湖南省健康豬群中不同基因型豬博卡病毒流行性及進化分析

屈泰龍，李潤成，羅斌宇，葛 猛，嚴美君，胡輝燦，余興龍

(湖南農業大學 動物醫學院，湖南 長沙 410128)

湖南省健康豬群中不同基因型豬博卡病毒流行性及進化分析

屈泰龍，李潤成，羅斌宇，葛 猛，嚴美君，胡輝燦，余興龍

(湖南農業大學 動物醫學院，湖南 長沙 410128)

為了解豬博卡病毒在不同年齡健康豬群中的感染情況，通過對GenBank登錄的豬博卡病毒基因序列分析設計2對引物可分別擴增PBoV1/2的部分NS1基因和PBoV3/4/5的部分VP1基因。提取2016年8-12月收集自湖南5個集約化豬場2～20周齡豬共430份肛門拭子樣品的DNA并進行PCR檢測。PBoV陽性率為64.6%(278/430)，PBoV1/2陽性率為27.2%(117/430)，PBoV3/4/5陽性率為45.1%(194/430)，混合感染率為7.7%(33/430)，PBoV3/4/5陽性率顯著高于PBoV1/2陽性率(P=0.034)。PBoV1/2在 2～10周檢出率高于其他周齡，但是與其他周齡豬體內檢出率統計分析無顯著性差異，PBoV3/4/5主要感染8～16周豬，與4周以內豬差異顯著，與其他豬群差異不顯著。對各型的核苷酸與參考序列核苷酸相似性分析顯示PBoV1/2之間的平均相似度為85.4%，PBoV3/4/5之間的平均相似度為67.2%。PBoV在健康豬群中流行廣泛且存在共同感染現象，對豬的健康尤其是腸道微生物平衡可能存在潛在影響。

豬博卡病毒；流行性；進化分析；混合感染；致病性

豬博卡病毒(Porcinebocavirus， PBoV)屬于細小病毒科博卡病毒屬，主要感染豬，2009年首次從患有仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征的仔豬體內鑒定[1]。隨后，在許多國家均有報道豬群受該病毒感染，并獲得了全基因組或者部分基因[2-4]。根據堿基相似性將PBoV分為5個基因型，通過基因差異設計了引物用于PCR檢測，加快了該病毒的流行病學調查[5-6]。目前對于該病毒的調查多集中在發病豬，如腹瀉、咳嗽等，陽性率不等[7-10]，為該病的流行病學規律提供了一定的基礎知識。有部分研究人員對健康豬進行了PBoV感染情況調查，但是因為調查樣本數量太少，因此不能準確說明PBoV在健康豬群中的流行情況[11]。我們在湖南省內調查了5個規模豬場健康豬群中PBoV的流行情況，以期為了解PBoV對豬潛在的影響提供信息。

1 材料和方法

1.1樣品收集

2016年8-12月，于不同豬場采集430份肛門拭子。樣品采集于湖南省3個市5個集約化豬場，來自于不同豬群的豬：2～20周(間隔2周采集1次)，采樣豬均健康，無腹瀉癥狀。A、B、C 3個豬場每個階段采集8份樣本，D和E每個階段采集10份樣本(D場20周齡豬無樣本)。采集樣品時，每份拭子單獨存放于一個滅菌離心管，并于低溫條件下運送至湖南農業大學動物醫學院病原分子與診斷實驗室。

1.2樣品處理和病毒DNA提取

分別向含拭子的離心管中加入500 μL生理鹽水，漩渦振蕩混勻，于7 500 r/min 離心5 min。取離心后的上清液200 μL采用DNAout kit(北京天恩澤基因科技有限公司)提取DNA，操作步驟按說明書執行。

