CDK2基因沉默聯合達卡巴嗪對B16?F1黑素瘤的生長抑制作用

晉佳路 朱仁書 謝育媛 劉紅春

458030河南，鶴壁職業技術學院醫學院檢驗系（晉佳路、朱仁書）；湖北省食品藥品監督檢驗研究院生物制品檢定所（謝育媛）；鄭州大學第一附屬醫院檢驗科（劉紅春）

CDK2基因沉默聯合達卡巴嗪對B16?F1黑素瘤的生長抑制作用

晉佳路 朱仁書 謝育媛 劉紅春

458030河南，鶴壁職業技術學院醫學院檢驗系（晉佳路、朱仁書）；湖北省食品藥品監督檢驗研究院生物制品檢定所（謝育媛）；鄭州大學第一附屬醫院檢驗科（劉紅春）

目的探討CDK2基因沉默后對達卡巴嗪（DTIC）治療B16?F1黑素瘤抑瘤效應的影響。方法實驗設對照組、CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組，MTT法檢測各組細胞生長抑制情況，計算藥物相互作用指數（CDI值），AnnexinV?FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。建立C57 BL/6小鼠B16?F1細胞移植瘤模型，分組實驗，持續觀察18 d，繪制腫瘤生長曲線，計算腫瘤生長抑制率，TUNEL檢測腫瘤組織細胞凋亡情況。結果與對照組相比，CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組在72h的細胞相對存活率分別為（40.6±2.8）%、（45.2±3.7）%、（28.7±2.1）%，細胞凋亡率分別為（25.1±3.3）%、（15.6±2.2）%和（45.6±3.5）%，細胞相對存活率顯著降低（F=458.04，P＜0.05）而細胞凋亡率顯著升高（F=115.46，P＜0.05），其中CDK2?shRNA+DTIC組比DTIC組的細胞相對存活率顯著降低（P＜0.01），而細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；兩藥相互作用指數（CDI值）＜0.7。治療第6天，對照組、CDK2?shRNA組、DTIC組及CDK2?shRNA+DTIC組的腫瘤體積分別為（185.44±68.97）mm3、（83.91 ± 14.33）mm3、（123.70 ± 20.85）mm3、（34.54 ± 10.72）mm3。從治療的第6天開始，與對照組相比，CDK2?shRNA組、DTIC組及CDK2?shRNA+DTIC組的腫瘤生長速度明顯降低（F=11.819，P＜ 0.05），而CDK2?shRNA+DTIC組的腫瘤生長速度明顯低于DTIC組（P=0.04）；與對照組相比，CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組的腫瘤生長抑制率分別為52.2%、41.2%、86.4%，組織細胞凋亡指數分別為（32.93±3.72）%、（21.62±3.54）%、（63.29±4.74）%，組織細胞凋亡指數顯著升高（F=222.25，P＜0.05），其中CDK2?shRNA+DTIC組的組織細胞凋亡指數顯著高于DTIC組（P＜0.01）。結論沉默CDK2基因的表達可以增加DTIC對黑素瘤的生長抑制作用，二者體外有協同效應，通過增加腫瘤細胞的凋亡是其機制之一。

黑色素瘤；達卡巴嗪；細胞周期蛋白依賴激酶2；基因沉默；細胞凋亡

惡性黑素瘤發生隱匿，在世界范圍內發病率和致死性在持續升高［1?2］。治療惡性黑素瘤主要方式是手術切除和放療，一旦發生轉移，各種化療療效不理想，預后差［3?5］。達卡巴嗪（dacarbazine，DTIC）是第一個由美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的治療惡性黑素瘤的藥物，至今仍作為評價其他藥物對黑素瘤療效的標準［6?8］。然而臨床隨機對照試驗研究顯示DTIC單藥的有效率僅為6%～12%，中位生存5 ～ 6個月［6?8］。其他化療藥物及聯合化療方案與DTIC相比，在臨床Ⅲ期試驗中并沒有表現出明顯優勢［6?9］。因此，有必要針對黑素瘤的特點尋找新的治療方案。CDK2是周期素依賴性蛋白激酶（cyclin dependent kinase，CDK）家族的重要成員，對細胞分裂周期起關鍵作用［10?11］。研究發現，黑素瘤中CDK2的表達非常活躍［12］，且黑素瘤過于依賴CDK2蛋白，而正常的細胞則不太需要這種蛋白［13］，因此下調CDK2基因表達水平有可能阻止或延緩細胞分裂增殖，達到抗腫瘤的目的。我們前期［14?16］針對小鼠黑素瘤構建了重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA，檢測了其基因沉默效應和抑瘤效應，本實驗在前期實驗的基礎上，選擇B16?F1黑素瘤細胞，進行體內、體外試驗，觀察CDK2基因被重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA沉默后，化療藥物DTIC對黑素瘤的生長抑制作用，為臨床應用提供實驗依據。

