同花色月季花青素合成和調控花瓣顏色方面發揮著調控作用[11]，但對于數量眾多、功能多樣的月季MYBs還未充分挖掘。鑒于此，本試驗選取切花月季薩曼莎為材料，結合前期轉錄組測序結果，從花瓣cDNA中克隆得到一個MYB基因，命名為RhMYB61。采用生物信息學的方法對該基因的氨基酸序列進行序列比對、理化性質和親/疏水性和二級結構等方面的分析；并利用熒光定量PCR方法檢測了RhMYB61在月季不同開花級數、失水脅迫和乙烯處理下的轉錄本水平變化。為進一步明確RhMYB61基因特性及其對非生物脅迫的響應機制提供了理論基礎。

1 材料和方法

1.1試驗材料

供試材料為切花月季薩蔓莎(RosahybridaSamantha)，開花級數2級，按花枝長30 cm、留3復葉的基準剪切并插入蒸餾水中，復水1 h后備用。

1.2試驗處理

開花級數參考馬男等[12]對月季開花級數的劃分并進行取樣。

失水脅迫處理參照按照Dai等[13]進行，在溫度為22～25 ℃、相對濕度為30%～50%、140 μmol/(m2·s)熒光燈(照光12 h/d)照光的條件下水平干置0～24 h。在0，1，3，6，12，24 h分別取樣。

乙烯處理參照馬男等[12]進行，將修剪后的花枝置于去離子水中進行處理。乙烯處理時，在64 L密閉容器內注入乙烯使其終濃度為10 μL/L，處理24 h，以密閉于不含乙烯氣體的64 L密封箱中的花枝為對照。

各處理結束后將花瓣取下立即進行液氮冷凍，存于-80 ℃冰箱備用。

1.3試驗方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA的合成 以1.2中處理后的切花月季花瓣為材料，Hot borate法提取不同處理下花瓣總RNA[14]。利用Nanodrop(美國Effendorf公司)檢測提取的RNA樣品濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量。cDNA反轉錄采用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Erase(大連TaKaRa公司)試劑盒，將反轉錄產物稀釋4倍后-20 ℃保存備用。

1.3.2RhMYB61基因的克隆 利用月季EST數據庫[13]的Unigene序列為模板設計5′Race擴增和3′Race擴增特異性引物(表1)并進行PCR擴增。PCR反應體系為上下游引物 (10 μmol/L) 各 1 μL，ExTaq聚合酶 (5 U/μL) 0.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 1.6 μL，總cDNA (1 μg/μL) 1 μL，ddH2O補足20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用TaKaRa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒(大連TaKaRa公司)回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接。連接產物轉化大腸桿菌，藍白斑篩選，挑取白色單菌落鑒定，根據菌落PCR結果，將鑒定出的陽性克隆交由青島擎科梓熙生物工程有限公司測序。

1.3.3 RhMYB61的生物信息學分析 采用ProtParam (http：//web.Expasy.org/compute_pi/) 預測RhMYB61分子量和理論等電點。通過SignalP軟件進行信號肽預測[15]；利用ProtScale (http：//web.Expasy.org/protscale/) 分析RhMYB61氨基酸序列的疏水性/親水性；利用TMHMM Server v. 2.0軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對RhMYB61進行蛋白跨膜性分析[16]。利用ProtFun(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/) 和PRABI(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對蛋白質功能和二級結構進行預測[17]。利用Motif分析工具[18]進行RhMYB61基序保守性分析。用DNAMAN軟件進行序列比對及翻譯，利用MEGA 6.0軟件構建系統發育進化樹[11]。

表1 切花月季RhMYB61基因表達檢測引物Tab.1 Primers used to determine the expression of RhMYB61 in cut rose Samantha

1.3.4RhMYB61基因表達特性分析 采用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析月季切花RhMYB61基因在不同開花級數及失水、乙烯和1-MCP處理下的表達模式。不同處理條件總RNA提取和cDNA的合成如1.3.1，按照SYBR PremixExTaq試劑盒(大連TaKaRa公司)的操作說明進行qRT-PCR，所有反應均在Setp One Plus熒光定量PCR平臺(美國ABI公司)進行，RhUBI1為內參基因[19](表1)。反應條件為：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。Melt曲線從72 ℃至99 ℃，第1步維持45 s，以后每升高1 ℃維持5 s。采用2-ΔΔCT法分析數據[20]。

