靶向調控皮膚惡性黑素瘤潛在致病基因CCL18的miRNA預測及表達相關性分析

宋昊 布文博 倪娜娜 溫斯健 熊競舒 戚金亮 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（宋昊、倪娜娜、溫斯健、熊競舒、徐秀蓮、孫建方），皮膚外科（布文博）；南京大學生命科學學院 醫藥生物技術國家重點實驗室（戚金亮）

靶向調控皮膚惡性黑素瘤潛在致病基因CCL18的miRNA預測及表達相關性分析

宋昊 布文博 倪娜娜 溫斯健 熊競舒 戚金亮 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（宋昊、倪娜娜、溫斯健、熊競舒、徐秀蓮、孫建方），皮膚外科（布文博）；南京大學生命科學學院 醫藥生物技術國家重點實驗室（戚金亮）

目的探討靶向調控皮膚惡性黑素瘤潛在致病基因CCL18的miRNA。方法 用miRanda和TargetScan在線軟件進行生物信息學分析，預測靶向調控CCL18基因的miRNA。根據人基因序列分析構建CCL18基因3′UTR雙熒光素酶報告載體及miRNA載體，共轉染293T細胞48 h后裂解細胞并檢測熒光素酶活性。其中，CCL18基因3′UTR雙熒光素酶報告載體分3′UTR突變型組、3′UTR野生型組和空白對照組，miRNA載體攜帶篩選的miRNA。應用實時熒光定量PCR檢測14例黑素瘤新鮮組織及瘤旁正常皮膚組織（對照）中CCL18和篩選miRNA的表達，并對其相關性進行分析。結果在線軟件分析顯示，CCL18?3′UTR具有miR?183、miR?128、miR?33a等miRNA的作用靶點。成功構建熒光素酶報告載體及miRNA載體，熒光素酶活性檢測顯示，miR?183、miR?128的3′UTR突變型組熒光素酶表達量（11.63±0.42；8.80±0.49）明顯高于3′UTR野生型組（4.86±0.39；5.01±0.54）及空白對照組（2.41±0.13；2.39±0.05），差異有統計學意義（均P＜0.01），而miR?33a的3′UTR突變型組熒光素酶表達量與3′UTR野生型組差異無統計學意義（6.41±0.47比6.16±0.22，P＞0.05）。實時熒光定量PCR顯示，14例黑素瘤腫瘤組織中CCL18基因的相對表達量（3.52±1.68）高于對照組織，而miR?183（0.49 ± 0.32）、miR?128（0.30 ± 0.20）、miR?33a（0.46 ± 0.40）的相對表達量均低于對照組織。CCL18表達水平與miR?128表達水平呈負相關（rs= ?0.548，P＜ 0.05），而與miR?183、miR?33a表達水平無相關性（P＞0.05）。結論miR?128可能參與調控皮膚惡性黑素瘤潛在致病基因CCL18。

黑色素瘤；微RNAs；RNA，小分子干擾；趨化因子CCL18

皮膚惡性黑素瘤（MM）的發展與轉移是腫瘤細胞與腫瘤浸潤微環境通過細胞因子等分子信號相互作用的結果，腫瘤浸潤微環境中的關鍵分子對腫瘤的診斷和靶向治療具有重要意義［1］。CCL18是一種半胱氨酸殘基?半胱氨酸殘基型（CC）趨化性細胞因子，參與多種炎癥和腫瘤的發病過程［2］。Chen等、Wang等、Lane等研究發現［3?5］，CCL18在乳腺癌及卵巢癌中均表達升高，促進腫瘤侵襲轉移，并與預后不良有關。本課題組辛崇美等［6］通過細胞學研究發現，CCL18促進A375黑素瘤細胞株侵襲，并促進腫瘤血管生成。進一步研究顯示［7］，CCL18在MM組織中表達升高，并與腫瘤厚度、轉移呈正相關，表明CCL18在MM中具有促進腫瘤侵襲及轉移的“促癌”作用。miRNA可通過與靶基因的mRNA?3′UTR結合調控基因的表達，多種miRNA參與調控黑素瘤的發生發展［8］。為發掘可能調控CCL18基因的miRNA分子，本研究通過生物信息學方法預測可能的miRNA，應用雙熒光素酶報告基因篩選鑒定，并檢測其在MM中的表達。

