馬鈴薯StBAG3基因cDNA的克隆及晚疫菌對其誘導表達

盧興國，張 貴，田再民，侯丁一，趙 君，張之為

(內蒙古農業大學 農學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯StBAG3基因cDNA的克隆及晚疫菌對其誘導表達

盧興國，張 貴，田再民，侯丁一，趙 君，張之為

(內蒙古農業大學 農學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

為了研究馬鈴薯內源BAG基因在晚疫病抗性建立中的作用，利用擬南芥和水稻的BAG基因保守序列，在馬鈴薯基因庫中比對獲得馬鈴薯內源StBAG3的基因序列。以StBAG3基因序列為模板設計引物，通過RT-PCR克隆得到了StBAG3基因cDNA序列。序列分析的結果表明，該基因開放閱讀框為1 026 bp，編碼341個氨基酸。蛋白二級結構預測結果表明，StBAG3具有UBQ和BAG 2個保守功能域。StBAG3基因的表達譜分析結果顯示，不同馬鈴薯品種中StBAG3基因表達水平存在差異，其中在冀張薯12號中表達量最高，而夏坡蒂中表達量最低。該基因在馬鈴薯不同組織中表達量測定結果表明，馬鈴薯莖中的表達水平最高，老葉中表達水平最低。接種晚疫菌后，StBAG3能夠被顯著上調并在接種48 h后達到最高值，預示著StBAG3基因在馬鈴薯晚疫病抗性建立過程中具有一定的調控作用。

馬鈴薯；StBAG3；基因克隆；晚疫菌；表達

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界第四大糧食作物[1]，其種植面積和產量僅次于小麥、水稻和玉米[2]。目前，我國馬鈴薯的種植面積和總產量居世界首位[3]，而內蒙古是我國重要的馬鈴薯種薯、商品薯和加工專用薯的生產基地。2015年，我國農業部正式將馬鈴薯作為主糧產品進行產業化開發[4]。因此，保障馬鈴薯產業的安全是從事馬鈴薯研究人員的重要任務。

馬鈴薯種植過程中會受到多種病蟲害的危害，其中以馬鈴薯晚疫病危害最為嚴重[5]。由于馬鈴薯主栽品種缺乏對晚疫病的抗性，導致了化學藥劑成為防控晚疫病的主要措施[6]。高頻率大劑量的使用殺菌劑，一方面，增加了晚疫病菌對殺菌劑的抗性[7-10]，另一方面，過度使用化學殺菌劑容易導致土壤板結，增加CO2的排放，從而對生態環境產生負面影響[11]。因此，采用分子生物學技術進行抗病育種是未來保障馬鈴薯產業持續穩定發展的關鍵。

BAG蛋白(Bcl-2 associated athanogene)是一類多功能蛋白家族，最初從哺乳物克隆得到，由于這類蛋白能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2結合并促進細胞生存，因而被命名為Bcl-2 關聯基因[12]。目前，在酵母、動物、植物中都發現了BAG蛋白[13-15]。相比于動物，植物中的BAG基因功能研究較少[13]。研究者最早從擬南芥中克隆得到植物BAG基因并證明了它能夠調控植物的抗逆反應[16]；如超量表達AtBAG4的煙草表現出對紫外脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、氧脅迫的多種抗性[17]。敲除AtBAG4的擬南芥突變體與野生型突變體相比，出現提前開花，營養期和生殖期縮短，根和花序多分支的現象[16]。但是，在擬南芥過表達來源于葡萄的BAG基因HSG1也會出現提前開花情況，并表現出對高溫脅迫的抗性[18]。也有一些有關BAG基因參與植物抗病過程的報道，如敲除AtBAG6的擬南芥突變體更易被腐生性真菌侵染，過表達AtBAG6的擬南芥突變體則表現出植株矮小、葉片損傷癥狀[17]，同時轉基因植株細胞中胼胝質含量提高的結果預示著AtBAG6可能是通過調控植株的過敏反應來加強擬南芥生物脅迫抗性[16]。類似的，在擬南芥中超量表達來源于草莓的BAG6基因FvBAG6能夠提高對炭疽病的抗性水平[19]。目前，水稻中發現6個BAG蛋白的同源物，它們在水稻對各種生物脅迫的反應中也具有一定的調控作用[20]。而有關馬鈴薯中的BAG基因的研究還未見報道。

