基于花椒轉錄組序列SSR分子標記開發及花椒種質鑒定

李立新，司守霞，魏安智，劉玉林，馮世靜 ，楊途熙

(1.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；2.河南林業職業學院，河南 洛陽 471002)

基于花椒轉錄組序列SSR分子標記開發及花椒種質鑒定

李立新1，司守霞2，魏安智1，劉玉林1，馮世靜1，楊途熙1

(1.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；2.河南林業職業學院，河南 洛陽 471002)

為拓展分子標記在花椒種質資源分析中的應用、開發花椒EST-SSR功能性分子標記、分析花椒DNA指紋圖譜，利用鳳縣大紅袍花椒的莖尖節點轉錄組cDNA數據庫中45 057條長度大于200 bp的非冗余 Unigene序列，使用MIcroSAtellite(MISA)軟件搜索SSR位點，分析花椒cDNA序列中SSR位點的頻率和密度、SSR重復基元種類及比例、SSR重復次數與數量等分布特征；用Primer 3.0軟件在線設計SSR引物并經PCR擴增篩選適合的多態性引物；用Quantity One軟件統計多態性條帶和分子量大小；NTsys 2.0軟件分析12份花椒種質的遺傳距離、構建樹狀聚類圖及DNA指紋圖譜庫。結果表明，45 057條序列中有3 315 條Unigene序列包含SSR位點，共3 814個，3 315條序列中SSR位點出現頻率為7.07%；在檢索出的 SSR位點中，二核苷酸、三核苷酸是主要重復類型，分別占29.42%和58.58%，二核苷酸重復中以AG/TC、CT/GA 出現頻率最高，三核苷酸重復中GAA/CTT、AGA/TCT出現頻率最高；二、三、四、五、六核苷酸重復基元總數隨著重復次數的增加呈明顯下降趨勢。利用Primer 3.0設計的64對EST-SSR引物中，55對引物能產生預期片段大小的 PCR 產物，其中18對引物具有多態性；利用18對引物對12份花椒種質進行PCR擴增，共產生81條擴增條帶，其中多態性條帶73條，多態率為90.12%；各花椒種質的遺傳相似系數為0.552 6～0.894 7，平均為0.725 0；經UPGMA聚類分析在相似系數0.70處12份花椒種質共分為3類，即頂壇花椒為Ⅰ類、竹葉椒為Ⅱ類、其他花椒為Ⅲ類；指紋圖譜分析中，8對引物在5份種質中能擴增出特征帶型，最少用3對引物進行組合即可將12份花椒種質區分開。成功在鳳縣大紅袍花椒的莖尖節點轉錄組cDNA 序列中開發SSR標記，設計并篩選出8對能擴增出特征帶型的引物，最少用3對引物進行組合即可將12份花椒種質區分開，這為今后花椒遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等方面提供新的引物序列并奠定了基礎。

花椒；EST-SSR；引物開發；指紋圖譜

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)為蕓香科花椒屬植物，是我國的特色辛香料和中藥材，也是目前退耕還林中重要的生態型山地栽培經濟樹種[1]。花椒為單性結實，無融合生殖率較高[2]，因此遺傳穩定性較高，這對花椒的良種選育提供了有力的理論依據。目前關于花椒的研究主要集中在花椒精油提取與分析、成分功能及開發利用等方面[3-5]，在DNA分子水平上對花椒的研究雖然已有RAPD[6]、ISSR[7]、SRAP[8]及轉錄組測序[9]等方面的報道，但尚未見有關EST-SSR的報道。

EST-SSR(Expressed sequence tag based simple sequence repeat)是基于EST序列或cDNA數據開發的一種標記[10]；它來源于功能基因，可直接反映功能基因的多樣性，具備基因組SSR標記的優點和引物開發成本低、通用性好等特點，而且與生理生化特征和某些形態特征相關聯[11]；現已廣泛應用在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建及分子標記輔助育種等方面的研究[12]。該標記已在小麥[10-13]、柑橘[14-15]、枳殼[16]、蘋果[17-19]等植物中得到開發和應用。近年來，隨著生物技術的進展，基于EST序列的SSR標記的開發也在日趨增加[20]，收錄的EST數目也由1991年的不足2 000條發展到2010年的65 255 769條(共涉及1 978個物種)，目前，NCBI數據庫中收錄的植物EST的數量已多達76 165 384條。