材料和方法

一、試劑與材料

1.主要試劑：高糖型DMEM培養基、胎牛血清、胰酶（美國Gibco公司），pMD18?T載體（日本Takara公司），T4 DNA連接酶（美國NEB公司），限制性內切酶XbaⅠ（美國MBI公司），DNA聚合酶、pGL3?promoter載體、Trizol試劑、miRNA載體包裝系統（BLOCK?iT? PolⅡmiR RNAi表達載體試劑盒）、設計合成寡聚單鏈（oligo）DNA和包裝質粒（美國Invitrogen公司），雙熒光素酶報告檢測系統（美國Promega公司），Revert Aid First Strand cDNA Synthesis反轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），SYBR Green實時PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.實驗標本與細胞：收集2013—2014年在中國醫學科學院皮膚病醫院經臨床、組織病理學及免疫組化確診并手術擴大切除的14例（男9例，女5例）MM腫瘤組織，其瘤旁正常皮膚組織作為對照。同時，收集患者臨床和病理學資料，包括年齡、性別、部位、大小、有無潰瘍及淋巴結轉移、Breslow厚度、Clark分級和AJCC分期等，14例均為原發性黑素瘤。大腸桿菌感受態細胞DH5α為美國Invitrogen公司產品，293T細胞株由美國Life公司保存。

二、方法

1.靶向調控CCL18基因3′UTR的miRNA預測：利 用 miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）、Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）在線軟件預測可能調控人CCL18 mRNA的靶miRNA。結合其熱力學穩定性（mirSVR score）和保守性（Phast Cons score）等參數，篩選相關分數較高的miRNA（miR?183、miR?128和miR?33a）。

2.全基因合成及CCL18基因3′UTR雙熒光素酶報告載體構建：根據基因庫檢索人CCL18 mRNA序列，設計分別針對miR?183、miR?128、miR?33a結合位點的CCL18?3′UTR突變序列。根據基因序列分析的結果，分別進行單鏈oligo的設計及合成，序列見表1。用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因序列，將合成好的序列裝入pMD18?T載體并轉化至感受態細胞DH5α，測序驗證重組克隆中插入序列與要求一致。基因合成質粒，用XbaⅠ分別將TA克隆質粒及pGL3?promoter質粒進行酶切，電泳并回收目的片段及載體片段，用T4 DNA連接酶連接回收的片段與載體，取10 μl連接產物轉化感受態細胞DH5α，并對單克隆進行測序驗證。

表1 針對各miRNA的CCL18?3′UTR突變序列

3.miRNA載體構建：根據miR ?183、miR?128、miR?33a成熟體序列，分別設計miRNA的表達序列并合成3對互補oligo DNA，序列見表2。將3對合成好的寡聚單鏈DNA用ddH2O溶解，互補單鏈混合后分別按一定體系進行退火、連接及轉化感受態細胞DH5α。序列亞克隆到pcDNA6.2??GW?miR載體中，測序驗證。

表2 各miRNA載體中插入的oligo DNA序列

4.質粒共轉染293T細胞：用胰酶消化293T細胞后，以5×105個細胞/孔接種于6孔培養板中。在細胞覆蓋率90%左右時，以1∶3加入質粒pGL3?promoter和 pcDNA6.2?GW/miR，同 時 加 入lipofectamine 2000稀釋液進行瞬時共轉染。4～6 h后更換完全培養液繼續培養至48 h。實驗分為3′UTR突變型組、3′UTR野生型組和空白對照組：①3′UTR突變型組：pGL3?promoter載體含針對特定miRNA結合位點突變的CCL18?3′UTR序列；②3′UTR野生型組：pGL3?promoter載體含野生型CCL18?3′UTR序列；③空白對照組：空白pGL3?promoter載體。每組設3個復孔。miR?183、miR?128、miR?33a分別進行獨立實驗。

5.熒光素酶活性檢測：收集轉染48 h的293T細胞，每孔加入600 μl細胞裂解液，室溫搖動裂解15 min。將裂解液移至離心管，12 000 r/min（離心半徑10 cm）離心30 s，留取上清液。測量皿中加入100 μl熒光素酶檢測試劑Ⅱ；加入20 μl細胞裂解液，用移液器混勻，置分光光度計讀數值，記錄數據；加入100 μl終止試劑，混勻，讀值并記錄數據，計算相對熒光強度。