1.3引物設計及PCR擴增

下載GenBank內登錄的PBoV基因序列，經比對分析后發現在PBoV1/2型的NS1基因和PBoV3/4/5型的VP1基因存在一定的保守區域，在這2處分別設計引物(表1)，可對應擴增PBoV1/2型NS1基因和PBoV3/4/5型VP1基因的部分序列。將PBoV1/2、PBoV3/4/5的PCR產物測序經驗證后分別構建至pMD19-T載體，并將其做101～108稀釋用于PCR方法的敏感性檢測；使用以上2對引物分別擴增豬圓環病毒2型(Porcinecircovirus2，PCV2)、豬細小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、PEDV(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)和豬撒佩羅病毒(Porcinesapelovirus，PSV)的DNA或cDNA及PBS；分別使用2對引物對肛門拭子的DNA進行擴增，20 μL PCR反應體系包含：2×Mix 10 μL，10 mmol/L 上下游引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補足至20 μL。PCR反應采用如下程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34個循環；72 ℃ 7 min，PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PBoV1/2和PBoV3/4/5擴增引物信息Tab.1 Primers information for PBoV1/2 and PBoV3/4/5

1.4測序及進化分析

將經2對引物擴增為陽性的部分樣品DNA經純化后送Qsingke生物測序，所得序列與GenBank內PBoV1/2型、PBoV3/4/5型序列進行進化分析。將序列經MAFFT軟件比對，DAMBE軟件進行序列飽和度檢測，Jmodeltest程序分析最佳堿基進化模型，根據以上信息用MEGA 6軟件選擇合適參數構建Maximum likelihood (ML ) tree。

1.5統計分析

將樣本內PBoV1/2型和PBoV3/4/5檢測結果匯總于Excel 2010：同一豬場不同周齡樣本的檢測數據作為一組，共有5組，每組8～10個數據；同一周齡不同豬場樣本的檢測數據作為一組，共有10組，每組5個數據。數據用單因素方差分析(IBM SPSS Statistics 19軟件的)方法進行統計分析，置信區間設置為95%，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1PCR引物擴增特異性和敏感性

分別使用引物擴增樣品及PCV2、PPV、PEDV、PSV的DNA或cDNA及PBS，僅從各自對應的樣品中擴增到陽性信號，而其他對照均為陰性(圖1-A、B)。將稀釋至不同濃度的質粒pMDT-PBV1/2和pMDT-PBV3/4/5分別用PBoV1/2F和PBoV1/2R引物擴增，引物PBoV1/2最低可擴增拷貝數為38 拷貝/mL，PBoV3/4/5最低可擴增拷貝數為94拷貝/mL(圖1-C、D)。

2.2PBoV流行性檢測

PBoV陽性率為64.6%(278/430)，PBoV1/2陽性率為27.2%(117/430)，PBoV3/4/5陽性率為45.1%(194/430)，混合感染率為7.7%(33/430)，PBoV3/4/5陽性率顯著高于PBoV1/2(P=0.034)。

將檢測數據按照不同周齡和不同豬場總陽性率進行統計分析，PBV1/2周齡總陽性率為2.9%～43.2%，其中2周齡仔豬樣本內檢出率最高為43.2%(19/44)，隨著年齡的增長，陽性率呈現漸低趨勢，至20周陽性率為2.9%(1/43)。對不同豬場的檢測結果進行分析，陽性率達到30%以上的豬場有A(36.3%，29/80)和B(32.5%，26/80)，其余豬場陽性率從高到低依次為C(28.7%，23/80)，D(22.2%，20/90)和E(25.0%，25/100)。將各個養殖場陽性率和周齡陽性率分別進行單因素方差分析，結果各個養殖場之間PBoV1/2陽性率無顯著差異，周齡差異顯著性分析顯示，除20周陽性率顯著低于2～10周齡檢出率外，其他各周齡之間無顯著差異，詳細數據見表2。

A、B分別為PBoV1/2、PBoV3/4/5引物特異性檢測結果：M.DL2000；1.樣本DNA；2.PBS;3.PCV2;4.PPV;5.PEDV;6.PSV。C、D分別為PBoV1/2、PBoV3/4/5引物擴增梯度稀釋質粒結果：M.DL2000；N1～N8分別為質粒101～108稀釋倍數；PBoV1/2引物最高可擴增稀釋倍數為107；含拷貝數為38拷貝/mL；PBoV3/4/5引物最高可擴增稀釋倍數為106；含拷貝數為94拷貝/mL。