材料與方法

一、材料

B16?F1細胞（中國典型培養物保藏中心），DMEM培養液、胰蛋白酶（美國Hycolone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙錠（PI）、DTIC（美國Sigma公司），AnnexinV?FITC/PI（南京凱基生物科技發展有限公司），Tunel試劑盒（德國Roche公司）。

二、方法

1.細胞培養：雌性小鼠C57BL/6［許可證號SYXK（豫）2011?0001，合格證SCXK2012?0001］，5 ～6周齡，體重（12±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級環境飼養；小鼠黑素瘤細胞株B16?F1，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養液，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.細胞分組：B16?F1細胞分為4組。①對照組：將B16?F1細胞按3 × 103個/孔接種于96孔板，12 h后不干預；②CDK2?shRNA 組：利用 pUL?CDK2?shRNA重組慢病毒感染B16?F1細胞，將感染的B16?F1細胞按3×103個/孔接種于96孔板，12 h后不干預；③DTIC組：將B16?F1細胞按3 × 103個/孔接種于96孔板，12 h后用250 μmol/L的DTIC孵育；④CDK2?shRNA+DTIC組：用CDK2?shRNA重組慢病毒感染B16?F1細胞，將感染的B16?F1細胞按3 × 103個/孔接種于96孔板，12 h后用250 μmol/L的DTIC孵育。

3.MTT實驗檢測各組細胞的生長抑制作用：將上述4組細胞，每組設3個復孔取均值，并設1組空白對照孔，分別于24、48、72、96 h加入MTT溶液，培養4 h后吸去孔內培養液，加入DMSO 150 μl，避光，置搖床振蕩5 min（150 r/min），使結晶充分溶解，置酶標儀檢測570 nm的A值，空白對照調零，取各組A值的平均值，計算細胞相對存活率。細胞相對存活率%=實驗組平均A值/對照組平均A值 ×100%。實驗重復3次取均值。

采用兩藥相互作用指數（coefficient of drug interaction，CDI）評價兩藥相互作用性質。按下列公式計算CDI值：CDI=AB/（A×B），A或B是單藥組與對照組吸光度值的比值，AB為兩藥聯合組與對照組吸光度值的比值。CDI=1，兩藥作用性質為相加；CDI＜ 1，兩藥作用性質為協同；CDI＜ 0.7時，兩藥作用性質為顯著協同作用；CDI＞1，則兩藥作用性質為拮抗［17］。

4.AnnexinV?FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡：細胞分組方式及實驗干預方式與MTT實驗相同，不同之處是細胞按1.5×105個/孔接種于6孔板，干預72 h后用胰酶消化，離心收集各組細胞，預冷PBS洗2遍，用緩沖液結合緩沖液重懸，制成單細胞懸液，密度為1 × 106/ml。取0.1 ml細胞懸液，加入5 μl FITC?AnnexinV，5 μl PI混勻后，室溫避光反應15 min，流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件分析結果。

5.荷黑素瘤小鼠模型的建立及分組：收集對數生長期B16?F1細胞，離心、用PBS洗滌、重懸、細胞計數、按2×106個細胞/瘤的劑量，接種于C57BL/6小鼠的右側腹股溝皮下。待瘤塊直徑為2 mm時，將荷瘤小鼠分為4組，每組5只。①對照組：采用癌灶多點注射的方法向瘤子注射PBS，觀察18 d；②CDK2?shRNA組：采用癌灶多點注射的方法將pUL?CDK2?shRNA重組慢病毒（滴度為2× 108TU/ml）導入腫瘤灶，每只小鼠200 μl，隔日1次，共6次，觀察18 d；③DTIC組：每隔3天按70 mg/kg劑量腹腔注射DTIC；④CDK2?shRNA+DTIC組：用②和③的方式聯合處理。