2 結果與分析

2.1RhMYB61克隆

以開花級數2級的切花月季薩蔓莎進行失水12 h處理，提取總RNA并反轉錄成cDNA模板，根據轉錄組EST序列信息設計5′和3′擴增引物(表1)，分別進行3′RACE和5′RACE，將上述片段與pMD-18T載體連接、轉化，并進行藍白斑篩選，將鑒定正確的樣品測序。所得結果如圖1所示，月季RhMYB61登錄號為KY921844，全長為1 727 bp，5′端非編碼區(5′-UTR)為178 bp，開放閱讀框為1 323 bp，編碼441個氨基酸，3′端非編碼區(3′-UTR)為226 bp。

M. DL2000 Marker；A. 3′RACE 產物；B.5′RACE 產物；C. RhMYB61開放閱讀框片段克隆；D. RhMYB61全長片段克隆。M. DL2000 Marker；A. 3′RACE fragment；B.5′RACE fragment；C. Open reading frame of RhMYB61；D. Full length of RhMYB61.

2.2RhMYB61生物信息學分析

2.2.1 RhMYB61基本特性分析 利用生物信息學軟件ProtParam等對RhMYB61的蛋白組成成分和理化性質進行了分析[21]。RhMYB61蛋白相對分子量49.1 kDa，理論等電點(pI)為7.66，公式C2123H3280N620O688S18，原子量6 729。RhMYB61蛋白為親水蛋白，其N-端頭部較親水，中間氨基酸也表現出親水性，蛋白在第81位疏水性最強，最高值為2.189，第177位親水性最強，最低值為-3.111。蛋白峰值的分布在0.5以上的比在-0.5以下的要少，表明蛋白為親水性蛋白。信號肽結果分析表明，RhMYB61不屬于分泌蛋白。蛋白跨膜性分析顯示RhMYB61氨基酸序列中未發現含有跨膜區域，不屬于膜蛋白；對RhMYB61蛋白進行二級結構預測顯示，其氨基酸組成α-螺旋(Hh)為137個(31.07%)，延伸鏈(Ee)為53個(12.02%)，無規則卷曲(Cc)為219個(49.66%)，屬于不規則結構。生物學功能預測顯示RhMYB61具有合成輔酶因子、嘌呤、嘧啶和脂肪酸代謝等方面的功能(表2)。

表2 RhMYB61蛋白質功能預測Tab.2 Biological function prediction of RhMYB61

2.2.2 RhMYB61保守基序和氨基酸序列比對 選取擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)、蘋果(Malusdomestica)、枇杷(Eriobotryajaponica)、白樺(Betulaplatyphylla)、菊花(Chrysanthemummorifolium)、厚葉蒴苣苔(Boeacrassifolia)、黑楊(Populusnigra)、桃(Prunuspercica)、水稻(Oryzasativa)和小麥(Triticumaestivum)中的MYB蛋白序列與月季RhMYB61進行基序保守分析，結果如圖2所示。由圖可知，不同植物MYB蛋白保守基序數量和位置不盡相同，所有植物均含有基序1、基序2和基序3。RhMYB61與AtMYB61、PpMYB86、MdMYB、EjMYB8、PnMYB和GmMYB86氨基酸序列類似，包含有7個保守基序，在N-端含有5個保守基序，并呈串聯排列，C-端含有2個保守基序，分別為基序4和基序8。基序7僅在TaMYB3R1和OsMYB3R2中有，其他植物中未發現。

方框表示MYB蛋白的保守基序；灰線條顯示非保守序列；標尺代表100個氨基酸。Each motif is represented by a number in the box and the grey lines represent the nonconserved sequences；The scale bar represents 100 amino acids.