A，B are specify amplification result of primer forPBoV1/2 andPBoV3/4/5，respectively： M.DNA Ladder 2000；1.Target DNA (PBov1/2 or PBoV3/4/5)；2.PBS；3.PCV2；4.PPV；5.PEDV；6.PSV.C,D.Amplification results using primers forPBoV1/2 andPBoV3/4/5 with gradient dilution plasmid：M.DNA Ladder 2000；N1-N8.Dilutions of Plasmid with target gene from 101-108，the minimum amplification copies number forPBoV1/2 andPBoV3/4/5 are 38，94 copies/mL，respectively.

圖1 PBoV引物特異性及敏感性檢測Fig.1 Specify and sensitivity of primers for PBoV amplification

PBoV3/4/5周齡總陽性率為4.5%～68.2%，總陽性率從2周齡最低(4.5%，2/44)至8周齡時達到最高(68.2%，30/44)，隨后陽性率呈現下降趨勢，20周齡樣本檢出率為32.3%(11/43)。將不同周齡的數據進行統計分析，根據SPSS統計數據差異性分析將數據分為3組，1組：8，10，12，16周；2組：6，14，18，20周；3組：2，4周。3個小組各組內數據無顯著差異，1組內各年齡段檢測數據與2組內各年齡段檢測數據，2組內各年齡段檢測數據與3組內各年齡段檢測數據之間無顯著差異，但1組內各年齡段檢測數據與3組各年齡段檢測數據之間差異顯著，1組、2組之間無統計學差異，但1組數據平均值高于2組，詳見表3。

根據不同豬場總陽性率統計顯示D(71.1%，64/90)和C(66.3%，53/80)最高，隨之B(30.0%，24/80)、E(29.0%，29/100)和A(26.3%，21/80)逐漸降低。D和C 2個豬場內陽性率顯著(P<0.05)高于B、E和A豬場陽性率(表4)。

2.3進化分析

將擴增樣品所得序列分別與GenBank內下載的序列進行統計分析，經DAMBE軟件分析，Iss數值小于Iss.cSym，且差異顯著(P<0.05，表5)，堿基序列進化度未飽和，可做進化分析。將試驗所得序列與參考序列構建ML進化樹(圖2)，2對引物擴增所得序列分別與相對應的參考序列歸為一支，PBV1/2試驗序列與參考序列平均堿基相似性為85.4%，除了與參考序列JN400876(堿基相似性42.3%～46.7%)距離較遠，與其他多數PBoV1/2型參考序列親緣關系較近(堿基相似性80.1%～99.6%)。試驗所得序列之間平均堿基相似性為94%，彼此之間的堿基相似性為83.7%(Y6-1與2-1)～99.8%(Y4-2和Y4-3)，尤其是來源于同一豬場的樣品(Y系列)彼此之間的相似性為91.8%～99.8%。PBoV3/4/5平均堿基相似性為67.2%，可分為2支，其中有8條序列單獨分為一簇，彼此之間的堿基相似性為68.5%～98.0%，另外8條序列與其余參考序列分為一簇，彼此之間的堿基相似性為68.4%～89.8%。

表3 不同豬群中PBoV3/4/5陽性率Tab.3 The positive rate of PBoV3/4/5 in different pig groups %

表4 PBoV3/4/5按照不同周齡和豬場統計分析結果Tab.4 t-test of PBoV3/4/5 based on age and farm

注：表內數據為平均值加減標準差；其中a～d為按周齡分組統計時差異顯著標識；e和f為按豬場統計是差異顯著標識；不同小寫字母表示差異顯著。

Note： Data of the calculations displayed as mean value added and subtract with standard deviation; a-d mean significant differences based on age;while e and f mean significant differences based on farm; Different lowercase indicate significant differences.