6.體內抑瘤效應的觀察：每天觀察小鼠腫瘤生長情況，每隔2天用游標卡尺測量腫瘤的長短徑，按下列公式計算腫瘤體積：腫瘤體積=0.5×瘤體長徑×（瘤體短徑）2，然后根據腫瘤體積繪制生長曲線。

7.抑瘤率測定：實驗18 d后，剝出皮下完整瘤塊，放在稱量紙上稱重，按以下公式計算腫瘤生長抑制率：抑瘤率=（對照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。

8.TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡：石蠟切片脫蠟水化，蛋白酶K 37℃處理組織30 min，PBS漂洗3次后，滴加反應混合物，陰性對照僅加50 μl熒光素標記的dUTP液，37℃加蓋玻片在暗室盒中反應1 h，PBS漂洗3次，滴加POD 50 μl，在濕盒中37 ℃反應30 min，PBS漂洗3次，滴加AEC顯色，蘇木素襯染1 min，水洗藍化，封片劑封片，立即鏡檢拍照，核呈紅色的細胞為凋亡細胞。每例隨機觀察5個高倍鏡視野（×400），計算細胞凋亡指數（apoptosis index，AI），AI=（TUNEL染色陽性細胞數/腫瘤細胞數）×100%。

9.統計學分析：采用SPSS 21.0統計軟件分析，計量資料用±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LDS方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、細胞生長抑制作用檢測

分別于24、48、72、96 h用MTT法檢測各組細胞的生長抑制作用，結果顯示，與對照組相比，CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組細胞相對存活率差異有統計學意義（F24h=514.2，P24h＜0.05；F48h=541.0，P48h＜ 0.05；F72h=458.04，P72h＜0.05；F96h=660.6，P96h＜ 0.05），均顯著降低，表現出對B16?F1細胞的生長抑制作用，且呈時間依賴關系，其中各時間點CDK2?shRNA+DTIC組的細胞相對存活率最低，顯著低于DTIC組（P＜0.05）。計算各時間點的CDI值，均＜0.7，說明重組慢病毒沉默CDK2基因后可增加DTIC對黑素瘤的生長抑制作用，且兩者具有顯著協同效應。見表1。

表1 噻唑藍法檢測各種干預對B16?F1細胞的生長抑制作用（±s）

注：n=3。a：與對照組比，P ＜ 0.05；b：與DITC組比，P ＜ 0.05。DTIC：達卡巴嗪；CDK：周期素依賴性蛋白激酶；CDI值：兩藥相互作用指數

不同時間點細胞相對存活率（%）組別對照組CDK2?shRNA組DTIC組CDK2?shRNA+DTIC組F值P值CDI值24 h 100 60.9±2.1a 70.1±1.5a 47.9±2.2ab 514.2＜0.05a 0.55 48 h 100 46.3±2.5a 50.4±2.3a 37.6±2.4ab 541.0 96 h 100 34.3±1.6a 41.4±2.2a 25.9±2.5ab 660.6 0.41 72 h 100 40.6±2.8a 45.2±3.7a 28.7±2.1ab 458.04＜0.05b 0.320.31

二、細胞凋亡檢測

AnnexinV?FITC/PI雙染法檢測72 h細胞凋亡，對照組、CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組細胞凋亡率分別為（6.3± 1.2）%、（25.1±3.3）%、（15.6 ± 2.2）%、（45.6 ± 3.5）%。與對照組相比，CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組細胞凋亡率差異有統計學意義（F=115.46，CDK2?shRNA組比對照組，P＜0.01；DTIC組比對照組，P=0.003；CDK2?shRNA+DTIC組比對照組，P＜0.01），均顯著升高，其中CDK2?shRNA+DTIC組細胞凋亡率最高，顯著高于DTIC組（P＜0.01），說明沉默CDK2基因后，DTIC對黑素瘤細胞的生長抑制效應增加主要是通過細胞凋亡的誘導實現的。見圖1。

圖1 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡率 Q2為晚期凋亡，Q4為早期凋亡（從左至右依次為對照組、CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組）

