二氧化氯抑制黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒能力及其在高水分玉米中的應(yīng)用

史健陽， 寧 華， 徐 冉， 高珍璇， 余 洋， 劉 保， 柯永培， 孫 群，

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610064；2.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川 成都 610065；3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

二氧化氯抑制黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒能力及其在高水分玉米中的應(yīng)用

史健陽1， 寧 華2， 徐 冉3， 高珍璇3， 余 洋3， 劉 保3， 柯永培4， 孫 群1，3

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610064；2.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川 成都 610065；3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

該文系統(tǒng)研究平板條件下二氧化氯（ClO2)對黃曲霉菌絲生長、孢子萌發(fā)，以及黃曲霉菌產(chǎn)毒能力的抑制作用，考察ClO2對高水分玉米中黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：0.60mg/L ClO2作用40min對黃曲霉菌絲生長抑制率為9.78%，但對黃曲霉毒素B1（AFB1)生成的抑制率達78.22%；0.75mg/L ClO2作用20min即可完全抑制黃曲霉菌絲生長和AFB1產(chǎn)生，因此為最低有效濃度；而1.00mg/L和1.50mg/L ClO2作用5min對黃曲霉菌孢子萌發(fā)抑制率分別達到53.38%和100%；以aw0.92的玉米為載體，9.0mg/L的ClO2作用60min對黃曲霉菌孢子萌發(fā)抑菌率可達86.63%。因此，ClO2對黃曲霉菌絲生長、產(chǎn)毒能力、孢子萌發(fā)都有強烈抑制作用，對抑制高水分玉米中黃曲霉菌孢子萌發(fā)也有顯著效果，有潛力防控倉儲前玉米中黃曲霉菌生長和AFB1污染。

氣體ClO2；黃曲霉菌；黃曲霉毒素B1；玉米

0 引 言

黃曲霉菌（Aspergillus flavus)是一種能通過次級代謝產(chǎn)生一級致癌物AFB1的腐生真菌，普遍存在于發(fā)霉的糧食、糧制品及其他霉腐的有機物上[1-2]，聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計每年至少有2%的農(nóng)產(chǎn)品因黃曲霉毒素污染而浪費[3-4]。熱帶和亞熱帶地區(qū)溫度和濕度等條件適宜各類產(chǎn)毒素真菌生長，在我國，西南地區(qū)的高溫高濕氣候極易導(dǎo)致黃曲霉菌的污染[5]。玉米雜交種正紅311具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗多種玉米病害及適應(yīng)性廣等特點，自2006年至今已在西南地區(qū)推廣1500萬畝（1畝=666.67m2)以上，為西南山區(qū)玉米主推品種之一；但由于潛在的黃曲霉毒素污染限制了其作為大規(guī)模飼料生產(chǎn)原料的范圍，而采摘期常見的高溫多雨和玉米中的高水分是黃曲霉菌生長和產(chǎn)生毒素的有利條件，因此有必要控制倉儲前玉米中黃曲霉菌的生長和毒素生成。