進一步選取擬南芥、大豆、蘋果、枇杷和白樺中的MYB蛋白與月季RhMYB61蛋白進行序列多重比對分析(圖3)。結果顯示，5個不同物種MYB蛋白氨基酸序列與月季RhMYB61的一致性分別為42.63%，47.78%，63.19%，62.61%和44.62%，在12-60 aa和61-111 aa處含有2個保守的MYB結構域，上述不同植物MYB蛋白序列都屬于2R類型MYB轉錄因子，其N-端都含有非常保守的R2-MYB和R3-MYB結構域，具有 MYB家族典型的結構特征，SeqNLS[22]分析顯示RhMYB61的R3-MYB結構域中還包含有3處核定位序列(NLS，圖3方框部分)，所有植物MYB蛋白C-端氨基酸序列高度分化，推測不同物種中MYB蛋白功能的多樣性。

At.擬南芥；Gm.大豆；Md.蘋果；Ej.枇杷；Bp.白樺；Rh.月季。箭頭表示保守的R2和R3結構域；NLS表示核定位序列。At. Arabidopsis thaliana；Gm.Glycine max；Md.Malus domestica；Ej.Eriobotrya japonica；Bp.Betula platyphylla；Rh.Rosa hybrid.The two conserved MYB domain repeat (R2 and R3) are indicated with arrows；Nuclear localization sites was shown with boxed.

2.2.3 RhMYB61蛋白進化樹分析 為進一步探究月季RhMYB61與其他物種的同源性進化關系，選用擬南芥、水稻、厚葉旋蒴苣苔、蘋果、菊花、大豆、枇杷、桃、黑楊、白樺和小麥中的22個MYB蛋白質序列與月季RhMYB61構建系統進化關系圖(圖4)。結果顯示，月季RhMYB61與桃PpMYB86、枇杷EjMYB8、蘋果MdMYB、大豆GmMYB86、擬南芥AtMYB61親緣關系較近，與水稻OsMYB4、蘋果MdoMYB121、厚葉旋蒴苣苔BcMYB1親緣關系較遠，上述MYB蛋白均屬于R2R3-MYB類蛋白。單子葉植物小麥TaMYB3R1和水稻OsMYB3R1、OsMYB3R2屬于R1R2R3-MYB類蛋白，與月季RhMYB61親緣關系較遠。上述結果暗示了MYB類蛋白在雙子葉植物和單子葉植物進化上的保守性和多樣性。

2.3RhMYB61表達特異性分析

2.3.1RhMYB61在不同開花級數中的表達 為了明確RhMYB61在月季花朵發育中的作用，采用qRT-PCR的方法檢測RhMYB61在月季不同開花級數中的表達情況(圖5)。由圖5可知，隨著月季開花過程的進行，花瓣中RhMYB61的表達量呈現逐漸增高的趨勢，在開花級數0級和1級時相對表達量差別不大，分別為1.00和0.81，開花級數2級時表達量升高至3.00，顯著高于開花級數0級和1級，開花級數5級時相對表達量最高，為13.60，顯著高于其他開花級數。RhMYB61在月季不同開花級數中的表達量暗示著其參與了花朵開放的過程。

2.3.2 不同處理對RhMYB61表達量的影響 用定量PCR檢測了RhMYB61在轉錄本水平上對乙烯處理和失水脅迫處理的響應(圖6)。結果表明，在正常瓶插條件下，花瓣RhMYB61瓶插1，6，12 h只有微弱的表達，表達量分別為0.73，1.50，1.80，瓶插24 h后表達量升高到5.69，乙烯處理明顯誘導了RhMYB61的表達，乙烯處理6，12 h后，相對表達量分別為7.92，7.72，高于同一時間正常瓶插下的表達量，乙烯處理24 hRhMYB61相對表達量最高為8.37。乙烯抑制劑1-MCP處理降低了RhMYB61的表達水平，1-MCP處理1，6，12，24 h后RhMYB61表達量分別為0.21，0.46，0.57，1.07。

At.擬南芥；Gm.大豆；Md.蘋果；Ej.枇杷；Bp.白樺；Cm.菊花；Pp.桃；Pn.黑楊；Bc.厚葉旋蒴苣苔；Ta.小麥；Os.水稻。At.Arabidopsis thaliana；Gm.Glycine max；Md.Malus domestica；Ej.Eriobotrya japonica；Bp.Betula platyphylla；Cm.Chrysanthemum morifolium；Pp.Prunus percica；Pn.Populus nigra；Bc.Boea crassifolia；Ta.Triticum aestivum；Os.Oryza sativa.

圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖6-7同。Bars with different lowercase letters indicate significant differences by Turkey HSD test(P<0.05).The same as Fig.6-7.