三、小鼠黑素瘤生長抑制作用檢測

給C57BL/6小鼠皮下注射一定量的B16?F1細胞，構建皮下黑素瘤模型，第3天可見5 mm3的瘤塊，然后將其分為4組，分別給予PBS、CDK2?shRNA、DTIC、CDK2?shRNA+DTIC進行治療，觀察18 d，每隔2天測量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線，結果顯示，從治療的第6天開始，對照組、CDK2?shRNA組、DTIC組及CDK2?shRNA+DTIC組的腫瘤 體 積 分 別 為（185.44 ± 68.97）mm3、（83.91 ±14.33）mm3、（123.70 ± 20.85）mm3、（34.54 ± 10.72）mm3。與對照組相比CDK2?shRNA組、DTIC組及CDK2?shRNA+DTIC組的腫瘤生長速度明顯降低（F=11.819，CDK2?shRNA組比對照組，P=0.001；DTIC組比對照組，P=0.032；CDK2?shRNA+DTIC組比對照組P＜ 0.01），而CDK2?shRNA+DTIC組的腫瘤生長速度明顯低于DTIC組（P=0.04）。18 d治療結束后，處死小鼠，剝出腫瘤，稱重，計算腫瘤生長抑制率。結果顯示，與對照組相比，CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組腫瘤生長抑制率分別為52.2%、41.2%、86.4%，其中CDK2?shRNA+DTIC組腫瘤生長抑制率最高。實驗結果說明，沉默CDK2基因可以降低腫瘤的生長速度，增強DTIC對黑素瘤的生長抑制率。見圖2。

圖2 各種干預對B16?F1細胞移植瘤的生長抑制效應 2A：腫瘤生長曲線 a：治療第6天，與對照組比較，P＜0.05；b：與達卡巴嗪組比較，P＜0.05；2B：治療結束腫瘤外觀 從左至右依次為對照組、DTIC組、CDK2?shRNA組、CDK2?shRNA+DTIC組。與對照組相比，其他3組的腫瘤體積明顯縮小，其中CDK2-shRNA+DTIC組腫瘤體積最小

四、小鼠黑素瘤組織細胞凋亡結果

TUNEL染色檢測腫瘤組織細胞凋亡情況，細胞核呈紅色為陽性凋亡細胞，隨機選取5個高倍鏡（×400）觀察凋亡細胞數，計算細胞凋亡指數（AI），結果顯示，對照組、CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組的細胞凋亡指數分別為（7.78±1.15）%、（32.93 ± 3.72）%、（21.62 ± 3.54）%、（63.29 ±4.74）%，結果說明，與對照組相比，CDK2?shRNA組、DTIC組、CDK2?shRNA+DTIC組的瘤細胞凋亡指數顯著升高（F=222.25，CDK2?shRNA組比對照組，P＜ 0.01；DTIC組比對照組，P＜ 0.01；CDK2?shRNA+DTIC組比對照組，P＜ 0.01），其中CDK2?shRNA+DTIC組的細胞凋亡指數最高，顯著高于DTIC組（P＜0.01）。說明靶向沉默CDK2基因后，DTIC可誘導更多的細胞凋亡，這可能是其有效抑制腫瘤生長的潛在機制。見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測腫瘤細胞凋亡（AEC染色，×400，紅染的細胞核為凋亡細胞） 第1～4排分別為對照組、CDK2-shRNA組、DTIC組、CDK2-shRNA+DTIC組，與對照組相比，CDK2-shRNA+DTIC組的的細胞凋亡指數最高，顯著高于DTIC組，P＜0.05