二氧化氯（ClO2)分子具有極強的氧化作用，對微生物的細胞壁有較好的吸附和透過性，可與蛋白質(zhì)中的部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使氨基酸分解破壞，進而控制微生物蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致微生物的死亡[6]。由于氣體具有良好的滲透性、高效性以及無殘留的特點，世界衛(wèi)生組織（WHO)將ClO2定為A1級高效安全消毒劑，可用在果蔬加工領(lǐng)域，美國環(huán)境保護署（EPA)和美國食品與藥物管理局（FDA)也于2006年批準ClO2應(yīng)用于果蔬的采后措施[7-8]。目前，國內(nèi)外已有許多研究利用氣體ClO2處理食品表面，以達到抑制食源性病原菌目的[9-10]。Trinetta等[7]發(fā)現(xiàn)ClO2氣體可以完全抑制Alternaria alternata和Stemphylium vesicarium菌絲生長，有效控制西紅柿采后污染。Sun等[9]在藍莓包裝中充入一定量ClO2氣體后，藍莓在10℃的保藏時間可延長至9d。鐘梅等[11]使用500μL/L的ClO2每3 d處理新疆甜瓜一次，有效降低了甜瓜呼吸率，抑制黃曲霉菌等真菌生長。近幾年，研究者將其應(yīng)用于谷物儲存中以控制黃曲霉毒素對谷物的污染。馬駿等[12-13]通過研究發(fā)現(xiàn)ClO2對甜蕎和苦蕎表面的黃曲霉孢子也有顯著殺滅效果。楊莎等[14-15]以4種不同谷物為載體研究了ClO2對黃曲霉菌的抑菌效果，得出8.5mg/L的ClO2作用于晾干后的玉米30min抑菌率可達99.99%。研究表明接種載體是ClO2影響黃曲霉抑菌效率的主要因素[14]，而初始接種量和濕度等因素也會影響ClO2的抑菌效果[16]。目前，關(guān)于ClO2對以谷物為載體的黃曲霉菌孢子萌發(fā)影響的研究較多，但所獲得的處理條件差異較大，同時缺乏系統(tǒng)研究ClO2在平板上對黃曲霉菌絲生長和產(chǎn)毒能力的影響，以及對采摘后高水分玉米中黃曲霉菌孢子萌發(fā)影響的研究。

一般情況下，霉菌生長包括兩種形式，一是菌絲的無性繁殖，最后產(chǎn)生子實體生成孢子；二是孢子萌發(fā)形成菌絲。對于糧油食品中的黃曲霉來說，其毒素生成是另一個重點關(guān)注的內(nèi)容。本文研究二氧化氯抑制微生物生長，主要從孢子和菌絲，以及對AFB1的生成3個方面全面評估。同時，選取了西南山區(qū)最具代表性的玉米雜交種正紅311為載體，研究了ClO2對高水分玉米中接種黃曲霉菌孢子萌發(fā)的抑制效果，以期為后續(xù)的倉儲應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃曲霉菌篩選于發(fā)霉玉米，16SrRNA測序鑒定為黃曲霉菌（Aspergillus flavus)。在365nm紫外燈下有黃綠熒光，鑒定為產(chǎn)毒黃曲霉菌；玉米雜交種正紅311，平均水分＜14%（由四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)公司提供)。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA)：馬鈴薯200g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 L，自然 pH，121 ℃高壓滅菌20min。

1.3 主要試劑

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫定量測試盒（北京中檢維康生物技術(shù)有限公司)；粉末狀二氧化氯制劑（湖南湘怡源生公司，轉(zhuǎn)化率＞95%，純度≥98%)；其余試劑均為市售分析純。

1.4 實驗儀器與設(shè)備

HR40-IIA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；HH-BII420BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BH-2光學(xué)顯微鏡，日本Olympus。

1.5 實驗方法

1.5.1 ClO2制備

水與二氧化氯藥劑按5mL∶1g的比例混合獲得純度≥98%的ClO2氣體。收集制備好的ClO2氣體，每次使用時用分光光度法測定濃度[17]。

1.5.2 ClO2對黃曲霉菌絲生長的影響

取已制備的黃曲霉孢子懸液（107CFU/mL)5 μL點涂接種于PDA培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)36h后移入無菌操作室。培養(yǎng)皿去蓋，每3皿置于一個3L的已滅菌PVC盒中，密封。按所需ClO2氣體濃度計算出需要ClO2氣體的量X mL，先用注射劑抽取盒中空氣X mL，再注入同等體積的ClO2氣體，即相同體積的ClO2氣體置換出等量的空氣以保持盒中壓力平衡。在標(biāo)準大氣壓下避光處理。作用一段時間后打開盒子，散盡ClO2氣體，將處理后的帶菌培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)，每隔1d測量菌落直徑。以未被ClO2處理的接種平板為對照。

黃曲霉菌絲生長抑制率（%)=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%

1.5.3 ClO2對黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響

取已制備的黃曲霉孢子懸液 （107CFU/mL)100μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基中央，與1.5.2中操作相同。在標(biāo)準大氣壓下避光處理。作用一段時間后打開盒子，散盡ClO2氣體，將處理后的帶菌培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)2d，統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況[18]。