通過分析擬南芥和水稻中已經克隆得到的AtBAG4和OsBAG4的蛋白序列，找到BAG蛋白的功能域保守序列，以此序列在馬鈴薯基因庫中比對得到StBAG3的基因序列。以此序列為模板設計引物，通過PCR克隆得到StBAG3基因。通過ExPASy對StBAG3基因編碼的蛋白氨基酸序列和相應的蛋白結構進行了預測。同時，還對BAG基因的表達譜以及接種晚疫病菌后該基因轉錄水平進行了研究。該研究結果填補了BAG基因在馬鈴薯中的研究空白，初步探究了StBAG3在馬鈴薯晚疫病抗性建立過程中的作用。

1 材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1 供試的馬鈴薯材料 供試的馬鈴薯為無菌試管苗克新1號、冀張薯12、夏坡蒂、大西洋、費烏瑞它、底西瑞。試管苗在人工氣候室的培養條件為光照16 h，25 ℃，黑暗8 h，18 ℃。提取RNA所用馬鈴薯在人工氣候室培養14 d即可取樣。

1.1.2 供試載體與菌株 克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Kit(卡納霉素抗性)和大腸桿菌感受態Trans-T1購自全式金公司(北京)；馬鈴薯晚疫菌由內蒙古農業大學植物分子病理實驗室保存，其交配型是A1型。

1.1.3 酶及試劑 高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase、RNA提取試劑盒RNAiso Reagent和PCR產物回收試劑盒均購自TaKaRa公司(北京)。反轉錄試劑盒購自Vazyme公司(南京)，PCR產物純化回收試劑盒購自Axygen公司(北京)。

1.1.4 引物設計 根據StBAG3序列和GAPDH序列設計引物，引物由Sagon公司(上海)合成。分別為：BAG3-F：5-′CATGCCATGGATGATGCGAATGAAGACC-3′；BAG3-R：5-′CGGACTAGTCGAGCAAATCCCAATTG-3′；GAPDH-F：5-′TGGACAATGGAAGCACCATGAGC-3′；GAPDH-R：5-′TGCTTGACCTGCTGTCACCAAGA-3′。

1.2試驗方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA合成 利用RNAiso(TaKaRa公司)試劑提取生長14 d的馬鈴薯幼苗葉片總RNA，cDNA第一鏈合成參照Vazyme公司的反轉錄試劑盒說明書。

1.2.2StBAG3基因克隆 以cDNA為模板，BAG3-F和BAG3-R為引物進行PCR擴增。PCR程序為：98 ℃預變性10 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，循環30次，最后4 ℃終止反應。利用Axygen公司的PCR產物純化回收試劑盒對PCR產物進行純化，連接到中間載體pEASY-Blunt Simple Cloning Kit上，將中間載體轉化至大腸桿菌，篩選陽性克隆后，送美吉生物公司測序。

1.2.3StBAG3基因表達譜分析 提取不同馬鈴薯品種(克新1號、冀張薯12、夏坡蒂、大西洋、費烏瑞它、底西瑞)葉片和大西洋、夏坡蒂不同組織(老葉、嫩葉、莖、根)的總RNA，采用半定量RT-PCR方法，以GAPDH基因為內參，分析StBAG3基因相對表達量，PCR程序為：98 ℃預變性10 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，循環30次；最后4 ℃終止反應。利用軟件Quantity One分析表達量，根據PCR產物條帶的強弱，以StBAG3/GAPDH表達StBAG3基因相對表達量。

1.2.4 接種晚疫菌后StBAG3基因表達量分析 將生長30 d的馬鈴薯晚疫菌的菌絲用接種針刮入裝有無菌水的離心管中反復搖晃沖洗，4 ℃下放置3 h誘導游動孢子釋放，調節孢子濃度至1×106個/mL。取10 μL孢子液接種在離體馬鈴薯葉片背面，并放置在光照培養箱中進行培養(光照16 h，25 ℃，黑暗8 h，20 ℃)。分別在接種后0，12，24，36，48，72 h取樣檢測StBAG3基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1StBAG3基因的克隆

通過對AtBAG4和OsBAG4的蛋白序列比對分析在馬鈴薯基因庫中找到StBAG3基因，該基因全長為2 074 bp，開放閱讀框為1 026 bp，編碼341個氨基酸(圖1)。通過RT-PCR的方法克隆得到StBAG3的cDNA片段，cDNA片段長度約1 000 bp(圖2)。測序結果表明，克隆得到的cDNA片段與StBAG3同源性為100%(圖3)。

起始密碼子、終止密碼子和3′UTR區的終止信號用下劃線標記。The start codon, stop codon and termination signals of 3′UTR regionare underlined.

