甜菜雙向電泳體系條件的優化

張 輝，白 晨，王華忠，張惠忠，李曉東，付增娟，趙尚敏，鄂圓圓，張自強，王 良

(1.中國農業科學院，北京 100081；2.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.中國農業科學院 甜菜研究所，黑龍江 哈爾濱 150080)

甜菜雙向電泳體系條件的優化

張 輝1，2，白 晨2，王華忠3，張惠忠2，李曉東2，付增娟2，趙尚敏2，鄂圓圓2，張自強2，王 良2

(1.中國農業科學院，北京 100081；2.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.中國農業科學院 甜菜研究所，黑龍江 哈爾濱 150080)

為了獲得甜菜葉片雙向電泳中蛋白質最佳提取方法，建立甜菜葉片蛋白質雙向電泳最佳的雙向電泳體系。以甜菜葉片為材料，通過比較分析，研究甜菜葉片總蛋白提取方法、IPG膠條pH 值及其對應上樣量等因素對甜菜葉片蛋白質雙向電泳結果的影響。結果表明：酚提取法、TCA/丙酮提取法和可溶性蛋白提取法3種蛋白提取方法中TCA/丙酮法提取效果較好，pH值4～7與pH值5～8的雙向蛋白電泳比較發現：pH值4～7膠條蛋白點清晰且在圖譜上的蛋白點分布均勻，無蛋白點集中現象，更適合甜菜葉片的蛋白質組分析。采用7 cm 線性固相 IPG 膠條進行雙向電泳，150 μg上樣量蛋白點明顯增多，雙向電泳效果更好，pH值4～7的17 cm膠條300 μg上樣量膠點更多更清晰，試驗結果為甜菜蛋白質組學的研究提供了最佳的試驗方法。

甜菜；蛋白質提取方法；雙向電泳；體系優化

甜菜是二年生作物，重要的糖料作物之一，主要分布在黑龍江、內蒙古和新疆3個地區。國家將糧、棉、油、糖作為重要的戰略儲備物資，糖料也是關系國計民生的重要物資。蛋白質組學(Proteomics)一詞，源于蛋白質(Protein)與基因組(Genome)2個詞的雜合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。隨著蛋白質組學技術體系的不斷發展、不斷完善，植物蛋白質組學快速發展。甜菜作為重要的糖料作物之一，開展甜菜蛋白質組學研究對研究相關的抗逆、高產、含糖具有重要意義。國內報道了對甜菜M14品系花器官進行了特異性表達蛋白質的研究[1]。開展了對甜菜葉片應答干旱脅迫處理進行的差異蛋白質組學分析[2]。對甜菜塊根膨大過程的蛋白質組變化也進行了相關研究[3]。此外，對甜菜細胞質雄性不育系與保持系花期差異蛋白表達開展了研究[4]。范慧艷[5]在已有的研究基礎上，對BNYVV侵染系統寄主煙草和甜菜的生物學、轉錄組學和蛋白組學特點進行比較分析研究。國外甜菜蛋白組學研究則在芽勢變化[6]、抗旱性[7]、抗鹽性[8]、育性[9]等方面有報道。但目前關于甜菜蛋白質組學的報道相對于其他作物還是較少，與甜菜雙向電泳技術的不成熟有一定的關系。因此，本研究針對甜菜葉片總蛋白的提取方法，線性固相pH梯度(Immobilized pH gradient，IPG)膠條pH值、上樣量等進行研究，建立了一套甜菜葉片蛋白質雙向電泳技術方法，為甜菜蛋白質組研究提供理論依據和參考。

1 材料和方法

1.1供試材料與處理

試驗材料為內蒙古農牧業科學院自育材料HB-1，于2014年6月20日播種，在內蒙古農牧業科學院自然條件下進行盆栽試驗，將種子播種于直徑20 cm、高25 cm的塑料盆內，每盆裝3 kg土，定苗10株，盆栽每隔3 d澆一次自來水，每次250 mL。待真葉展開后6～8片葉時進行葉片取樣，儲存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2總蛋白提取方法

采用以下3種方法進行，TCA/丙酮提取法[10]、酚提取法[11]、可溶性蛋白提取雙乙法[12]。

1.3蛋白質濃度測定體系

從濃縮后的蛋白干粉中取15 mg，向其中加入150 μL的蛋白裂解液復融。濃縮后的蛋白干粉很難溶解，可通過反復凍融的方法促進蛋白溶解。直到看不見蛋白顆粒為止。從上清液中取1 μL，稀釋100 倍，用于測定蛋白含量。采用Bradford法定量蛋白[13]。