黃曲霉孢子萌發(fā)抑制率（%)=（培養(yǎng)皿面積-帶菌面積)/培養(yǎng)皿面積×100%

1.5.4 ClO2對黃曲霉菌產(chǎn)毒能力的影響

1.5.2中PDA平板培養(yǎng)5 d的黃曲霉菌測量生長直徑并拍照后，用10mm打孔器在每個培養(yǎng)基沿中心向外依次打孔，取3塊帶有菌絲的培養(yǎng)基于50 mL離心管，加入25 mL 70%甲醇水，200 r/min搖床振蕩40min。將提取液用濾紙過濾，用0.22μm有機系濾膜過濾后收集濾液，待用；ELISA試劑盒檢測黃曲霉毒素B1含量，具體方法參見試劑盒說明書。以未用ClO2處理的菌塊作為對照[19]。

抑毒率（%)=（對照組AFB1產(chǎn)量-處理組AFB1產(chǎn)量)/對照組AFB1產(chǎn)量×100%

圖1 ClO2作用濃度對黃曲霉菌落形成的影響

1.5.5 ClO2對玉米中黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響

挑選顆粒飽滿的新鮮玉米，用10%的NaClO浸泡60s后用無菌水洗滌兩次，調(diào)節(jié)水分活度至0.92（正紅311玉米收獲初期水活度平均值)，按10g/瓶分裝在100 mL無菌三角瓶中，每瓶接入106CFU/mL的黃曲霉菌孢子懸液1 mL，膠塞封口。放置1 h后與1.5.2相同ClO2處理方式。處理后每個三角瓶中加入1g/L蛋白胨水90mL，搖床150r/min振蕩2min，然后采用10倍遞增稀釋法稀釋菌懸液，分別進行平板涂布。以未用ClO2處理組為對照。28℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)，參照GB 4789.15——2010《食品安全國家標(biāo)準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》。

孢子萌發(fā)抑制率（%)=（對照組孢子數(shù)-處理組孢子數(shù))/對照組孢子數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 ClO2對黃曲霉菌落形成的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，ClO2處理前后黃曲霉菌落顏色發(fā)生變化。如圖1（a)所示，ClO2處理前黃曲霉呈現(xiàn)黃綠色菌落，0.5 mg/L處理30 min后形成的菌落顏色變淺，大部分菌苔呈白色；0.75mg/L處理后的菌絲呈現(xiàn)枯死倒伏狀，貼在培養(yǎng)基表面。在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到，ClO2處理前黃曲霉菌絲粗壯飽滿（見圖1（b))，分生孢子頭完整；經(jīng)0.5mg/L ClO2處理30min后仍然有較多菌絲，但孢子變少；而0.75mg/L處理后的菌絲斷裂，孢子散亂在孢子頭周圍。由此可見，低濃度ClO2對黃曲霉菌菌落形成有抑制作用，高濃度時導(dǎo)致黃曲霉菌菌絲嚴重受損，其生長完全受到抑制。

2.2 ClO2對黃曲霉菌絲生長的影響

圖2 ClO2作用時間、濃度對黃曲霉菌絲生長的影響

分別考查了不同濃度和處理時間條件下ClO2對黃曲霉菌菌絲生長的抑制效果。如圖2所示，在較低濃度（0.60 mg/L)處理30 min時，最高抑菌率僅有9.78%，隨時間延長抑菌率并無持續(xù)增長。而ClO2濃度為0.75 mg/L和1.00 mg/L時，隨時間增加抑菌率迅速上升，分別作用20min、10min便可完全殺滅黃曲霉菌（培養(yǎng)15 d仍無任何生長跡象)。因此，ClO2對黃曲霉菌絲生長有明顯的抑制作用，且0.75mg/L為平板條件下ClO2的最低有效濃度。在最低有效濃度以上時，ClO2短時間（20 min)處理即可達到良好的抑菌效果，而低于0.75 mg/L時，延長作用時間并不能有效提高抑菌效果。