M.D2000 Marker；1.陰性對照；2、3.不同樣本。M.D2000 Marker；1.Negative control；2，3.Different samples.

2.2不同物種來源的StBAG基因的聚類分析

為了進一步確定StBAG3和其他物種同源基因的遺傳距離，選取了番茄、煙草、擬南芥、水稻、小麥和首次發現BAG蛋白的動物家鼠的BAG蛋白與馬鈴薯的StBAG3蛋白進行聚類分析(圖4)。結果表明StBAG3與來自于番茄SlBAG1、SlBAG3和煙草的NtBAG1基因遺傳距離最近，其次為擬南芥的AtBAG1和AtBAC3基因，與水稻OsBAG1和小麥TaBAG3遺傳距離最遠。

2.3StBAG3蛋白結構的預測

利用NCBI網站中的Conserved Domain Search Service(CD Search)工具對StBAG3基因編碼的蛋白結構進行了預測，結果表明，和擬南芥AtBAG4以及水稻的OsBAG4蛋白結構一樣，StBAG3也有2個保守的功能域UBQ domain和BAG domain(圖5)。二級結構的預測結果表明，StBAG3和其他物種的同源蛋白一樣含有BAG功能域。信號肽預測結果顯示，

圖4 不同物種來源BAG蛋白cDNA序列同源性比較Fig.4 Alignment of different BAG proteins on cDNA sequence

StBAG3無信號肽。親水性和疏水性分析顯示StBAG3蛋白是一種胞內可溶性蛋白。蛋白的空間構象預測結果顯示，該蛋白在細胞核、細胞質、線粒體中均存在。

2.4不同馬鈴薯中StBAG3表達量分析

StBAG3基因在6個馬鈴薯品種(克新1號、冀張薯12、夏坡蒂、大西洋、費烏瑞它、底西瑞)中表達水平檢測結果表明，該基因在供試的6個品種中都有表達，但表達量不同。其中，冀張薯12中表達量最高，夏坡蒂StBAG3基因表達量最低，其余4個品種中StBAG3的表達量介于上述2個品種之間(圖6)。

圖5 AtBAG4、OsBAG4和StBAG3的功能域比較Fig.5 The functional domain alignment of AtBAG4，OsBAG4 and StBAG3

圖6 不同馬鈴薯品種中內源StBAG3相對表達量Fig.6 Endogenous StBAG3 expression level in different potato cultivars

2.5馬鈴薯不同組織中StBAG3表達量分析

以大西洋和夏坡蒂的老葉、嫩葉、莖、根為樣本，檢測不同組織中StBAG3基因相對表達量，結果表明，StBAG3在供試的2個馬鈴薯品種的不同組織的表達模式非常相似，即StBAG3基因的相對表達量由高到低依次是：莖、嫩葉、根、老葉(圖7)。

2.6馬鈴薯葉片中StBAG3在接種前后轉錄水平的變化

為了研究StBAG3在馬鈴薯抗晚疫病過程中的功能，用晚疫菌接種不同的馬鈴薯品種(夏坡蒂和冀張薯12)并在不同時間點取樣測定StBAG3的相對表達量。結果表明，接種晚疫菌后，2個不同馬鈴薯中StBAG3基因的表達量均被上調，并在接種48 h后達到峰值，隨后開始下降。相比較而言，冀張薯12中StBAG3基因接種后上調的幅度要高于夏坡蒂(圖8)。

圖7 馬鈴薯不同組織中StBAG3基因的相對表達量Fig.7 Relative expression of StBAG3 by densitometric analysis in different tissues of different potato cultivars

