不同脂肪源對點帶石斑魚四種免疫指標的影響

楊 寧, 黃 海,陳 友,馬 軍,陳 燕,廖經球, 巫火連

(1.三亞市南繁科學技術研究院,海南 三亞 572000;2.海南熱帶海洋學院 生命科學與生態(tài)學院,海南 三亞 572022;3.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護與利用重點實驗室,海南 三亞 572022;4.廣東恒興集團有限公司, 廣東 湛江 524002;5.三亞市節(jié)能監(jiān)察中心,海南 三亞572000 )

不同脂肪源對點帶石斑魚四種免疫指標的影響

楊 寧1, 黃 海2,3,陳 友2,3,馬 軍2,3,陳 燕2,3,廖經球4, 巫火連5

(1.三亞市南繁科學技術研究院,海南 三亞 572000;2.海南熱帶海洋學院 生命科學與生態(tài)學院,海南 三亞 572022;3.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護與利用重點實驗室,海南 三亞 572022;4.廣東恒興集團有限公司, 廣東 湛江 524002;5.三亞市節(jié)能監(jiān)察中心,海南 三亞572000 )

為研究不同脂肪源飼料對點帶石斑魚免疫力的影響,通過在飼料中添加玉米油、魚油、花生油、大豆油、葵花籽油5種不同脂肪源,用于投喂點帶石斑魚并定期檢測血液中的4種免疫指標.結果表明,不同脂肪酸源對石斑魚血液中的紅細胞數量有提高作用,其中玉米油組效果最為明顯,在第7、28、35、42、49天時紅細胞數量均顯著提高(P<0.05).超氧化物歧化酶(SOD)實驗中,除了第56天時試驗組均低于對照組,其他周期有試驗組的SOD含量高于對照組的,且差異顯著(P<0.05);而在補體C3和溶菌酶實驗中,各試驗組的C3和溶菌酶含量呈周期性波動,不同脂肪源飼料對石斑魚的補體C3和溶菌酶含量的影響存在差異.試驗說明在飼料中添加脂肪酸對提高石斑魚免疫力一定的影響,但不同脂肪源的影響效果存在差異.

點帶石斑魚;脂肪源;免疫

0 引言

點帶石斑魚(Epinepheluscoioides),俗稱“青斑”,隸屬輻鰭魚綱,鱸形目,鮨科,石斑魚屬[1],屬于暖水性島礁魚類,廣泛分布于我國東南沿海.2013年,中國大陸石斑魚產量是82434噸,占海水養(yǎng)殖魚類產量的7.3%,其中點帶石斑魚是我國重要的石斑魚養(yǎng)殖品種之一[2].但是,近年來我國石斑魚養(yǎng)殖業(yè)為了追求高產和高經濟效益,從傳統(tǒng)的低密度養(yǎng)殖轉為高密度、集約化、工廠化養(yǎng)殖的模式,使得養(yǎng)殖水質變差,點帶石斑魚生長性能退化,抗病力下降,病害較嚴重[3-5],限制了點帶石斑魚的養(yǎng)殖規(guī)模.

脂類作為三大能源物質之一,不僅為魚類提供生長、繁殖所需的能量,還可以為魚類提供必需脂肪酸,特別是不飽和脂肪酸有提高魚類免疫力的作用[6].魚類的必需脂肪酸主要包括n-3和n-6系列的不飽和脂肪酸,其中n-3系列不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和亞麻酸等,n-6系列不飽和脂肪酸包括亞油酸和花生四烯酸等.一般情況下,魚油含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸較多,大豆油和葵花籽油含有亞油酸較多,花生油和玉米油含有亞油酸和花生四烯酸較多[7].本實驗以魚油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油作為不飽和脂肪酸的脂肪源,添加到飼料中,探索不同脂肪源對點帶石斑魚免疫指標的影響,為今后石斑魚配合飼料生產和石斑魚免疫力研究提供理論依據.