2.3 ClO2對黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響

通常情況下，抑制孢子萌發(fā)的抑菌劑有效濃度高于抑制菌絲生長的濃度。因此，用低（1.00mg/L)、高（1.50mg/L)兩個濃度的ClO2處理黃曲霉菌孢子，考察其對孢子萌發(fā)的抑制作用見圖3。隨著處理時間增加，兩個濃度的ClO2對黃曲霉菌孢子萌發(fā)的抑制率都在逐漸上升；低濃度處理15 min才可達到的100%抑制率，對于高濃度處理只需要5min。因此，ClO2對黃曲霉菌孢子萌發(fā)有強烈抑制效果，濃度的提升可以大大降低處理時間，這對倉儲條件下高效、簡便應(yīng)用ClO2抑制黃曲霉孢子萌發(fā)具有指導(dǎo)意義。

圖3 ClO2作用時間、濃度對黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響

2.4 ClO2對黃曲霉菌產(chǎn)毒能力的影響

為了評估ClO2對黃曲霉菌產(chǎn)毒能力的影響，采用ELISA法對ClO2處理前后的AFB1含量進行檢測。如表1所示，當(dāng)處理時間為30min時，隨著ClO2濃度的增加，對AFB1的抑制效率逐漸提升；分別用濃度為0.25mg/L和0.50mg/L的ClO2處理后，較對照組AFB1的產(chǎn)量分別減少43.65%和56.69%；繼續(xù)升高作用濃度至0.75mg/L時，AFB1完全被抑制。

表1 ClO2處理濃度對黃曲霉毒素B1生成的抑制作用1）

如表2所示，當(dāng)ClO2處理濃度為0.60mg/L時，隨著處理時間增加，AFB1的抑制效率逐漸提升，當(dāng)作用時間升至40min時，雖然對菌絲生長的抑制率僅有9.78%，但AFB1產(chǎn)量降低了78.22%。可見低濃度ClO2對黃曲霉生長抑制較弱，但對AFB1的生成卻有強的抑制效果。

表2 ClO2處理時間對黃曲霉毒素B1生成的抑制作用

圖4 ClO2作用濃度、時間對玉米（aw0.92)中黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響

2.5 ClO2對玉米中黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響

ClO2對黃曲霉菌的抑制效果與作用時的載體種類、水分含量等因素有關(guān)[16]。以水分活度為0.92的正紅311玉米為載體，用不同濃度、時間ClO2處理。如圖4（a)所示，當(dāng)ClO2濃度為9.00mg/L時，處理60min對黃曲霉孢子的抑菌率可達到86.63%；升高濃度至27.00mg/L抑菌率緩慢增加，繼續(xù)升高濃度至45.00 mg/L時，其抑菌率達到99.36%。用濃度為8～10 mg/L的ClO2處理不同時間時如圖4（b)所示，作用30 min后樣品中黃曲霉孢子萌發(fā)抑制率可達70.87%，隨著時間延長，抑菌率逐漸增高，作用120min時抑菌率為91.34%。

3 結(jié)束語

ClO2對黃曲霉菌菌絲生長和孢子萌發(fā)以及黃曲霉菌的產(chǎn)毒能力都有明顯的抑制效果。在PDA培養(yǎng)基中考察ClO2對黃曲霉菌絲生長的抑制作用時，結(jié)果表明0.75mg/L ClO2為最低有效濃度。當(dāng)處理濃度高于0.75mg/L時，短時間處理可完全抑制黃曲霉菌絲生長和AFB1產(chǎn)生，而低于此有效濃度時，隨著時間延伸抑菌效果并未持續(xù)增長，但AFB1產(chǎn)量下降78.22%，其產(chǎn)毒能力下降，極大降低了AFB1積累帶來的危害。數(shù)據(jù)進一步表明，在低濃度處理條件下，僅用菌絲生長和孢子萌發(fā)情況來評估其抑制效果是比較片面的，還需要結(jié)合產(chǎn)毒能力來綜合分析。