但是，迄今為止NCBI數據庫中收錄的花椒EST 序列數量還很少，可供選擇性范圍較小；鑒于此，本試驗對獲得的花椒cDNA數據庫中非冗余序列進行了SSR信息發掘和EST-SSR標記引物開發，分析了花椒指紋圖譜，希望能為花椒EST-SSR分子標記的研究、遺傳圖譜構建及品種鑒定、良種選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1試驗材料

轉錄組序列樣本材料為鳳縣大紅袍花椒的莖尖節點，共包含45 057條 Unigenes序列。SSR擴增所用花椒樣品(種質)來源于國家林業局花椒工程技術研究中心鳳縣花椒試驗示范站 (表1)。

選擇生長良好、無病蟲害的植株進行采樣。每個樣品取5株重復。采樣時，采集不同花椒種質的新鮮嫩葉，用冰袋保鮮，帶回實驗室置于-70 ℃冷凍保存備用。

1.2試驗方法

1.2.1 花椒基因組DNA提取 試驗方法參照李曉等[21]的CTAB法對花椒嫩葉進行基因組DNA提取，取1.5 μL 所提取的DNA 于超微量核酸分析儀上測定其在紫外光波長260，280 nm處的吸光比值以檢測所提取DNA的純度和DNA濃度。將基因組DNA于-20 ℃保存，用于后續SSR-PCR分析。

1.2.2 序列搜索及SSR位點查找 cDNA序列來源于蔣弘剛等[9]使用二代高通量測序技術獲得的鳳縣大紅袍花椒莖尖節點轉錄組測序數據，以組裝出來的 Unigene 作為參考序列，使用 MIcroSAtellite(MISA)軟件找出所有的 SSR位點[22]。本試驗SSR位點的查找參照劉博等[23]SSR位點搜索的標準：二、三、四、五、六核苷酸重復基元的重復次數分別大于或等于6，5，4，4，3次；一般查找到的SSR重復基元的重復次數越多，相關的多態性也就越高[24]，并分析 SSR 在cDNA序列中的分布特征。

表1 花椒試驗材料Tab．1 Zanthoxylum bungeanum accessions used in this study

1.2.3 EST-SSR引物設計 引物設計參照崔海榮等[25]引物開發的方法和原則：cDNA序列的長度大于100 bp；選擇二、三、四、五、六核苷酸重復基元的重復次數分別大于或等于10，6，5，5，4 次的序列且SSR位點的開始和結束位置距5′和3′端均不少于50 bp；引物GC 含量為40%～60%，最佳為50%；退火溫度為50～ 60 ℃，最佳溫度為55 ℃，上下游引物相差不大于5 ℃；引物長度為 18～25 bp，最佳為20 bp；PCR擴增產物長度100～500 bp；應盡量避免引物二聚體(Dimer)、發夾結構(Hairpin)以及連續6個堿基配對的出現；用Primer 3.0[26]軟件在線設計SSR 側翼區域引物，其他參數采用默認值。引物設計時先用中括號將 SSR 位點括起來，以確保產物序列中包括 SSR 位點。引物由生工生物工程(上海)公司合成。

1.2.4 PCR擴增及多態性引物篩選及檢測 本試驗PCR反應體系為：總體積為20 μL：包含10 μL 2×TaqMasterMix(CWBIO北京生物技術有限公司(中國)有限公司)，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，雙蒸水7 μL和基因組DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR循環參照Feng 等[8]的程序。擴增產物用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳[25]、0.5×TBE的緩沖液、穩壓250 V、室溫電泳4 h、銀染顯色、膠片觀察燈照相觀察的方法進行檢測。

1.2.5 數據處理 選取可重復且清晰可辨的擴增條帶，有譜帶計為1，無譜帶計為0，構建初始數據矩陣，計算擴增條帶和多態性條帶及比率；用NTSYS-pc2.10e軟件[27]SimQual 程序求 Jaccard 相似系數，用SHAN 程序中的 UPGMA(非加權平均法)進行聚類分析。并通過 Treeplot模塊生成聚類圖，并對其進行Cophenetic相關性檢驗；使用POPGENE[28]軟件計算花椒種質的遺傳多樣性指標，觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei′s遺傳多樣性(H)以及Shannon′s信息指數(I)；根據條帶特征分析花椒DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1花椒cDNA序列SSR位點分布特征