1.4雙向電泳條件的設定

選用不同pH值范圍的IPG膠條進行對比，調整上樣量比較雙向電泳的清晰度，確定最佳的pH值范圍及上樣量，不同膠條長度的雙向電泳比較。7 cm膠條和17 cm固相IPG膠條等電聚焦反應程序的設定如表1，2。

表1 7 cm固相IPG膠條第一向等電聚焦程序Tab.1 The first isoelectric focusing procedure of 7 cm solid phase IPG adhesive strip

表2 17 cm固相IPG膠條第一向等電聚焦程序Tab.2 The first isoelectric focusing procedure of 17 cm solid phase IPG adhesive strip

1.5雙向凝膠電泳及凝膠染色

第一向等電聚焦采用水化上樣的方法；第二向SDS-PAGE凝膠電泳采用12%SDS-PAGE凝膠垂直板電泳；凝膠染色采用經典考馬斯亮藍染色。

2 結果與分析

2.1不同蛋白提取方法的比較

2.1.1 蛋白質檢測 蛋白質提取后采用Bradford法定量蛋白，取6支試管，編號后，按表3加入試劑，圖1曲線計算提取蛋白的含量。將3種蛋白質提取方法提取的濃度適中的蛋白質進行垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳。圖2為3種提取方法的垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。由圖2可知，3種蛋白質提取方法在上樣量均為15 μL的情況下，TCA/丙酮提取方法電泳后的蛋白質條帶最為清晰，酚提取法較之顏色稍淺，可溶性蛋白提取法條帶最淺。相比較TCA/丙酮提取方法效果更好。

表3 繪制標準曲線所加試劑劑量Tab.3 The dosage needed for drawing standard curve

圖1 根據表3所做的標準曲線Fig.1 The standard curve drawing according to Tab.3

圖2 三種蛋白提取方法的聚丙烯酰胺凝膠電泳比較Fig.2 Comparison of three protein extraction methods by polyacrylamide gel electrophoresis

2.1.2 不同蛋白質提取方法比較 在上樣量均100 μg、等電聚焦條件相同的情況下，比較了酚提取法、TCA/丙酮法和可溶性蛋白提取法3種方法。提取到的蛋白的雙向電泳結果如圖3顯示：在pH值3～10的膠面上，用可溶性蛋白提取法提取的蛋白質2-DE圖譜，蛋白點較模糊，分辨率低，有橫紋干擾；酚提取法所得的2-DE膠圖譜蛋白點較清晰，凝膠背景也較為干凈，橫豎條紋干擾較少；相比較下，TCA/丙酮法的蛋白點最為清晰，背景最干凈。

2.2雙向電泳體系條件優化

2.2.1 7 cm固相IPG膠條條件優化 pH值3～10 的7 cm線性固相 IPG 膠條，上樣量分別為50，100 μg，對提取的蛋白進行雙向電泳。電泳結果顯示(圖4)：100 μg上樣量蛋白點更多且圖像更清晰，但是背景加深，條紋變明顯。pH值4～7與pH值5～8的100 μg上樣量雙向蛋白電泳比較發現(圖5)：pH值4～7膠條蛋白點較清晰且在圖譜上分布較均勻，有少量蛋白點集中現象，更適合甜菜葉片的蛋白質組分析。對pH值4～7的7 cm線性固相 IPG 膠條上樣量分別為100，150 μg進行雙向電泳。pH值4～7膠條不同上樣量比較發現(圖6)：與100 μg上樣量相比，150 μg上樣量圖譜的蛋白點數量較多，點更加清晰。因此，該樣品7 cm線性IPG 膠條上樣量150 μg較適合雙向電泳分析。

圖3 三種提取法蛋白質雙向電泳后效果圖Fig.3 Comparison of three protein extraction methods by protein two-dimensional electrophoresis

圖4 pH值3～10的7 cm膠條不同上樣量比較情況Fig.4 Comparison of different sample sizes of 7 cm strips from pH 3-10

圖5 7 cm膠條相同上樣量不同pH值范圍比較Fig.5 Comparison of 7 cm strip with same sample size between different pH range

圖6 7 cm膠條相同pH值范圍不同比較上樣量Fig.6 Comparison of 7 cm strip with same pH range but different sample size