6.實時熒光定量PCR檢測CCL18及3種miRNA的表達情況：分別收集14例MM腫瘤組織及正常對照皮膚新鮮組織標本，Trizol法提取組織總RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis反轉錄試劑盒按照標準實驗流程將總RNA反轉錄成cDNA，使用SYBR Green Real?time PCR試劑盒按其說明書擴增目的基因。反應體系如下：cDNA引物1 μl，上下游引物各0.4 μl，SYBR Green Mix 10 μl及去離子水8.2 μl，引物序列見表3。反應條件：95℃5 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60℃1 min，95℃15 s。根據所得的Ct值，以3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）或U6為內參照，△Ct＝（待測基因Ct-內參基因Ct），△△Ct＝腫瘤組織△Ct-對照正常皮膚組織△Ct，計算2-△△Ct，得到腫瘤組織樣品待測基因相對于正常皮膚組織的相對表達量。

表3 待測基因及內參照的引物序列

7.統計學方法：用SPSS19.0統計軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗，相關性分析采用Spearman相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、靶向調控CCL18基因3′UTR的miRNA預測

根據miRanda和TargetScan對CCL18 mRNA?miRNA在線預測結果進行整合分析，CCL18基因（NM_002988，439 bp）的3′UTR 具有多條可能的miRNA靶向序列，其中mirSVR score和PhastCons score均較高的為miR?183、miR?128、miR?33a，并作為后續通過熒光素酶報告系統研究其結合特性的目標miRNAs。各miRNA與CCL18 3′UTR的序列示意圖見圖1。

圖1 CCL18 3′UTR和miR?183、miR?128、miR?33a序列結合示意圖 mirSVR score：熱力學穩定性；PhastCons score：保守性

二、不同miRNA與CCL18 3′UTR結合的熒光素酶活性檢測

miR?183（3組相對熒光強度：11.63± 0.42，4.86±0.39，2.41 ± 0.13）、miR?128（8.80 ± 0.49，5.01 ± 0.54，2.39 ± 0.05）、miR?33a（6.41 ± 0.47，6.16 ± 0.22，2.65 ±0.10）的3′UTR突變型、3′UTR野生型組及空白對照組間熒光素酶表達量差異均有統計學意義（F值分別為394.94、117.90、94.33，均P＜ 0.001）。兩兩多重比較顯示，miR?183和miR?128的3′UTR突變型組熒光素酶表達量均顯著高于3′UTR野生型組及空白對照組（均P＜0.05），而miR?33a的3′UTR突變型和3′UTR野生型組熒光素酶表達量差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

三、MM中CCL18 mRNA和不同miRNA的表達及相關性

14例MM患者的臨床和病理學資料見表4。14例MM組織標本中CCL18 mRNA的表達高于正常對照皮膚組織，相對表達量為3.52±1.68。miR?183、miR?128、miR?33a

的表達均低于對照正常皮膚組織，相對表達量分別為0.49±0.32、0.30±0.20、0.46±0.40。經Spearman相關性分析，14例MM組織中CCL18 mRNA表達量與miR?128表

達量呈負相關（相關系數rs=-0.548，P＜ 0.05），而與miR?183、miR?33a表達量相關性均無統計學意義（rs分別為-0.367、-0.185，均P＞0.05）。

表4 14例CMM患者的臨床及病理學資料

討 論

CCL18是一種主要由單核巨噬細胞及樹突細胞產生的趨化性細胞因子，在乳腺癌、卵巢癌、皮膚T細胞淋巴瘤等多種腫瘤中發揮促進腫瘤細胞侵襲及轉移的重要作用，并成為疾病診斷、預后判斷及治療的潛在靶點［2］。本課題組通過人類全基因組表達譜芯片首次發現CCL18基因在MM中表達顯著升高，并通過組織學及細胞學研究證實CCL18促進腫瘤侵襲、轉移，是MM潛在致病基因之一［6?7］。然而，腫瘤中CCL18基因的調控機制尚未明確，未確定其拮抗性受體。Wang等［9］發現，乳腺癌中上調miR?181b能抑制CCL18誘導的腫瘤細胞侵襲和轉移，miR?181b可能通過下調NF?κB的表達發揮作用。此外，上調let7a也可逆轉CCL18誘導的腫瘤細胞增殖和侵襲，let7a可能通過作用于靶基因Lin28 3′UTR發揮作用［10］。