2.1.1 花椒EST-SSR頻率和密度 在鳳縣大紅袍花椒莖尖節點轉錄組測序及數據分析得到的cDNA 序列中，長度大于200 bp的非冗余Unigene序列共45 057條，其總長度約為32.5 Mbp，平均長度為610 bp；在全部的 Unigene 序列中有3 315條包含簡單重復序列，占全部序列的 7.36%，其中422 條包含2個及2個以上簡單重復基元的序列，占全部序列的0.94%；在全部非冗余序列中共檢測到3 814個SSR位點，SSR的出現頻率為 7.07%，平均分布距離約7.2 kb，花椒的SSR位點分布距離比楊樹(Populus)14.0 kb[29]、杜仲11.6 kb[30]、銀杏(Ginkgobiloba) 12.02 kb[31]的要大，比柑橘(Citrus) 5.7 kb[32]、茶樹(Camelliasinensis) 3.68 kb[33]、橡膠樹(Heveabrasiliensis)3.93 kb[34]等木本植物的分布距離要小。

2.1.2 花椒EST-SSR重復基元及比例 在獲得的SSR位點中，二-六核苷酸重復基元都能被檢出，但出現的頻率有明顯的差異。其中，二、三、四、五、六核苷酸重復基元分別有 5，31，29，42，175共5種類型(表2)。SSR重復類型最多的為三核苷酸，共有1 866個，占全部SSR的58.58%，出現頻率為4.14%；其次是二核苷酸重復類型，共有937個，占全部SSR的29.42%，出現頻率為2.08%；五核苷酸重復類型出現頻率較低，共64個，占全部SSR總數的2.01%，出現頻率0.14%。可見，在花椒SSR位點中，二、三核苷酸重復類型占主導地位(圖1-A)。

在含有二核苷酸重復基元的花椒 EST 序列中，AG/TC和CT/GA在二核苷酸重復基元，分別占二核苷酸總數的42.53%和37.81%，所占比例最高；在花椒三核苷酸重復基元中，GAA/CTT基序出現頻率最高，其次為AGA/TCT和ACT/TGA，這3類重復基元占三核苷酸重復類型總量的33.58%，27.03%和13.69%(圖1-B、C)。

表2 花椒EST-SSR類型及分布頻率Tab.2 Repeat types and frequency of the EST-SSR in Zanthoxylum bungeanum

A.核苷酸重復類型及比例；B.二核苷酸重復中不同重復基元所占比例；C.三核苷酸重復中不同重復基元所占比例；D.不同 SSR 重復基元的數量與其重復次數。A.The nucleotide repeat type and proportion；B.The proportion of different repeating primers in the dinucleotide repeats；C.The proportion of different repeat motifs in trinucleotide repeats；D.The number of repetitive primitives for different SSRs and their number of repetitions.

在四核苷酸重復基元中AAGA/TTCT和ATAC/TATG基序出現頻率最高，分別占四核苷酸總數的14.29%和10.00%。五核苷酸基元中TTCTT/AAGAA出現頻率最高，出現5次，出現頻率為7.81%；六核苷酸重復基元中GCAACA/CGTTGT出現頻率最高，出現7次，出現頻率為2.82%。

2.1.3 花椒EST-SSR重復次數與數量 由圖1-D可知，不同SSR重復基元的數量與其重復次數的統計結果表明：重復基元的重復次數在4～12次，二核苷酸重復次數種類最多，重復次數在6～12次；六核苷酸重復次數種類最少，只有重復次數4次這一種；在所有重復基元中以5次重復的核苷酸最多，占SSR總數的29.98%；另外，在重復基元相同時，隨著重復基元重復次數(或 SSR 長度)的增加，EST-SSR 的數量減少，隨著重復次數的增加，二、三、四、五核苷酸重復基元的數量和重復基元總數均呈明顯下降趨勢。

2.2花椒DNA提取及SSR產物有效性檢測

本試驗所提取樣本 DNA 吸光度比值OD260/280均為1.8～2.0，試驗結果表明，CTAB法能提取到純度較高的DNA。本試驗隨機挑選了符合篩選條件的序列，用Primer 3.0在線設計了包括二、三、四、五、六核苷酸重復基元的SSR位點在內的共64 對引物來檢測所發掘出的 EST-SSR 標記的可利用性。以12份花椒材料DNA 為模板對64對SSR引物進行多態性引物及其最適 PCR 退火溫度的篩選。其中，55對引物能擴增出理想產物，擴增產物大小符合預期；其中18對引物能擴增出多態性條帶(表3)，占可擴增出的34.55%，占設計引物總數的29.68%。18對引物共擴增出81條清晰可見的條帶，其中多態性條帶73條，平均多態率為90.12%，DNA片段大小為120～300 bp，平均每對引物的擴增條帶數為4.5條。多態性引物所對應的重復基元結果表明：二核苷酸重復類型有1個，三核苷酸重復類型8個，四核苷酸重復類型有6個，五核苷酸重復類型有1個，六核苷酸重復類型有2個。說明利用花椒EST序列開發EST-SSR標記是高效可行的。