對RhMYB61在不同失水情況下的表達特性進行了分析，結果如圖7所示，隨著失水脅迫時間的延長，RhMYB61的表達呈現出先上升后下降的趨勢，與正常瓶插植株相比，失水脅迫1 h的RhMYB61轉錄本水平差異不大，失水脅迫3，6 h誘導了RhMYB61表達水平的提高，相對表達量分別為1.56和1.87，隨后RhMYB61表達量逐漸降低，失水脅迫24 h表達量最低，為0.48。

圖6 不同時間乙烯處理RhMYB61的表達Fig.6 Expression analysis of RhMYB61 in response to ethylene in rose petals

圖7 RhMYB61在切花月季不同失水處理的表達Fig.7 Expression analysis of RhMYB61 expression under different dehydration time

上述結果表明,乙烯處理顯著誘導了RhMYB61的表達，失水脅迫處理對RhMYB61的表達影響不大。

3 討論

已有研究表明，MYB是植物體內最大的一類轉錄因子家族之一，在植物次生代謝調控、激素和環境因子的應答、細胞分化、細胞周期、器官的形成以及植物葉片的形態建成中發揮了重要作用。對多種植物中的MYB轉錄因子的功能研究發現，R2R3類型MYB轉錄因子在植物響應非生物脅迫逆境方面發揮了非常關鍵的作用，擬南芥AtMYB61[23]、水稻OsMYB91[24]、小麥TaMYB3R1[25]和大豆GmMYBJ7[26]中報道的R2R3類型MYB轉錄因子均能夠提高植株對干旱、高鹽、低溫等非生物逆境脅迫的抵抗能力。而在切花月季中，未見有對花瓣MYB轉錄因子參與非生物脅迫逆境的研究報道。本研究中，通過高通量測序和RACE技術克隆了月季切花中R2R3類型MYB轉錄因子RhMYB61，并利用定量PCR檢測了其在不同開花級數、乙烯處理和失水脅迫過程中的表達變化。結果表明，RhMYB61廣泛參與了切花月季花朵開放的過程，隨著開花級數的逐漸增加，表達量逐漸升高，開花級數5級時表達量最高，暗示著RhMYB61在月季花朵開放和花瓣擴展方面發揮著重要的作用，特別是花朵開放后期，參與了月季花朵的衰老進程。對RhMYB61的生物信息學分析表明，其生物學功能多集中在參與合成輔酶因子、嘌呤、嘧啶和脂肪酸代謝等方面，其參與月季花瓣衰老進程是否通過上述過程進行還有待進一步研究。

切花月季在采收后，從花農生產者到消費者手中要經歷長時間的干式遠距離運輸，運輸過程中的外源乙烯積累和失水脅迫極易導致切花開放異常，對切花品質和商品價值產生影響，是月季切花采后損耗的重要因素，因此了解不同切花月季品種對外源乙烯和失水脅迫的響應機制，對于切花月季采后保鮮、提高流通質量、改良現代月季育種技術等均具有重要的現實意義。切花月季薩曼莎對外源乙烯非常敏感，外源乙烯處理能夠促進月季花朵的開放，乙烯抑制劑1-MCP能夠通過與乙烯受體的結合，阻斷乙烯的感受，進而抑制花瓣內源乙烯的自我催化，延緩花瓣的衰老啟動，有效抑制花朵乙烯的生成。本試驗中，乙烯處理顯著增加了RhMYB61的轉錄本水平表達，乙烯抑制劑1-MCP處理則抑制了RhMYB61的表達水平，暗示著RhMYB61參與了乙烯誘導的月季花朵開放過程。研究表明，月季乙烯生物合成關鍵基因(RhACSs和RhACO1)和乙烯信號轉導關鍵基因(RhETRs和RhCTRs)在月季花朵開放過程中發揮著關鍵作用[27-28]，RhMYB61是否通過調控上述基因或者通過調控其他功能蛋白進而參與對花瓣擴展的調控，明確RhMYB61在月季花朵開放中的調節機理將是后續研究中需要解決的重要問題。