討 論

DTIC是一種細胞周期非特異性抗腫瘤烷化劑，主要用于治療轉移性黑素瘤，具有直接的細胞毒作用，通過對核酸的甲基化或直接損傷DNA達到抗癌作用，其不良反應主要是抑制正常細胞增殖［18］。臨床試驗顯示其應答率不高，中位生存5～6個月，單藥的有效率僅為10%，具有較大毒副作用［6?8］。其他用于治療黑素瘤的化療藥物，例如，替莫唑胺、鉑類似物、長春花堿類、亞硝脲類、紫杉烷類等；或者免疫制劑例如，干擾素、白細胞介素2比起DTIC沒有表現出明顯的優勢［6?8］。由于單藥化療的有效率有限，有人提出了聯合化療方案。但聯合化療例如，DTIC+卡莫司汀+順鉑+他莫昔芬，順鉑+長春堿+DTIC，或者生物化療例如，干擾素α+白細胞介素2+3種不同的化療藥物（順鉑/長春堿/DTIC），這些聯合治療方案與DTIC單藥治療相比未顯示出總體存活優勢，或者具有更高的毒性［6?9］。目前，黑素瘤的免疫治療受到重視，抗CTLA?4抗體類藥物和抗PD?1/PD?L1抗體類藥物相繼上市，它們對黑素瘤的治療均顯示出一定療效，但也有局限性［18］。為了探討治療黑素瘤的新方法，我們前期［14?16］構建了 3 個重組慢病毒質粒 pUL?CDK2?shRNA1～3和1個陰性對照重組慢病毒質粒pUL?NC?shRNA，篩選出了基因沉默效應最好的重組慢病毒質粒用于體內外實驗，顯示出對小鼠黑素瘤較好抑瘤效應。本研究中，我們用前期篩選的基因沉默效應最好的重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA與DTIC聯用治療B16?F1黑素瘤，探討其抗瘤效應。

本研究MTT法檢測24、48、72、96 h各組細胞的生長抑制結果顯示，DTIC組在上述不同時間點的細胞相對存活率分別為（70.1±1.5）%、（50.4±2.3）%、（45.2±3.7）%、（41.4±2.2）%，DTIC與重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA聯用后，在上述不同時間點的細胞相對存活率分別為（47.9±2.2）%、（37.6±2.4）%、（28.7±2.1）%、（25.9±2.5）%，顯著降低，兩藥相互作用指數（CDI值）均P＜0.7，表明重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA沉默CDK2基因后，可以增加DTIC對黑素瘤細胞的生長抑制率，且兩者有顯著協同效應。在體外實驗的基礎上，探討了CDK2基因沉默后，體內試驗是否也能增強DTIC的抑瘤效應。我們選用B16?F1細胞移植瘤進行實驗，結果顯示，DTIC單用對移植瘤的生長抑制率是41.2%，DTIC與重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA聯用對移植瘤的生長抑制率是86.4%，顯著高于DTIC單獨的治療效應。

兩藥聯用出現協同效應其機制是復雜的。為了探討pUL?CDK2?shRNA與DTIC聯用出現協同效應的潛在機制，用AnnexinV?FITC/PI雙染法檢測了細胞凋亡情況，結果顯示，DTIC與重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA聯合后的細胞凋亡率（45.6±3.5%）顯著高于DTIC單藥組（15.6±2.2%）。本研究用TUNEL染色法檢測了組織細胞的凋亡情況，結果顯示，DTIC與重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA聯合后組織細胞凋亡指數（63.29±4.74）%顯著高于DTIC單藥組（21.62±3.54）%。本文結果顯示，重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA可以增強DTIC對黑素瘤的抑瘤效應，主要是通過凋亡效應的增強而實現的?？傊?，重組慢病毒pUL?CDK2?shRNA沉默CDK2基因后，可以增強DTIC對B16?F1小鼠黑素瘤的生長抑制作用，顯示出顯著協同效應，為黑素瘤治療提供了一個新的思路。

［1］Tripp MK,Watson M,Balk SJ,et al.State of the science on prevention and screening to reduce melanoma incidence and mortality:The time is now［J］.CA Cancer J Clin,2016.DOI:10.3322/caac.21352.

［2］Mayer JE,Swetter SM,Fu T,et al.Screening,early detection,education,and trends for melanoma:current status（2007?2013）and future directions:Part I.Epidemiology,high?risk groups,clinical strategies,and diagnostic technology［J］.J Am Acad Dermatol,2014,71（4）:599.e1?599.e12;quiz 610,599.e12.DOI:10.1016/j.jaad.2014.05.046.

［3］Mozzillo N,Ascierto PA.Melanoma:the role of surgery in the era of new therapies［J］.J Transl Med,2014,12:195.DOI:10.1186/1479?5876?12?195.

［4］van Zeijl MC,van den Eertwegh AJ,Haanen JB,et al.（Neo）adjuvant systemic therapy for melanoma［J］.Eur J Surg Oncol,2016.DOI:10.1016/j.ejso.2016.07.001.