表 3 花椒 18 對 EST-SSR 引物信息Tab.3 Information of 18 pairs of EST-SSR primers from Zanthoxylum bungeanum Maxim

2.3花椒種質間遺傳多樣性分析

花椒的遺傳相似系數結果表明：各花椒種質間遺傳相似系數為0.552 6～0.894 7，平均為0.725 0。其中頂壇花椒與油椒、頂壇花椒與竹葉椒、無刺花椒與竹葉椒之間的遺傳相似系數最小均為0.552 6，鳳縣大紅袍與武都大紅袍、山西盂縣大紅袍與黃金椒之間的遺傳相似系數最大均為0.894 7。遺傳相似系數能很好地體現了花椒種質之間的親緣關系(表4)，且12份花椒種質總的觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei′s遺傳多樣性H以及Shannon′s信息指數(I)分別為1.763 2，1.399 3，0.240 1，0.367 9，結果表明花椒種質具有較強的遺傳多樣性[35]。

表4 12份花椒種質的遺傳相似系數Tab.4 Genetic similarity coefficient of 12 Zanthoxylum varieties

用NTSYS-pc2.10軟件UPGMA法得聚類分析樹狀圖(圖2)。由圖2可知，在相似系數為0.70處，所有的花椒樣品可以聚為3類：頂壇花椒為第Ⅰ類，竹葉椒為第Ⅱ類，其他花椒為第Ⅲ類。該結果與Feng等[8]報道的結果一致，說明所開發的花椒EST-SSR是高效可行的。

圖2 基于SSR標記的12份花椒種質聚類圖Fig.2 Cluster result of 12 Zanthoxylum varieties based on SSR markers

聚類分析的相關性檢驗結果見圖3：相關性分析r=0.89，t=6.56，P=1.00，說明遺傳是正相關，即遺傳相似系數越大，親緣關系越近，說明試驗結果是可靠的。

圖3 聚類分析的相關性Fig.3 Correlation analysis of cluster analysis

2.4花椒指紋圖譜分析

采用以上18對引物對12份花椒種質進行指紋分析，5份種質具有特征譜帶(表5)，僅用1個特征引物即可與其他種質區分開。其中，無刺花椒、鳳縣大紅袍、漢源花椒具有 1 個特征引物，頂壇花椒具有2個特征引物，竹葉椒具有 4個特征引物。引物FX-27在頂壇花椒、鳳縣大紅袍上均表現出特征譜帶，表明該引物不僅多態性豐富，且特征譜帶也多，在進行品種指紋鑒定時可優先采用(圖4)。從18對引物中挑選多態性相對豐富的引物進行組合鑒別，選擇FX-15、FX-27和FX-40以及FX-60、FX-40和FX-15 2組引物進行組合，根據特征引物對應特定種質所擴增出的特征條帶的相對位置可以將12份花椒種質完全區分開。

表5 具有特征譜帶的花椒種質及對應引物Tab.5 Corresponding primers with specific amplifications for Zanthoxylum varieties

圖4 引物 FX-27對 12 份花椒種質的擴增結果Fig. 4 DNA fragments amplified by SSR primer FX-27 in 12 Zanthoxylum varieties

3 討論與結論

3.1花椒cDNA序列SSR位點特征分析

本試驗所得花椒的SSR位點出現頻率為7.07%，低于同科植物柑橘EST-SSRs出現頻率(21.73%)，高于枳殼EST-SSRs出現頻率(2.96%)，造成這種位點差異的原因：一可能由于基因組中轉錄部分的比例及低拷貝序列出現的頻率不同、基因組大小不同、重復DNA序列所占的比例不同，二可能是由于搜索SSR位點的標準(SSR重復類型、長度等)不同等原因[36]，如李小白[37]研究發現把油菜(Brassicanapus)EST-SSR 最小SSR長度標準由12 bp增加到20 bp，EST-SSR 的頻率從15. 58%降低到11. 61%。