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1飼料和脂肪源

用于實驗的顆料飼料主要由魚粉、酵母、面粉、酪蛋白、多維等成分組成,干物質的化學組份為粗蛋白44%,粗脂肪15%,灰分11%,糖類20%,水份8%,其他物質2%.花生油和葵花籽油選自“金龍魚”食用油,大豆油和玉米油選自“福臨門”食用油,魚油選自湯臣倍健股份有限公司.試驗組是將魚油、大豆油、花生油、玉米油和葵花油以5%比例分別與顆粒飼料混合,對照組是不混合外源肪脂酸的顆粒飼料.

1.1.2試驗設備和試劑

試驗設備主要有麥克奧迪實業(yè)集團有限公司的BA310-T型生物顯微鏡;北京六一儀器廠的WD-9403E紫外分光光度計;北京普朗新技術有限公司的DNM-9602G型酶標分析儀;玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠的XB-K-25型血細胞計數板.試劑主要有南京建成生物工程研究所生產的SOD、補體C3和溶壁微球菌(Micrococcuslysoleikticus)凍干粉試劑盒.

1.1.3試驗魚和養(yǎng)殖條件

點帶石斑魚來源于三亞簡氏海水苗種繁育農民合作社,魚體重46±2.8 g,選擇體表無病征、攝食正常的健康點帶石斑魚用于試驗.每個試驗組和對照組設平行組一個,養(yǎng)殖水泥池面積約5平米,水深1.4 m,常流水狀態(tài),水溫28-30℃,海水鹽度30‰,溶氧大于5 mg/L.試驗期間,上下午各投喂一次,投喂后換水體積占總水體積的二分之一.實驗周期結束后,各試驗組的飼料攝食量分別是：對照 36.85±0.34 g、玉米油 51.42±0.27 g、魚油 51.59±0.99 g、花生油 41.44±2.00 g、大豆 36.94±0.89 g、油葵花籽油 37.29±2.27 g.

1.2方法

1.2.1血清的采集

在連續(xù)投喂60天后,從每個試驗組和對照組養(yǎng)殖池中隨機撈取點帶石斑魚用1 mL的無菌注射器進行尾動靜脈法采取血液.將采到的血液置于4℃保存4 h,4℃條件下4000 r/min離心10 min制備血清,血清保存在-20℃冰箱中,用于測定血清超氧物化歧化酶(SOD)、血清補體C3含量和溶菌酶(LSZ)活性.

1.2.2抗凝血液的制備

用濃度為3000 U/mL的肝素鈉溶液潤洗一次性1 mL的滅菌注射器,然后對試驗魚進行尾動脈法采取血液,將血液注入含有肝素鈉的1.5 mL離心管中,制成全血,放于4℃保存,用于紅細胞計數.

1.2.3紅細胞計數

用0.65%的生理鹽水將抗凝血液進行稀釋,稀釋100倍,吸取稀釋好倍數的血液滴到血細胞計數板上,計數方法參考相關文獻[8].

1.2.4超氧化物歧化酶(SOD)的測定

采用南京建成生物工程研究所生產的超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒,

超氧化物歧化酶活力計算公式如下：

其中:反應體系稀釋倍數為111倍,樣本測試前的稀釋倍數為1倍.

1.2.5血清中補體C3含量的測定

采用南京建成生物工程研究所生產的血清中補體C3測定試劑盒.

1.2.6血清中溶菌酶活性的測定

以溶壁微球菌(Micrococcuslysoleikticus)凍干粉為底物,將已經配好了放在冰箱保存?zhèn)溆玫娜鼙谖⑶蚓芤喝〕?取3.0 mL的溶壁微球菌溶液與0.04 mL待測血清在試管中充分混勻,立刻用紫外分光光度計測其在540 nm處的吸光度值(A0),然后將裝有待測溶液的試管放置于28℃的水浴鍋里進行溫育,溫育30 min后取出立刻將其冰浴10 min以終止反應,再測其在540 nm處的吸光度值(A)[9].根據測量結果分析溶菌酶活力.

1.2.7數據處理

試驗數據采用平均值±標準差表示,用SPSS 19進行數據分析,進行單因素方差分析(One-Way-ANOVA)和Duncan多重比較,P<0.05表示差異顯著.