［5］Bhatia S,Thompson JA.Systemic therapy for metastatic melanoma in 2012:dawn of a new era［J］.J Natl Compr Canc Netw,2012,10（3）:403?412.

［6］Wilson MA,Schuchter LM.Chemotherapy for Melanoma［J］.Cancer Treat Res,2016,167:209?229.DOI:10.1007/978?3?319?22539?5_8.

［7］Hao M,Song F,Du X,et al.Advances in targeted therapy for unresectable melanoma:new drugs and combinations［J］.Cancer Lett,2015,359（1）:1?8.DOI:10.1016/j.canlet.2014.12.050.

［8］Agarwala SS.Current systemic therapy for metastatic melanoma［J］.Expert Rev Anticancer Ther,2009,9（5）:587 ?595.DOI:10.1586/era.09.25.

［9］Yang AS,Chapman PB.The history and future of chemotherapy for melanoma［J］.Hematol Oncol Clin North Am,2009,23（3）:583?597,x.DOI:10.1016/j.hoc.2009.03.006.

［10］Chohan TA,Qian H,Pan Y,et al.Cyclin?dependent kinase?2 as a target for cancer therapy:progress in the development of CDK2 inhibitors as anti?cancer agents［J］.Curr Med Chem,2015,22（2）:237?263.

［11］Flores O,Wang Z,Knudsen KE,et al.Nuclear targeting of cyclin?dependent kinase 2 reveals essential roles of cyclin?dependent kinase 2 localization and cyclin E in vitamin D?mediated growth inhibition［J］.Endocrinology,2010,151（3）:896 ?908.DOI:10.1210/en.2009?1116.

［12］Abdullah C,Wang X,Becker D.Expression analysis and mole?cular targeting of cyclin?dependent kinases in advanced melanoma［J］.Cell Cycle,2011,10（6）:977?988.DOI:10.4161/cc.10.6.15079.

［13］Du J,Widlund HR,Horstmann MA,et al.Critical role of CDK2 formelanoma growth linked to its melanocyte?specific transcriptional regulation by MITF［J］.Cancer Cell,2004,6（6）:565?576.DOI:10.1016/j.ccr.2004.10.014.

［14］晉佳路，朱仁書，謝育媛等.CDK2 shRNA慢病毒載體的構建及其基因沉默效應研究［J］.中國老年學雜志,2015,35（16）:4483?4485.DOI:10.3969/j.issn.1005?9202.2015.16.028.

［15］晉佳路,朱仁書,謝育媛,等.慢病毒載體介導CDK2基因沉默對黑素瘤B16?F1細胞生物學行為的影響［J］.中國腫瘤生物治療 雜 志,2016,23（2）:243?249.DOI:10.3872/j.issn.1007?385X.2016.02.015.

［16］晉佳路,朱仁書,謝育媛,等.shRNA沉默CDK2基因對B16?F1細胞小鼠皮下移植瘤的影響［J］.中華腫瘤防治雜志,2016,23（9）:592?596.

［17］Soica C,Oprean C,Borcan F,et al.The synergistic biologic activity ofoleanolic and ursolic acids in complex with hydroxypropyl?γ?cyclodextrin［J］.Molecules,2014,19（4）:4924?4940.DOI:10.3390/molecules19044924.

［18］Baharara J,Amini E,Nikdel N,et al.The Cytotoxicity of dacarbazine potentiated by sea cucumber saponin in resistant B16F10 melanoma cells through apoptosis induction ［J］.Avicenna J Med Biotechnol,2016,8（3）:112?119.

Inhibitory effect of CDK2 gene silencing combined with dacarbazine on the growth of B16?F1 melanoma

Jin Jialu,Zhu Renshu,Xie Yuyuan,Liu Hongchun
Department of Laboratory Medicine,Medical School of Hebi Polytechnic,Hebi 458030,Henan,China（Jin JL,Zhu RS）;Institute for Biological Products Control,Hubei Institute for Food and Drug Control,Wuhan 430064,China（Xie YY）;Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China（Liu HC）