本研究發現，三核苷酸是SSR重復基元中的主導類型，且出現頻率最多的是(GAA/CTT)n，這與對同科植物柑橘[38]、甜橙[39]中的研究結果一致。從目前報道的各類研究論文結果來看，大多數植物EST-SSRs的主導重復基元都是以二、三核苷酸為主，但主導重復基元的類型不同。以二核苷酸為主導重復基元的植物主要有獼猴桃[40]、茶樹[41]、白菜等[42]；以三核苷酸為主導重復基元的植物有水稻[43]、葡萄[44]、百合[45]等。這是因為EST序列大部分由外顯子組成，是表達序列，且功能單位密碼子是由3個核苷酸組成，在轉錄翻譯成蛋白質的過程中會產生移碼突變使三核苷酸發生位移，但是在基因表達的過程中不會影響表達基因的閱讀框的位移[46]。在谷類作物的相關研究中已經驗證了該理論[47]，本研究與前人研究結果一致。

3.2花椒SSR引物多態性分析

18對多態性引物所對應的重復基元中，二核苷酸重復基元有1個，三核苷酸重復基元有8個，四核苷酸重復基元有6個，五核苷酸重復基元有1個，六核苷酸重復基元有2個。有研究發現，多態性與SSR重復基元的長度有關。由短重復基元組成的SSR獲得(或失去)重復基元的速率要比長重復基元組成的SSR快，將具有更高的多態性[48]，本試驗結果與前人研究結果是一致的。早在2002年，Eujayl[49]通過對來自基因組和 EST 數據庫的 SSR 多態性的比較，就發現了來自 EST 數據庫的 SSR 多態性(25%)低于來自基因組的 SSR 多態性(53%)，本試驗獲得了與Eujayl同樣的結果。

從本試驗的研究結果來看，花椒EST-SSRs出現頻率較高，且類型豐富；所建立的cDNA數據庫中的序列也具有較高的可用性，所設計引物的多態性較高而且可信。EST-SSR具有引物開發成本低、信息含量豐富、應用范圍廣泛等優點。本試驗研究結果為花椒EST-SSR標記鑒定了基礎，豐富了花椒分子標記類型，篩選出EST-SSR引物可用于花椒遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等，為花椒的開發利用奠定基礎。

3.3花椒遺傳多樣性分析

3.3.1 花椒相似性系數分析 相似系數也稱為遺傳一致度，是衡量品種之間遺傳關系遠近的一個重要參數，通過遺傳相似系數能對個體或品種間親緣關系遠近有一個大概的了解。相似系數分析結果表明：不同地理來源的花椒遺傳相似系數差異較大，為0.552 6～0.894 7，說明花椒種質之間的遺傳多樣性還是很豐富的，Nei′s遺傳多樣性H也支撐了這個結論，本試驗材料遺傳背景比較復雜，這可能是因為花椒無融合生殖、單性結實的特點造成的；其中頂壇花椒、竹葉椒與其他花椒之間的遺傳相似系數小，即青花椒與紅花椒之間遺傳相似系數小。本試驗結果與前人研究結果一致[50]。

3.3.2 花椒聚類結果分析 由基于SSR標記建立的不同來源的花椒種質樹狀聚類圖可知：所有供試材料的遺傳距離都大于零，又能夠聚類在一起，說明不同花椒種質之間既有相同遺傳背景但又相互之間存在著差異。樹狀圖顯示不同花椒種質的遺傳距離為0.64～0.89，在遺傳距離0.70處除頂壇花椒和竹葉椒之外，其他紅花椒聚為一類，說明紅花椒之間的親緣關系較近。在聚類圖上不同花椒種質相互交錯排布，即來自同一省份的花椒與來自其他省份的花椒相互交織，花椒間的遺傳距離與其生長的實際地理位置之間的關系不明顯，是因為不同省份之間由于長期的引種過程造成品種的變異，所以出現這種結果。

3.4花椒指紋圖譜分析

DNA 指紋圖譜分析主要有 3 種方法，即引物組合法、特征譜帶法與核心引物組合法[51]。本研究中，8對引物在5份花椒種質上具有特征譜帶，僅用1對特征引物即可鑒別相應的種質，在進行DNA指紋檢測時，使用起來簡單方便。本研究中，只有少部分種質具有特征引物，需進行大量的引物篩選工作獲取其他種質的特征引物，隨著種質范圍的擴大，原來在某種質上表現為特征帶的引物，有可能在其他種質上出現相同帶型，即所謂特征譜帶是相對的，只有在固定的材料范圍內有效，鑒別能力相對有限。引物組合法通過不同引物的有限組合，可以在很大程度上提高引物的鑒別能力，本研究采用3對引物組合進行鑒別可將12份花椒完全區分開，隨著種質資源數量的進一步增加，這3對引物組合的鑒別能力可能會逐漸減低，可根據實際檢測情況適當增加引物組合的數量。