2.2.2 17 cm固相IPG膠條條件優化 由7 cm膠條檢測pH值4～7的膠條膠點分布更均勻，因此17 cm膠條檢測上樣量即可。上樣量分別上樣200，250，300 μg。比較17 cm膠條和7 cm膠條雙向電泳后的凝膠電泳圖可知17 cm膠條的蛋白質膠點在膠面上分散更均勻。圖7比較可知上樣量200 μg膠點最少，而且顏色最淺，跟上樣量過少不能完全平鋪有關。250 μg較之膠點更清晰，而300 μg較250 μg膠點更加清晰。因此，17 cm膠條pH值4～7的最佳上樣量是300 μg。

圖7 pH 4～7的17 cm 線性固相 IPG 膠條不同上樣量雙向電泳結果Fig.7 The gel picture of two-dimensional electrophoresis with different sample volume using pH 4-7 17 cm IPG strip

3 結論與討論

本研究確定了甜菜葉片蛋白質雙向電泳最佳的提取方法，優化了一向等電聚焦的條件，建立了甜菜葉片蛋白質雙向電泳技術體系。為甜菜蛋白組學的研究提供了理論依據和參考。不同蛋白的提取方法直接影響了蛋白質的提取效果，而且不同作物之間的蛋白質的提取方法不同提取的蛋白質效果也不盡相同。許多作物都對蛋白質的提取方法及雙向電泳體系的優化做了大量研究如棉花[14]、水稻[15]、大豆[16]、甘藍型油菜[17]、甜瓜[18]、油菜[19]等。研究結果表明，不同作物之間最佳的提取方法不盡相同。本研究選取了3種蛋白質提取方法進行比較研究，其中TCA/丙酮提取法獲得蛋白純度最高，濃度適中，更適合甜菜葉片蛋白質的提取。其次是酚提取法，效果最差的是可溶性蛋白提取法。在雙向電泳條件優化過程中本研究對IPG膠條的pH值、水化上樣量進行了比較分析，發現雙向電泳結果凝膠染色后蛋白質更多地集中在pH值4～7的區域，7 cm的IPG膠條水化上樣量150 μg蛋白質膠點更加清晰，17 cm的IPG膠條水化上樣量300 μg蛋白膠點更加清晰。蛋白質組學方法在近年來發展迅速，衍生了多種分析方法[20-21]。通過蛋白質組學的研究更能清楚地研究某些特定的表達變化，因此蛋白組學研究具有重要的意義。甜菜蛋白組學開展相對較少，與甜菜雙向電泳體系不成熟有關，因此研究其中的試驗方法和優化條件也有重要的指導意義，為甜菜蛋白組學研究提供一定的理論依據和參考。

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OptimizationofTwoDimensionalElectrophoresisSystemofSugarBeet

ZHANG Hui1，2，BAI Chen2，WANG Huazhong3，ZHANG Huizhong2，LI Xiaodong2，FU Zengjuan2，ZHAO Shangmin2，E Yuanyuan2，ZHANG Ziqiang2，WANG Liang2

(1.Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China；3.Institute of Sugar Beet Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080，China)

In order to obtain the best extraction method of protein in two-dimensional electrophoresis of beet leaves and establish the best two-dimensional electrophoresis system. It took beet leaves as material. To study the effects of the extraction methods of total protein，the pH value of IPG strip，and the corresponding amount of sample on the results of two-dimensional electrophoresis of sugar beet leaves through comparative analysis.The results showed that TCA/acetone extraction method was better than the phenol extraction method and soluble protein extraction method. Comparing IPG strip of pH 4-7 with pH 5-8 in two-dimensional electrophoresis：Protein spots with pH 4-7 were clear and distributed uniform in the spectra，no protein concentrated.It was more suitable for proteomics analysis of sugar beet leaves.Using the 7 cm linear phase IPG strip，protein spots with 150 μg sample volume increased obviously and was better. Using the 17 cm strip of pH 4-7 with 300 μg sample volume protein spots were more clear.The study provided the theoretical basis and reference for the study of sugar beet proteomics.

Sugar beet；Protein extraction method；Two-dimensional electrophoresis；System optimization

2017-07-25

內蒙古自治區自然科學基金項目(2016MS0374)

張 輝(1985-)，男，河北滄縣人，助理研究員，在讀博士，主要從事甜菜遺傳育種研究。

白 晨(1959-)，男，內蒙古呼和浩特人，研究員，碩士生導師，主要從事甜菜遺傳育種及分子育種研究。 王華忠(1957-)，男，遼寧西豐人，研究員，博士，博士生導師，主要從事甜菜遺傳育種與種質資源創新研究。

S566.3

A

1000-7091(2017)05-0112-05

10.7668/hbnxb.2017.05.017