表 5 堿基進化飽和度檢測Tab.5 Test of nucleotides substitution saturation

3 討論

目前PBoV共有5個基因型，主要有3個ORF，分別編碼NS1、NP1和VP1/VP2[11-12]。曾有研究人員試圖建立3個ORF的ELISA方法并希望可用于血清學調查研究[13]。但是根據3個ORF氨基酸同源性分析，基因型之間氨基酸相似度為29.4%～48.4%，基因型內氨基酸相似度為73.3%～99.5%，均存在較大差異，因此，不能夠準確地對臨床樣品進行流行型檢測[14-15]。通過對GenBank內登錄PBoV基因組進行對比分析，發現PBoV1型和PBoV2型之間、PBoV3、PBoV4和PBoV5型之間的序列比較接近，設計2對引物，構建PCR檢測方法，可分別特異性擴增相對應的基因型。

文獻報道PBoV在病豬(腹瀉，PMWS等)的陽性率為20%～100%[10,16]，在健康豬群中的陽性率為6%～56%[8,17]。Blomstr?m等[1]對34頭患有PMWS和24頭健康豬進行PBoV-like (經過比對分析為PBoV1)檢測，發現患有PMWS的豬PBoV檢出率為88%，而無PMWS癥狀的豬體內PBoV檢出率為46%。PCR檢測陽性率差異性有2個主要原因，其一由于PBoV堿基序列差異性較大，而不同的研究團隊所使用的引物擴增靶序列的基因型有很大差異，多數為某單一基因型；其二，每個團隊調查的豬群健康狀況不一致，甚至豬群年齡構成有很大差異。我們設計了可有效擴增PBoV1/2、PBoV3/4/5的引物，同時對不同年齡的健康豬進行了檢測，系統的檢測了豬群中PBoV的流行狀況。試驗樣品共有430份健康豬肛門拭子，其中PBoV陽性率為64.6%，PBoV1/2陽性率為27.2%，PBoV3/4/5陽性率為45.1%，混合感染率為7.7%，表明湖南省內PBoV3/4/5陽性率高于PBoV 1/2流行型。2周齡仔豬PBoV1/2便有較高陽性率，且隨著年齡的增長檢出率逐漸降低，表明仔豬易感，而隨著年齡增大，PBoV1/2對豬的感染能力下降，母豬可能未曾感染，因此無相應的抗體，而仔豬也無從獲得相應母源抗體。PBoV3/4/5總陽性率則呈先升高后降低趨勢，2周齡時僅在D豬場有陽性樣本，其余豬場檢測均為陰性。2周齡之后年齡段豬群中均有陽性，表明PBoV3/4/5可感染所有豬群，而2周齡核酸檢測陽性率低可能是母源抗體的保護。從以上結果及分析可以得知：PBoV3/4/5對豬的感染能力可能強于PBoV1/2。PBoV3/4/5在肥豬群(8～16周)陽性率明顯高于PBoV1/2型陽性率，也說明PBoV3/4/5感染能力或者在豬體內適應性強于PBoV1/2。觀察分析PBoV3/4/5感染規律：2～8周齡感染率逐漸上升，在8周齡達到最高值(68.2%)并在8～12周齡保持一個相對穩定陽性率，12周齡后呈下降趨勢，至20周齡時，陽性率為32.4%。這個感染規律與PCV2感染規律相一致。5個豬場中有2個豬場免疫PCV2疫苗5年以上(C和D場)，2個免疫PCV2疫苗2.5年左右(B和E場)，1個未免疫過PCV-2疫苗(A場)。通過對PBoV1/2和PBoV3/4/5統計分析，本研究發現，隨著豬場內PCV-2免疫時間的增長，PBoV1/2陽性率逐漸降低，而PBoV3/4/5陽性率則逐漸升高。PCV2感染主要導致機體的免疫系統功能性下降，而PCV2疫苗免疫則可以預防PCV2感染，從而使機體免疫系統保持相對健康。因此，PBoV1/2感染隨PCV2疫苗免疫時間增長而下降。PBoV3/4/5隨著豬場中PCV2疫苗免疫時間的增長而呈現逐漸升高的現象是比較出乎意料的.目前這兩者之間的相關性未有相關報道，因此需要進一步加強研究以闡明相關性。由于目前PBoV尚未有效的體外培養方法，無法實施試驗控制條件下的攻毒試驗，因此對其具體致病性理解仍需加強相關研究。