3.5結論

在花椒cDNA全部非冗余序列中共檢測到3 814個SSR位點。在花椒SSR位點中，二、三核苷酸重復類型占主導地位，其中：TC/AG和CT/GA基序在二核苷酸重復基元中所占比例最高，GAA/CTT基序在三核苷酸重復基元中出現頻率最高；不同SSR重復基元的重復次數在4～12次，隨著重復次數的增加，二、三、四、五核苷酸重復基元的數量和重復基元總數均呈明顯下降趨勢；利用花椒 EST 序列開發 EST-SSR 標記高效與可行；指紋圖譜分析中，8對引物在5份種質中能擴增出特征帶型，最少用3對引物進行組合即可將12份花椒種質區分開。本研究成功開發花椒EST-SSR標記，并應用于花椒遺傳多樣性研究和指紋圖譜構建中，表明利用花椒轉錄組數據開發SSR標記是可行的，本研究開發的引物將為花椒遺傳多樣性分析、育種群體的建立、分子標記輔助育種等奠定基礎。

[1] 畢 君，王春榮，趙京獻，等. 北方花椒主產區種質資源考察報告[J]. 河北林果研究，2003，18(2)：165-168.

[2] 王雙貴，趙京獻，畢 君，等. 國內外花椒的研究現狀及其發展趨勢[J]. 內蒙古林業科技，2003(2)：32-34.

[3] 白小鳴，王 華，曾小峰，等. 氣相色譜-質譜法結合保留指數對比初步分析梁平柚麻味物質的組成成分[J]. 食品科學，2015，18(36)：103-107.

[4] 楊 靜，趙 鐳，史波林，等. 青花椒香氣快速氣相電子鼻響應特征及GC-MS物質基礎分析[J]. 食品科學，2015，36(22)：69-74.

[5] 游玉明，任文瑾，劉慶慶，等. 花椒精有效成分對高脂膳食大鼠脂質代謝的影響[J]. 營養學報，2015(3)：288-293.

[6] 鄭海星，李周岐，薛惠丹，等. 花椒種質資源的RAPD分析[J]. 西北林學院學報，2011，26(2)：96-100.

[7] 漢素珍，王有科，李 捷，等. 甘肅省主產花椒品種ISSR遺傳多樣性分析[J]. 甘肅農業大學學報，2011，46(6)：46-51.

[8] Feng S J，Yang T X，Liu Z S，et al. Genetic diversity and relationships of wild and cultivatedZanthoxylumgermplasms based on sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2015，62(8)：1193-1204.

[9] 蔣弘剛，魏安智，楊途熙，等. 花椒莖尖節點轉錄組測序及基因注釋[J]. 西北林學院學報，2014，29(6)：94-99.

[10] 潘海濤，汪俊君，王盈盈，等. 小麥EST-SSR標記的開發和遺傳作圖[J]. 中國農業科學，2010，43(3)：452-461.

[11] 孟清照，李仕金，董轉年，等. SSR引物開發方法概述[J]. 大眾科技，2007(12)：116-117，107.

[12] 楊東娟，馬瑞君. SSR分子標記在作物遺傳多樣性研究中的應用現狀[J]. 甘肅科技，2007，23(8)：99-102.

[13] Zhuang L F，Song L X，Feng Y G，et al. Development and chromosome mapping of new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added in wheat[J]. Acta Agronomica Sinica，2008，34(6)：926-933.

[14] Chai L J，Biswas M K，Yi H L，et al. Transferability，polymorphism and effectiveness for genetic mapping of the Pummelo (CitrusgrandisOsbeck) EST-SSR markers[J]. Scientia Horticulturae，2013，155(155)：85-91.

[15] 曾柏全，鄧子牛，熊興耀，等. 湖南寬皮柑橘EST-SSR反應體系研究[J]. 中國農學通報，2009，25(21)：244-247.

[16] 楊春霞，溫 強，葉金山，等. 枳殼EST-SSR標記的開發[J]. 分子植物育種，2011(1)：123-127.

[17] Yao L H，Zheng X Y，Cai D Y，et al. Exploitation ofMalusEST-SSRs and the utility in evalution of genetic diversity inMalusandPyrus[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2010，57(6)：841-851.

[18] 張俊娥. 蘋果EST中微衛星分析[J]. 廣西農業生物科學，2008，27(4)：378-380.

[19] Celton J M，Tustin D S，Chagné D，et al. Construction of a dense genetic linkage map for apple rootstocks using SSRs developed fromMalusESTs andPyrusgenomic sequences[J]. Tree Genetics & Genomes，2009，5(1)：93-107.