2 結果與分析

2.1不同脂肪源對點帶石斑魚紅細胞數量的影響

由表1可見，第7天的紅細胞數量,魚油組、花生油組、葵花油組均高于對照組,且與對照組差異顯著(P<0.05),大豆油組雖然比對照組高,但差異不顯著(P>0.05);第14天的紅細胞數量,試驗組均低于對照組,其中玉米油組和對照組差異不顯著(P>0.05);第21天的紅細胞數量,魚油組和玉米油組雖然比對照組高,但差異不顯著(P>0.05);第28天的紅細胞數量,玉米油組、魚油組、大豆油組高于對照組,差異顯著(P<0.05);第35天的紅細胞數量,玉米油組、魚油組、花生油組和葵花籽油組高于對照組,差異顯著(P<0.05);第42天的紅細胞數量,玉米油組高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第49天的紅細胞數量,各試驗組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第56天的紅細胞數量,各試驗組和對照組相比,差異不顯著(P>0.05).

表1 不同脂肪源對點帶石斑魚紅細胞數量的影響(109個/μL) n=3; (X±SD)

注：同一列數據上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2不同脂肪源對點帶石斑魚超氧化物歧化酶(SOD)的影響

由表2可見，第7天的SOD,試驗組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第14天,魚油組、花生油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第21天,魚油組、花生油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第28天,魚油組、花生油組、大豆油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第35天,魚油組、花生油組、大豆油組、葵花油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第42天,葵花油組高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第49天,玉米油組、大豆油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第56天,試驗組均低于對照組(P<0.05).

表2 不同脂肪源對點帶石斑魚超氧化物歧化酶(SOD)的影響 ( U/mL ) n=3; (X±SD)

注：同一列數據上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3不同脂肪源對點帶石斑魚補體C3的影響

由表3可見，第7天的補體C3,玉米油組高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第14天,魚油組、花生油組、大豆油組和葵花油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第21天,各試驗組均低于對照組,且差異顯著(P<0.05);第28天,各試驗組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第35天,玉米油組和大豆油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第42天,玉米油組和大豆油組均高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);第49天,試驗組均低于對照組,且差異顯著(P<0.05);第56天,試驗組均低于對照組,其中大豆油組和葵花油組差異顯著(P<0.05).

注：同一列數據上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4不同脂肪源對點帶石斑魚溶菌酶活性的影響

由表4可見，第7天的溶菌酶,試驗組均低于對照組且差異顯著(P<0.05);第14天,花生油組高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第21天,各試驗組均低于對照組,且差異顯著(P<0.05);第28天,大豆油組高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第35天,魚油組和大豆油組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05);第42天,大豆油組高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);第49天,除了葵花籽油,其他試驗組均高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);第56天,魚油組低于對照組,且差異顯著(P<0.05);其他試驗組雖然低于對照組,但差異不顯著(P>0.05).

注：同一列數據上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

水產動物的免疫系統(tǒng)主要由特異性免疫和非特異性免疫系統(tǒng)組成,魚類由于僅有IgM,免疫球蛋白的種類和功能并不完整,使其特異性免疫系統(tǒng)處于低級水平.而甲殼動物和軟體動物等水產養(yǎng)殖品種,體內缺乏免疫球蛋白,其免疫系統(tǒng)主要由非特異性免疫系統(tǒng)構成.在集約化水產養(yǎng)殖中,飼料營養(yǎng)和水產動物病害防治的關系越來越受到重視,研究表明,飼料的營養(yǎng)水平影響水產動物的健康狀況,水產動物的健康狀況反過來也影響?zhàn)D料的營養(yǎng)需要量[10].

3.1不同脂肪源對點帶石斑魚紅細胞數量的影響

紅細胞具有運送氧氣、二氧化碳、調節(jié)pH等功能,此外,還是魚類主要的免疫細胞之一,研究表明魚類的紅細胞具有一定的黏附、吞噬等類似白細胞的免疫功能[11-12].