前人研究表明，失水脅迫對乙烯具有誘導作用[29]。切花月季薩曼莎經過乙烯處理和失水脅迫處理后花朵開放狀態非常類似，切花月季中可能存在水分脅迫和乙烯信號的交叉[30]。基于本試驗結果，失水脅迫處理3，6 h提高了RhMYB61的轉錄本水平，而失水脅迫處理12，24 h則降低了其表達，說明RhMYB61至少在轉錄水平上未參與月季切花失水脅迫與乙烯信號的交叉。本研究克隆了月季RhMYB61基因，對其進行了初步研究，后期可進一步對RhMYB61的功能和在切花月季響應失水脅迫影響花瓣擴展中的作用機制進行研究，對于明確花瓣開放機理和參與非生物脅迫耐性，利用現代生物育種技術改良現代切花月季品質將具有一定的意義。

[1] 王 棟，李利紅，陳志玲，等. 擬南芥根特異表達轉錄因子AtMYB305的鑒定及功能研究[J]. 科學通報，2001，46(21)：1804-1809.

[2] 馮盼盼.AtMYB32對AtGA20ox1基因表達的調控及在植物抗脅迫中的作用研究[D]. 長沙：湖南大學，2016.

[3] Smita S，Katiyar A，Chinnusamy V，et al. Transcriptional regulatory network analysis of MYB transcription factor family genes in rice[J]. Frontiers in Plant Science，2015，6(682)：1157.

[4] 單 紅. 菊花CmMYB1和CmMYB2轉錄因子基因的克隆及功能鑒定[D]. 南京：南京農業大學，2011.

[5] Wang R K，Cao Z H，Hao Y J. Overexpression of a R2R3 MYB geneMdSIMYB1 increases tolerance to multiple stresses in transgenic tobacco and apples[J]. Physiologia Plantarum，2014，150(1)：76-87.

[6] 劉 瑞. 楊樹PtoMYB170轉錄因子在次生壁合成調控及抗旱中的功能研究[D]. 重慶：西南大學，2016.

[7] Zuker A，Tzfira T，Vainstein A. Genetic engineering for cut-flower improvement[J]. Biotechnology Advances，1998，16(1)：33-79.

[8] Debener T，Linde M. Exploring complex ornamental genomes：the rose as a model plant[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2009，28(4)：267-280.

[9] 呂培濤. HD-Zip I家族成員RhHB1在月季花瓣衰老過程中的功能分析[D]. 北京：中國農業大學，2014.

[10] Yan H，Zhang H，Wang Q，et al. Isolation and identification of a putative scent-related geneRhMYB1 from rose[J]. Molecular Biology Reports，2011，38(7)：4475-4482.

[11] 趙 佳，劉 榮，楊 帆，等. 月季花青素苷相關R2R3-MYB 蛋白基因的克隆和表達分析[J]. 中國農業科學，2015,48(7)：1392-1404.

[12] 馬 男，蔡 蕾，陸旺金，等. 外源乙烯對月季(Rosahybrida)切花花朵開放的影響與乙烯生物合成相關基因表達的關聯[J]. 中國科學C輯，2005，35(2)：104-114.

[13] Dai F W，Zhang C Q，Jiang X Q，et al.RhNAC2 andRhEXPA4 are involved in the regulation of dehydration tolerance during the expansion of rose petals[J]. Plant Physiology，2012，160(4)：2064-2082.

[14] Wan C Y，Wilkins T A. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton (GossypiumhirsutumL.) [J]. Analytical Biochemistry，1994，223(1)：7-12.

[15] Petersen T N，Brunak S，Von Heijne G，et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods，2011，8(10)：785-786.

[16] 徐 麗，陳 新，宗曉娟，等. 甜櫻桃砧木PcDHN1的克隆及其對非生物脅迫的響應[J]. 核農學報，2017，31(1)：14-20.

[17] 董慧霞，理永霞，賈秀貞，等. 楊樹SABP2基因的克隆與分析[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2017，45(3)：82-88，95.

[18] Ma W，Noble W S，Bailey T L. Motif-based analysis of large nucleotide data sets using MEME-ChIP[J]. Nature Protocols，2014，9(6)：1428-1450.

[19] Jiang X Q，Zhang C Q，Lu P T，et al.RhNAC3，a stress-associated NAC transcription factor，has a role in dehydration tolerance through regulating osmotic stress-related genes in rose petals[J]. Plant Biotechnology Journal，2014，12(1)：38-48.

[20] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods，2001，25(4)：402-408.