ML進化樹采用MEGA 6軟件繪制，采用Tamura-Nei model和Gamma distributed 模型，自展值(Bootstrap)設定為1 000，比對中產生的空格在進化樹構建過程中均刪除。A.PBoV1/2共有15條樣本序列(標記為●)，7條參考序列，樣本序列長度為445～451 bp。B.PBoV3/4/5共有16條樣本序列(標記為■)，17條參考序列，樣本序列長度為504～543 bp。

Maximum likelihood tree was conducted using MEGA 6 with Tamura-Nei model and Gamma distributed model with Bootstrap of 1 000 and the gap during alignment was complete delete.A.15 obtained (marked with ●) and 7 reference PBoV1/2 with 445-451 bp；B.16 obtained (marked with ■) and 17 reference PBoV3/4/5 with 504-543 nucleotides.

圖2PBoV樣本序列與參考序列進化分析
Fig.2PhylogeneticanalysisofPBoVbasedonobtainedandreferencesequences

PBoV各型之間NS1或VP1基因有一段保守序列，可用于設計引物[12,18-19]。本研究設計的引物擴增序列高度變異，經與參考序列比對分析堿基相似度85.4%(NS1)，67.2%(VP1)。由于PBoV全基因組差異較大，因此擴增相對麻煩，用全基因組進化分析也比較難以進行。許多研究團隊采用NS1或VP1代替全基因組進行進化，雖然有一定差異，但總體具有可信度[20]。進化分析顯示樣本序列與參考序列交叉分布，進一步說明樣本序列核酸的多態性。

2010年，該病毒僅在瑞典和中國有報道[21]，但是，目前該病毒已在許多國家豬群中存在[7,22-23]。國際間種豬及豬肉加工產品的貿易日益頻繁，但是PBoV并未列入入境檢驗檢疫范圍，因此，在某種程度上促進了該病毒在國際間的流通。PBoV無論是在健康豬群中還是發病豬群中均有一定比例的檢出率，該病對于豬的健康狀況是否存在影響還不能確定，因此需要進一步加強對該病毒的研究。

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PrevalenceandPhylogeneticAnalysisofMultiplePorcinebocavirusGenotypesinClinicallyHealthyPigsinHunanProvince

QU Tailong，LI Runcheng，LUO Binyu，GE Meng，YAN Meijun，HU Huican，YU Xinglong

(Veterinary Faculty，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

To evaluate the prevalence of PBoV in healthy pig in different age，primers targeting to partialNS1 gene of PBoV1/2 andVP1 gene of PBoV3/4/5 were designed based on the analysis of PBoV sequences from GenBank.Total 430 anal swab species were collected from 5 pig farms with the pig′age of 2-20 weeks from August to December 2016 in Hunan Province.The total positive rate of PBoV was 64.6% (278/430)，PBoV1/2 for 27.2%(117/430)，PBoV3/4/5 for 45.1%(194/430) and with 7.7%(33/430) positive rate of coinfection.The mainly infection age of PBoV1/2 ranged 2-10 weeks，and PBoV3/4/5 from 8-16 weeks.The average nucleotide identity of obtained sequences and references of PBoV1/2 and PBoV3/4/5 was 85.4% and 67.2%，respectively.High prevalence and coinfection were observed in clinically healthy pigs，which may cause potential effect to the microbes in the gut.

PBoV; Prevalence; Phylogenetic analysis; Coinfection; Pathogenicity

2017-07-22

湖南省戰略性新興產業科技攻關類項目(2016GK4015)

屈泰龍(1986-)，男，河南開封人，在讀博士，主要從事動物疫病防控研究。

余興龍(1965-)，男，湖南岳陽人，教授，博士，博士生導師，主要從事畜禽疫病的診斷、分子病毒學與基因工程研究。

S855.3

A

1000-7091(2017)05-0136-06

10.7668/hbnxb.2017.05.021