[20] 許玉蘭，蔡年輝，康向陽，等. EST-SSR標記的開發及其在木本植物中的分布特點[J]. 中國農學通報，2012，28(4)：1-7.

[21] 李 曉，楊途熙，魏安智，等. 花椒DNA提取方法的研究[J]. 北方園藝，2011(7)：130-132.

[22] Mortazavi A，Williams B A，Mccue K，et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J]. Nature Methods，2008，5(7)：621-628.

[23] 劉 博，邵艷卿，滕爽爽，等. 縊蟶(Sinonovaculaconstricta)EST-SSR分布特征及引物開發利用[J]. 海洋與湖沼，2012，43(1)：132-137.

[24] 曾慶國，陳藝燕. 微衛星位點篩選方法綜述[J]. 生態科學，2005，24(4)：368-372.

[25] 崔海榮，劉金義，佟兆國，等. 砂梨EST-SSR引物開發及其應用[J]. 西北植物學報，2010，30(8)：1551-1556.

[26] Rozen S，Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers[J]. Methods in Molecular Biology，2000，132(3)：365-386.

[27] Rohlf F J. NTSYSpc：numerical taxonomy and multivariate analysis system，version2.02.[M].New York:Exeter software，1998：2010-2015.

[28] Yeh F C，Yang R C，Boyle T B，et al. POPGENE，the user-friendly shareware for population genetic analysis[M]. Edmonton:University of Alberta，1997.

[29] Cardle L，Ramsay L，Milbourne D，et al. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants[J]. Genetics，2000，156(2)：847-854.

[30] 黃海燕，杜紅巖，烏云塔娜，等. 基于杜仲轉錄組序列的SSR分子標記的開發[J]. 林業科學，2013，49(5)：176-181.

[31] 樊洪泓，李廷春，李正鵬，等. 銀杏EST序列中微衛星的分布特征[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28(5)：869-873.

[32] Chen C，Zhou P，Choi Y A，et al. Mining and characterizing microsatellites fromCitrusESTs[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，112(7)：1248-1257.

[33] 楊 華，陳 琪，韋朝領，等. 茶樹轉錄組中SSR位點的信息分析[J]. 安徽農業大學學報，2011，38(6)：882-886.

[34] 安澤偉，趙彥宏，程 漢，等. 橡膠樹EST-SSR標記的開發與應用[J]. 遺傳，2009，31(3)：311-319.

[35] 吳岐奎，邢世巖，王 萱，等. 核用銀杏品種遺傳關系的AFLP分析[J]. 園藝學報，2015，42(5)：961-968.

[36] Morgante M，Hanafey M，Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes[J]. Nature Genetics，2002，30(2)：194-200.

[37] 李小白. 油菜(BrassicanapusL.)EST-SSR標記的開發及應用研究[D]. 杭州：浙江大學，2007.

[38] Zhuang L. Development and chromosome mapping of 81 new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added in wheat[J]. Acta Agronomica Sinica，2008，34(6)：926-933.

[39] Chen C A. Mining and characterizing microsatellites fromcitrusESTs[J].Theoretica and Applied Genetics，2006，7(112)：1248-1257.

[40] Fraser L G，Harvey G H，Crowhurst R N. et al. EST-derived microsatellites fromActinidiaspecies and their potential for mapping [J].Theoretical and Applied Genetics,2004，108(6)：1010-1016.

[41] 王麗鴛，姜燕華，段云裳，等. 茶樹EST-SSRs分布特征及引物開發[J]. 植物遺傳資源學報，2009，10(4)：511-516.

[42] 忻 雅，崔海瑞，張明龍，等. 白菜EST-SSR標記的通用性[J]. 細胞生物學雜志，2006，28(2)：248-252.

[43] Kantetyr V，Larotam L，Matthewsd E，et al. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley，maize，rice，sorghum and wheat[J]. Plant Molecular Biology，2002，48(5-6)：501-510.

[44] Cordeiro G M，Casu R，Mcintyre C L，et al. Microsatellite markers from sugarcane (Saccharumspp.) ESTs cross transferable to erianthus and sorghum[J]. Plant Science，2001，160(6)：1115-1123.

[45] 楊素麗，明 軍，劉 春，等. 基于EST信息的百合SSR標記的建立[J]. 園藝學報，2008，35(7)：1069-1074.

[46] Metzgar D，Bytof J，Wills C. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA[J]. Genome Research，2000，10(1)：72-80.

[47] Gao L F，Jing R L，Huo N X，et al. One hundred and one new microsatellite loci derived from ESTs (EST-SSRs) in bread wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108(7)：1392-1400.