[21] 鄭伶杰，馬 宏，張 媛，等. 蘋果矮化砧木GA20氧化酶基因的克隆及其表達分析[J]. 華北農學報，2017，32(1)：53-59.

[22] Lin J R，Hu J. SeqNLS：nuclear localization signal prediction based on frequent pattern mining and linear motif scoring[J]. PLoS One，2013，8(10)：e76864.

[23] 王 云，任永兵，楊 碩，等. 擬南芥AtMYB61基因的克隆及表達載體構建[J]. 合肥工業大學學報：自然科學版，2011，34(5)：757-761.

[24] 朱 寧. MYB類轉錄因子OsMYB91在水稻發育和抗逆中的功能研究[D]. 武漢：華中農業大學，2014.

[25] Cai H，Tian S，Dong H，et al. Pleiotropic effects ofTaMYB3R1 on plant development and response to osmotic stress in transgenicArabidopsis[J]. Gene，2015，558(2)：227-234.

[26] 楊文杰，吳燕民，唐益雄. 大豆轉錄因子基因GmMYBJ7的表達及功能分析[J]. 華北農學報，2012，27(6)：24-29.

[27] Ma N，Cai L，Lu W，et al. Exogenous ethylene influences flower opening of cut roses (Rosahybrida) by regulating the genes encoding ethylene biosynthesis enzymes[J]. Science in China Series C-life Sciences，2005，48(5)：434-444.

[28] 譚 輝. 外源乙烯通過調節乙烯受體和信號轉導元件基因表達影響月季切花開放[D]. 北京：中國農業大學，2005.

[29] Nakano R，Ogura E，Kubo Y，et al. Ethylene biosynthesis in detached young persimmon fruit is initiated in calyx and modulated by water loss from the fruit[J]. Plant Physiology，2003，131(1)：276-286.

[30] 王 婷，仝 征，馬 男，等. 切花月季Rh-DREB1基因的克隆及其在乙烯和失水脅迫下的表達[J]. 園藝學報，2009，36(1)：65-72.

CloningandExpressionCharacteristicsofRhMYB61GenefromRosahybrida

LI Shaocui，JIANG Xinqiang，DING Aiqin，LIU Qingchao，WANG Kuiling，LI Wei，LIU Qinghua

(College of Landscape Architecture and Forestry，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

In order to determine the molecular characterization and expression patterns of MYB transcription factors involved in flower opening in Rose. According to the expressed sequence tags from transcriptome assembly and RACE PCR methods，we obtained a new MYB transcription factor gene，and namedRhMYB61(GenBank accession number is KY921844 )，inRosahybridaSamantha petals. The ORF ofRhMYB61 was 1 323 bp，which encoded 441 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the molecular weight and theoretical isoelectric point of RhMYB61 was 49.1 kDa and 7.66，respectively，and the formula of RhMYB61 was C2123H3280N620O688S18. Phylogenic tree analysis showed that RhMYB61 was clustered with PpMYB86 and EjMYB8，and belonged to the R2R3-MYB type transcription factor. Multi-alignment of RhMYB61 of several plants found that RhMYB61 had the seven characteristic conservative motifs.Two conserved domains，including R2-MYB domain and R3-MYB domain，were found in its N-terminal. The nuclear localization sites was found in R3-MYB domain. Qualitative PCR analysis showed thatRhMYB61 expression was induced as the rose flower opening.RhMYB61 expression was accumulated at 12 h dehydration treatment，compared with control. In addition，RhMYB61 transcript was rapidly and dramatically induced by 6,12,24 h ethylene treatment compared with control，and was inhibited following 1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment.These results above gave a clear data for understanding the biological function ofRhMYB61， and provided a foundation for further research of molecular breeding of rose plant.

Cut roses；RhMYB61；qRT-PCR；Expression characteristics

2017-07-21

國家自然科學基金項目(31501798)；山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金項目(2014BSB01563)

李紹翠(1992-)，女，山東招遠人，在讀碩士，主要從事園林植物種質資源創新和利用研究。

劉慶華(1962-)，男，山東乳山人，教授，博士，博士生導師，主要從事園林植物種質資源創新及園林植物種植設計研究。

Q78；S685.03

A

1000-7091(2017)05-0061-08

10.7668/hbnxb.2017.05.010