Liu Hongchun,Email:xingyunerliu@163.com

ObjectiveTo evaluate the antitumor effect of dacarbazine（DTIC）on B16 ?F1 melanoma after CDK2 gene silencing.MethodsCultured B16?F1 melanoma cells were divided into 4 groups:control group receiving no treatment,CDK2?shRNA group infected with a recombinant lentivirus pUL?CDK2?shRNA,DTIC group cultured in 96?well plates followed 12 hours later by the treatment with 250 μmol/L DTIC,CDK2?shRNA+DTIC group infected with pUL?CDK2?shRNA followed 12 hours later by the treatment with 250 μmol/L DTIC.MTT assay was performed to evaluate the growth inhibition of B16 ?F1 melanoma cells,and coefficient of drug interaction（CDI）was calculated.AnnexinV ?FITC/PI double staining was conducted to detect cell apoptosis.C57BL/6 mice were subcutaneously injected with B16?F1 cells at exponential growth phase into the right groin to establish melanoma?bearing mouse models.Twenty mouse models were randomly and equally divided into 4 groups:control mouse group injected with phosphate?buffered solution（PBS）into tumors,CDK2?shRNA mouse group injected with pUL?CDK2?shRNA into tumors,DTIC mouse group injected with DTIC into the abdominal cavity,and CDK2?shRNA+DTIC mouse group treated with pUL?CDK2?shRNA and DTIC.The animal experiment lasted 18 days,and the tumor growth curve was drawn.After 18?day treatment,all the mice were sacrificed,and tumors were isolated and weighed.The tumor growth inhibition rate was calculated,and the tumor cell apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase?mediated dUTP nick?end?labeling（TUNEL）.ResultsAfter 72?hour culture,compared with the control group,the CDK2?shRNA group,DTIC group,and CDK2?shRNA+DTIC group showed significantly decreased relative cell survival rates（40.6% ±2.8%,45.2% ±3.7%,28.7% ±2.1%,respectively;F=458.04,P＜0.05）,but significantly increased cell apoptosis rates（25.1%±3.3%,15.6%±2.2%,45.6% ±3.5%,respectively;F=115.46,P＜0.05）.Additionally,CDK2?shRNA+DTIC group showed significantly lower relative cell survival rates（P＜ 0.01）,but higher cell apoptosis rates（P＜ 0.01）compared with the DTIC group.The CDI value was less than 0.7.On the sixth day after thein vivotreatment,the tumor volumes in the control mouse group,CDK2?shRNA mouse group,DTIC mouse group,and CDK2?shRNA+DTIC mouse group were（185.44 ± 68.97）mm3,（83.91 ± 14.33）mm3,（123.70 ± 20.85）mm3,and（34.54 ± 10.72）mm3respectively.From then on,the CDK2?shRNA mouse group,DTIC mouse group,and CDK2?shRNA+DTIC mouse group showed significantly decreased tumor growth rates compared with the control mouse group（F=11.819,P＜ 0.05）,and the tumor growth rate was significantly lower in the CDK2?shRNA+DTIC mouse group than in the DTIC mouse group（P=0.04）.The calculated tumor growth inhibition rates in the CDK2?shRNA mouse group,DTIC mouse group and CDK2?shRNA+DTIC mouse group were 52.2%,41.2%and 86.4%respectively.Compared with the control mouse group,the CDK2?shRNA mouse group,DTIC mouse group,and CDK2?shRNA+DTIC mouse group showed significantly increased tumor cell apoptosis indice（32.93% ±3.72%,21.62% ±3.54%,63.29% ±4.74%respectively;F=222.25,P＜ 0.05）.Moreover,the tumor cell apoptosis index was significantly higher in the CDK2?shRNA+DTIC mouse group than in the DTIC mouse group（P＜ 0.01）.ConclusionCDK2 gene silencing can enhance the inhibitory effect of DTIC on the growth of melanoma,and show a synergistic effect with DTIC,likely by increasing the apoptosis of tumor cells.

Melanoma;Dacarbazine;Cyclin?dependent kinase 2;Gene silencing;Apoptosis

劉紅春，Email：xingyunerliu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.010

河南省科技發展計劃項目（122300410193）；河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目（2011GGJS?262）

Fund programs:Science and Technology Development Program of Henan Province of China（122300410193）;Foundation for University Young Key Teachers of Henan Province（2011GGJS?262）

2016?11?18）

（本文編輯：吳曉初）