[48] 李淑嫻，張新葉，王英亞，等. 桉樹EST序列中微衛星含量及相關特征[J]. 植物學報，2010，45(3)：363-371.

[49] Eujayl I,Sorrells M E,Baum M,et al. Isolation of EST-derived microsatellite marker for genotying the A and B genomes of wheat[J].Theor Appl Genet，2002,104(2-3)：399-407.

[50] Thiel T，Michalek W，Varshney R K，et al. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley (HordeumvulgareL.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106(3)：411-422.

[51] 王鳳格，趙久然，郭景倫，等. 比較三種DNA指紋分析方法在玉米品種純度及真偽鑒定中的應用[J]. 分子植物育種，2003，1(5)：655-661.

StudyonDevelopmentofSSRMolecularMarkersBasedonTranscriptomeSequencingandGermplasmIdentificationinZanthoxylumGermplasm

LI Lixin1，SI Shouxia2，WEI Anzhi1，LIU Yulin1，FENG Shijing1，YANG Tuxi1

(1.Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100，China；2.Henan Forestry Vocational College，Luoyang 471002，China)

To improve the application of molecular markers in theZanthoxylumgenus，the stuty developed functional EST-SSR markers and analyzed DNA fingerprint ofZanthoxylumgermplasm.Microsatellite software was used to scan the SSR loci from 45 057 non-redundant Unigenes among length above 200 bp derived from the node tissue of stem tip transcriptome sequences ofZanthoxylumbungeanumMaxim Fengxiandahongpao. Then the frequency and density of SSR loci，the type and proportion of SSR motifs and the number of SSR repetitions were also analysed. The SSR primers were then designed by Primer 3.0 online and polymorphic primer were screened by PCR；the polymorphic bands and molecular size were evaluated by using Quantity One software；the genetic distance and clustering map were analyzed by using software NTsys 2.0 and then constructed Fingerprints by Quantity One. The results showed that 3 315 Unigene sequences contained a total of 3 814 SSR loci(7.07%) and the dinucleotide repeat and trinucleotide repeat were the main types and accounted for 29.42% and 58.58% of the total SSRs，respectively. Among dinucleotides，AG/TC and CT/GA were the most frequent repeats；among trinucleotides，GAA/CTT and AGA/TCT appeared high frequency；with the increased of the number of repetition，the total number of repeat motifs showed a clear downward trend. 64 pairs of SSR primers were designed and 55 primer pairs were successfully amplifying DNA fragments. Out of 55 primer pairs，18 pairs of polymorphic primer were used for PCR amplification in 12Zanthoxylumgermplasm. A total of 81 clear bands were amplified and the percentage of polymorphic bands was 90.12%.Genetic similarity coefficients of eachZanthoxylumgermplasm among 0.552 6-0.894 7，with an average of 0.725 0. The UPGMA clustering showed that all theZanthoxylumgermplasm was divided into three main groups at the similarity coefficient 0.70：(Ⅰ)ZanthoxylumarmatumDC，(Ⅱ)ZanthoxylumbungeanumMaxim，and (Ⅲ)Zanthoxylumplanispinumvar. dingtanensis；In the fingerprint analysis，8 pairs of primers could amplify characteristic bands on 5Zanthoxylumgermplasms and 3 pairs of primers could be used to separate the 12Zanthoxylumgermplasm at least. We successfully developed SSR markers in the node tissue of stem tip transcriptome sequences ofZanthoxylumbungeanumMaxim Fengxiandahongpao. 8 pairs of primers could amplify characteristic bands were designed and screened，a minimum of 3 pairs of primers could be used to separate 12 pepper cultivars，these new EST-SSR markers fromZanthoxylumgermplasm provided a new primer sequence，basis for genetic analysis and fingerprint construction ofZanthoxylumgermplasm.

ZanthoxylumbungeanumMaxim；EST-SSR；Primer development；Fingerprint

2017-08-16

國家林業局林業公益性行業科研專項(201304706)；西北農林科技大學產業技術集成與示范推廣(TGZX 2016-08)；西北農林科技大學試驗示范站(基地)科技成果推廣專項(TGZX2015-46)

李立新(1990-)，女，河北滄州人，在讀碩士，主要從事林木遺傳育種研究。

楊途熙(1963-)，男，陜西楊凌人，教授，碩士，主要從事林木遺傳育種研究。

Q78；S573.03

A

1000-7091(2017)05-0069-09

10.7668/hbnxb.2017.05.011