目前,有關不同脂肪源對紅細胞的影響主要集中在對紅細胞數量的研究.唐威[13]研究不同脂肪源對斑點叉尾鮰(IetalurusPunetaus)紅細胞數量的影響,結果表明魚油組血液紅細胞總數最大,且顯著大于豆油、魚油、牛油混合油組.肖溫溫[14]通過投喂大口黑鱸 (Micropterussalmoides) 8種不同脂肪源與蛋白質含量比的飼料,發(fā)現不同配比的飼料對大口黑鱸紅細胞數量有顯著影響.隨著飼料中脂肪與蛋白含量比的升高,紅細胞數量呈現先升高后降低的趨勢.本研究發(fā)現,不同脂肪源對點帶石斑魚紅細胞數量有顯著影響.其中,第49天時,各試驗組均高于對照組,且差異顯著(P<0.05).不同脂肪酸源中,以魚油、玉米油效果較好,花生油、大豆油和葵花油次之(見表1).

3.2不同脂肪源對點帶石斑魚超氧化物歧化酶(SOD)的影響

超氧化物歧化酶(SOD)有提高魚體細胞防御能力和提高機體免疫的功能,SOD活性大小與魚類的免疫力密切相關.肖溫溫[14]研究發(fā)現飼料中不同脂肪源對SOD的影響顯著(P<0.05),且隨著飼料中不同脂肪源與蛋白質含量比的增加呈現先升高后降低的趨勢.但唐威[13]研究不同脂肪源對斑點叉尾鮰SOD的影響,結果表明豆油、魚油、牛油及其混合油對斑點叉尾鮰血清SOD無顯著性影響 (P>0.05).楊鳶劼等[9]用含不同比例不飽和脂肪酸飼料投喂黃鱔(Monopterusalbus),各試驗組與對照組相比血清 SOD 在 116.95～333.44 U/m L 之間,但無顯著差異 (P>0.05).本實驗研究結果表明,除了第56天時,不同脂肪源都能提高點帶石斑魚的超氧化物歧化酶(SOD)含量,其中,大豆油組在第49天時,SOD可達至170.62 U/mL(見表2).不同研究者研究的差異,可能與試驗動物、脂肪酸的來源不同有關.

3.3不同脂肪源對點帶石斑魚補體C3的影響

魚類補體C3的激活產物具有吞噬和溶解病原體、調節(jié)和增強體液免疫的重要作用,是魚類免疫力的重要衡量指標之一.本實驗研究發(fā)現,第7、14、28、35天的補體C3,試驗組均不同程度的高于對照組,且差異顯著(P<0.05),其中最高值出現在第28天的葵花籽油組,達106.90 U/mL,但在第21、42、49、56天,試驗組低于對照組或者高于對照組但不顯著(見表3).不同脂肪源對補體C3的提高作用與部分學者研究結果一致,肖溫溫[14]研究發(fā)現飼料中脂肪與蛋白質水平對補體活性的影響顯著(P<0.05),隨著飼料中不同脂肪源與蛋白質含量比的增加呈現先升高后降低的趨勢.這說明了在飼料中添加一定量的脂肪酸對提供魚類補體C3有顯著影響作用.