3 結論與討論

本試驗通過分析擬南芥和水稻的BAG蛋白得到2個保守的功能域BAG功能域和UBQ功能域，利用BAG功能域的保守序列，在馬鈴薯基因庫中比對獲得馬鈴薯內源StBAG3基因序列。利用NCBI網站中的Conserved Domain Search Service(CD Search)工具對StBAG3基因編碼的蛋白結構進行了預測，結果表明，和擬南芥AtBAG4以及水稻的OsABG4蛋白結構一樣，StBAG3也有2個保守的功能域UBQ domain和BAG domain。氨基酸序列聚類分析結果表明，StBAG3與番茄BAG蛋白(SlBAG1、SlBAG3)和煙草BAG蛋白(NtBAG1)親緣關系較近，預示著，BAG蛋白能在馬鈴薯、番茄和煙草中發揮相似的作用。

圖8 不同晚疫菌接種時間StBAG3的表達量

StBAG3基因在不同品種的馬鈴薯和馬鈴薯的不同組織細胞中都有表達，但是其表達水平有明顯的差異，說明馬鈴薯中的StBAG3可能參與調節馬鈴薯的生長發育過程。此外，StBAG3基因在莖和嫩葉的相對表達量較高，說明StBAG3極有可能調控馬鈴薯的莖和葉片的生長和分化。不同品種的馬鈴薯在受到馬鈴薯晚疫菌的誘導后，StBAG3基因的表達量都有上升，說明StBAG3可能參與調控馬鈴薯抗晚疫病過程，這一初步的結果預示著StBAG3可能會成為馬鈴薯的抗性育種中可以被利用的抗性基因。然而，StBAG3在馬鈴薯抗晚疫病過程中如何發揮其調控作用還有待進一步研究。

在人體中，BAG蛋白被證明參與腫瘤發生[21]、HIV侵染[22-23]和帕金森綜合征的發生[24]，因此，對動物細胞中BAG蛋白的功能研究比較充分。相比之下，對植物中BAG蛋白的同源物的功能并未完全了解[13]。植物中的BAG蛋白最早在擬南芥中發現[16]，水稻也已經發現了BAG蛋白的同源物[20]，目前尚未有關于馬鈴薯BAG蛋白的研究報道。本研究首次克隆出StBAG3基因，并證明StBAG3能夠被晚疫菌誘導表達，說明StBAG3可能參與調控馬鈴薯抗晚疫病過程。類似的，擬南芥[17]和草莓[19]中的BAG基因被證實能提高植物對病原菌的抗性水平，預示著植物BAG基因可能與植物的抗病性有關。StBAG3對馬鈴薯晚疫病抗性是正向調控還是負向調控及StBAG3在馬鈴薯抗晚疫病過程中如何發揮其調控作用還有待進一步研究。

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CloningofcDNAStBAG3andInducedExpressbyPathogenofPotatoLateBlight

LU Xingguo，ZHANG Gui，TIAN Zaimin，HOU Dingyi，ZHAO Jun，ZHANG Zhiwei

(College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China)

In order to study the functions ofStBAG3 during the establishment of potato resistance toPhytophthorainfestans(P.infesans)，endogenousStBAG3 gene was cloned from potato through PCR with primers devised based on the conserved sequence ofBAGcloned fromArabidopsisand rice.The sequence analysis results showed the open reading frame ofStBAG3 gene was 1 026 bp and encodes 341 amino acids.The protein secondary structure prediction indicated that the StBAG3 contains two conserved domains，UBQ and BAG.The expression level ofStBAG3 gene in different potato cultivars was variable and Jizhanghsu 12 showed the highest level，whereas，the expression level in Shepody was the lowest one.Also，the expression profile in different tissues of potato was also variable，and it showed highest in stem，but，the lowest in the old leaves.After inoculation withP.infestans，theStBAG3 gene expression was significantly induced and reached to the highest level at 48 h，indicatingStBAG3 is involved in the establishment of potato resistance against potato late blight.

Potato；StBAG3；Gene clone；P.infestans; Expression

2017-07-01

國家自然科學基金項目(31260425)

盧興國(1990-)，男，江蘇徐州人，碩士，主要從事分子植物病理研究。

張之為(1982-)，男，內蒙古杭錦后旗人，副教授，博士，主要從事分子植物病理研究。

Q812;Q87

A

1000-7091(2017)05-0142-07

10.7668/hbnxb.2017.05.022