ClO2處理前后黃曲霉菌苔顏色明顯變化，由于ClO2的強氧化能力，破壞了黃曲霉蒽銅類色素，這些色素不但表征了黃曲霉菌苔顏色，還直接參與了黃曲霉毒素的合成[20]，該現(xiàn)象在臭氧處理黃曲霉、黑曲霉時也被觀察到[2]。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，ClO2使黃曲霉菌絲扭曲變形，孢子量減少，可能是ClO2破壞了其細胞壁結(jié)構(gòu)，阻止了黃曲霉正常生長。已有研究表明，曲霉菌產(chǎn)孢量與毒素產(chǎn)量呈正比關(guān)系[21]，當(dāng)然，ClO2對黃曲霉生長代謝抑制的作用機理，需要進一步研究。

以高水分玉米為載體時，ClO2作用時間、濃度都是影響黃曲霉菌孢子萌發(fā)的主要因素。低濃度延長殺菌時間或較高濃度短時間內(nèi)都可以有效抑制黃曲霉菌孢子的萌發(fā)，這與馬駿[12]以苦蕎為載體時ClO2處理黃曲霉菌的研究結(jié)果類似。考慮作用時間太短或濃度過低時，ClO2對高水分玉米中黃曲霉孢子萌發(fā)的抑菌率都較低，故選取9.00mg/L ClO2處理60min可達到較高抑菌率（86.63%)。而楊莎等[14]用8.5mg/L ClO2處理玉米中黃曲霉菌30 min即可達到99.98%的抑菌率，造成差異的主要原因可能是楊莎實驗中以晾干后玉米為載體，而本文中以高水分玉米為載體，水分越高越有利于微生物存活，導(dǎo)致抑菌率下降。此外，接種載體、初始接種量、以及濕度等因素在一定程度上也會影響ClO2的抑菌效果[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)ClO2氣體對黃曲霉菌的生長和產(chǎn)毒能力均有良好的抑制作用，對含高水分的玉米也有著顯著抑菌效果。因此，ClO2在食品、飼料中控制黃曲霉菌生長和毒素積累將具有應(yīng)用價值。本研究小組將進一步探討其抑菌和抑制產(chǎn)毒的機理，為其在食品工業(yè)中的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Inhibitory effect on the growth and aflatoxin-production of Aspergillus flavus by ClO2and its application in corn of high water content

SHI Jianyang1， NING Hua2， XU Ran3， GAO Zhenxuan3， YU Yang3， LIU Bao3， KE Yongpei4， SUN Qun1，3

（1.College of Textiles and Food Science，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Sichuan Provincial Institute of Nature Resource Science，Chengdu 610065，China；3.College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610064，China；4.Agronomy College，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)

The efficacy of gaseous chlorine dioxide（ClO2)on the inhibition of mycelial growth and spore germination of Aspergillus flavus，as well as aflatoxin-producing ability were evaluated.The effect of ClO2on the germination of A.flavus in maize of aw0.92 was also evaluated.Results demonstrated that ClO2noticeably suppressed A.flavus growth， sporulation， and AFB1producing.After the treatment of 0.75 mg/L ClO2for 20 min， the growth of A.flavus was completely inhibited，while the inhibition rates of ClO2at 0.60 mg/L for 40 min was 9.78%and 78.22%for mycelium formation and AFB1development， respectively.On spore germination， after treatment of1.00 and 1.50mg/L ClO2for 5min， the inhibition rates reached 53.38%and 100%，respectively.In addition， the treatment of 9.0 mg/L ClO2for 60 min on corn （aw0.92)resulted in the inhibition rate of 86.63%for spore germination.Accordingly，chlorine dioxide has the potential to be applied for controlling the growth of A.flavus and the pollution of AFB1in corn.

gaseous ClO2； Aspergillus flavus； aflatoxin B1； corn

A

1674-5124（2017）10-0047-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.10.010

2017-06-10；

2017-07-25

四川省科技支撐計劃項目（2016SZ0068)

史健陽（1992-)，女，甘肅平?jīng)鍪腥耍T士研究生，專業(yè)方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。

孫 群（1967-)，女，四川成都市人，教授，博士，研究方向為微生物技術(shù)與食品安全。

（編輯：莫婕）