3.4不同脂肪源對點帶石斑魚溶菌酶的影響

血清中的溶菌酶是抵抗外來物入侵時非特異性免疫調節(jié)因子,其含量的高低可以反映魚體非特異性免疫水平的高低.周小秋等[15]通過調整不飽和脂肪酸n-3和n-6的比例,在總含量保持不變的條件下,發(fā)現對建鯉(CyprinuscarpiovarJian)溶菌酶提高效果顯著.Lin等[16]研究發(fā)現,馬拉巴石斑魚(Arggropsbleekeri)稚魚血清溶菌酶活力隨著飼料中的多不飽和脂肪酸水平的增加而顯著提高.陳威志[17]研究多不飽和脂肪酸對軍曹魚幼魚免疫力的影響發(fā)現,不同比例的植物油、魚油投喂試驗魚,全植物油組的血清溶菌酶活性較低.唐威[13]研究豆油、魚油、牛油及其混合油對斑點叉尾鮰血清中溶菌酶活性的影響,結果表明豆油組活性最高,但與牛油組、魚油組相比無顯著性差異,但顯著高于各比例的混合油組.肖溫溫[14]研究發(fā)現飼料中添加不同脂肪源對大口黑鱸血清溶菌酶活力影響顯著.楊鳶劼等[9]用含不同比例不飽和脂肪酸飼料投喂黃鱔,各試驗組的溶菌酶與對照組相比有不同程度的提高,其中,最高值可達94.90 U/mL.本實驗結果表明,不同脂肪源對點帶石斑魚的溶菌酶含量有一定的影響,花生油組在第14天時,大豆油組在第28天時,魚油組和大豆油在第35天時,均高于對照組.在其他測試時間時實驗組的溶菌酶含量與對照組的差異不顯著或低于實驗組(見表4),這可能與魚類血清中的溶菌酶的周期性變化有關.

綜上所述,在飼料中添加不同脂肪源對點帶石斑魚的四種免疫指標都有不同程度的提高作用,說明添加脂肪酸對于提高石斑魚免疫力有較好的作用.有學者研究發(fā)現魚類對脂肪的需求是有一定適合范圍的,脂肪過多不僅起不到提高免疫力的作用,還會引起脂肪肝等疾病、造成飼料成本升高[18].因此,有必要進一步開展不同脂肪酸源的添加比例以及混合脂肪源飼料對點帶石斑魚免疫力影響的研究.

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EffectsofDifferentFatSourcesonFourImmuneIndicesofEpinepheluscoioides

YANG Ning1,HUAN Hai2,3,CHEN You2,3,MA Jun2,3,CHENG Yan2,3, LIAO Jing-qiu4, WU Huo-lian5

(1.Sanya Science & Technology Academy of Breeding and Multiplication,Sanya Hainan 572000,China;2.School of Life Science and Ecology,Hainan Tropical Ocean University,Sanya Hainan 527022,China; 3.Key Laboratory of Tropic Sea Fishery Protection and Utilization of Hainan Province,Sanya Hainan 527022,China;4.Guangdong Hengxing Co.Ltd.,Zhanjiang Guangdong 524002,China;5.Sanya Energy Conservation & Supervision Center,Sanya Hainan 572000,China)

The effect of 5 kinds of fat feeding sources—corn oil,fish oil, peanut oil, soybean oil, sunflower oil—on the immune capability ofEpinepheluscoioidesis studied, in order to screen the fat source which is beneficial to improve the group resistance.The results showed that the fat sources, among which corn oil has outstanding improvement on the 7th, 28th, 35th, 42nd, 49th day (P<0.05), raise the number of red blood cells of the test group.In the experiment of superoxide dismutase (SOD), in all cycles except for on the 56th day, the content of SOD of the experimental groups is remarkably higher than that of the controlled groups(P<0.05). In the experiment of the complement C3 and lysozyme, the result demonstrated the cyclical movement of the content of the complement C3 and lysozyme in the experimental groups during various test periods.However, different fat feeding source has different effect on the content of the complement C3 and lysozyme in the experimental groups.The results showed that adding fat source in feeding has certain effect of improving the immune capability ofEpinepheluscoioides, but different fat feeding resource has different effect.

Epinepheluscoioides; fat source; immunity

格式：楊寧,黃海,陳友,等.不同脂肪源對點帶石斑魚四種免疫指標的影響[J].海南熱帶海洋學院,2017,24(5):8-13.

2017-05-15

海南省自然科學基金項目(313110)，三亞市院地科技合作項目( 2015YD08)

楊寧(1980-),男, 河北秦皇島人,三亞市南繁科學技術研究院高級工程師,碩士,研究方向為水產養(yǎng)殖動物病害防治.

黃海(1974-),男,海南三亞人,海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護與利用重點實驗室研究員,博士,研究方向為水產養(yǎng)殖.

S965.334

A

2096-3122(2017) 05-0008-06

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.02

(編校李由明)