miRNA是一類長度為20～22個核苷酸的非編碼小RNA分子，通過調節靶基因的表達在多種腫瘤的發生發展中發揮作用。研究發現，在黑素瘤中miRNA主要作為癌基因或抑癌基因來調節黑素細胞及黑素瘤細胞的生物學行為、調節腫瘤免疫反應、影響黑素瘤細胞增殖及凋亡、遷移及侵襲、表觀遺傳等，如miR?211、miR?196a、miR?210、let?7b、miR?182、miR?205、miR?182、miR?29c等［11?13］。miRNA可通過與靶基因mRNA的3′UTR結合調節某些關鍵基因的表達，從而影響腫瘤的發生發展。Alderman等［14］發現，miR?15a直接靶向作用于細胞分裂周期相關蛋白4（CDCA4）基因抑制黑素瘤生長及侵襲。Xu等［15］發現，miR?9通過靶向作用于神經纖毛蛋白1（NRP1）基因發揮抑制黑素瘤細胞生長、遷移和侵襲的作用。Hao等［16］發現，miR?137靶向作用于p21激活激酶2（PAK2）抑制黑素瘤細胞增殖。

我們用生物信息學預測、雙熒光素酶報告基因檢測驗證及在轉錄水平對MM組織中CCL18 mRNA與miRNA進行表達分析，發現miR?128能夠靶向作用人MM組織中CCL18基因的3′UTR，并與CCL18表達具有顯著的負相關，提示黑素瘤中miR?128可能通過參與調控CCL18的表達，進而調控腫瘤的發生發展。

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Prediction of miRNA regulating the potential cancer?promoting gene CCL18 in cutaneous malig?nant melanoma and correlation analysis between CCL18 mRNA and miRNA expression

Song Hao,Bu Wenbo,Ni Nana,Wen Sijian,Xiong Jingshu,Qi Jinliang,Xu Xiulian,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Song H,Ni NN,Wen SJ,Xiong JS,Xu XL,Sun JF）;Department of Dermatologic Surgery,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Bu WB）;State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology,School of Life Sciences,Nanjing University,Nanjing 210023,China（Qi JL）

s:Xu Xiulian,Email:xxlqjl@sina.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo explore the miRNA regulating the potential cancer?promoting gene CCL18 in cutaneous malignant melanoma.MethodsBioinformatics analysis was conducted by using online software miRanda and TargetScan,so as to predict the miRNA targeting CCL18 gene.Three kinds of CCL18 3′UTR dual?luciferase reporter vectors,including mutant 3′UTR vector（mutant 3′UTR group）,wild?type 3′UTR vector（wild?type 3′UTR group）and empty vector（blank control group）,as well as miRNA vectors carring selected miRNAs were constructed according to human gene sequence analysis,and then were used to co?transfect 293T cells.After 48?hour treatment,the cells were lysed for detection of luciferase activity.Real?time fluorescence?based quantitative PCR was performed to measure the expression of CCL18 and selected miRNA in 14 fresh malignant melanoma tissue specimens and 14 paracancerous normal skin tissue specimens（control tissues）,and their correlations were analyzed.ResultsOnline software analysis showed that some miRNAs were identified to target the 3′UTR of CCL18 gene,including miR?183,miR?128 and miR?33a.Luciferase reporter vectors and miRNA vectors were constructed successfully.As luciferase activity assay showed,when miR ?183 and miR?128 were bound to the CCL18 3′UTR,the luciferase activities were significantly higher in their mutant 3′UTR groups（11.63 ± 0.42;8.80 ± 0.49）than in their wild?type 3′UTR groups（4.86 ± 0.39;5.01 ± 0.54;bothP＜ 0.05）and blank control groups（2.41 ± 0.13;2.39 ± 0.05;bothP＜ 0.01）,while there were no significant differences between miR?33a?binding mutant 3′UTR group（6.41 ± 0.47）and miR?33a?binding wild?type 3′UTR group（6.16 ± 0.22,P＞ 0.05）.Real?time fluorescence?based quantitative PCR revealed higher mRNA expression of the CCL18 gene（3.52 ± 1.68）,but lower expression of miR?183（0.49 ± 0.32）,miR?128（0.30 ± 0.20）and miR?33a（0.46 ± 0.40）in the malignant melanoma tissues compared with the control tissues.The mRNA expression of the CCL18 gene was negatively correlated with the expression of miR?128（rs=-0.548,P＜ 0.05）,but showed no significant correlations with the expression of miR?183 and miR?33a（bothP＞ 0.05）.ConclusionmiR?128 may play a role in regulating the potential malignant melanoma?promoting gene CCL18.

Melanoma;MicroRNAs;RNA,small interfering;Chemokine CCL18

徐秀蓮，Email：xxlqjl@sina.com；孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.003

國家自然科學基金（81772916）；江蘇省自然科學基金（BK2012505、BK20171132）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81772916）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012505,BK20171132）

2016?10?24）

（本文編輯：周良佳 顏艷）