病原菌核酸檢測技術(shù)在兒童肺炎診斷中的臨床應(yīng)用分析

山東省煙臺毓璜頂醫(yī)院（264000）柳宏波 李愛敏

社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是兒童期尤其是嬰幼兒常見感染性疾病。引起CAP的病原種類繁多，有細菌、病毒、支原體、衣原體、真菌、病原蟲等[1][2]，傳統(tǒng)臨床上對其中細菌病原的診斷一般采用培養(yǎng)法，但培養(yǎng)法耗時較長，容易貽誤病情。近年來，各種分子診斷技術(shù)在臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用，這些技術(shù)包括抗原抗體免疫技術(shù)、基于PCR的技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）等。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是Notomi發(fā)明的一種核酸擴增技術(shù)，基于LAMP的檢測方法具有檢測時間短、靈敏度高和檢測結(jié)果易于判讀等優(yōu)點，能輔助進行病原早期診斷。我們使用北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增芯片法）對本科室2016年收治的30份病例進行了檢測，并與痰細菌培養(yǎng)檢測方法進行了對比。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集痰液樣本30例，均來源于2016年收治的兒童肺炎患者。其中2歲以下的患者18例，2歲～3歲的患者4例，3歲～4歲的患者2例，4歲～5歲的患者5例，5歲～6歲的患者1例。合格的痰液要求白細胞數(shù)大于25/低倍視野且上皮細胞＜10/低倍視野，痰液收集于樣本收集管內(nèi)。

1.2 痰細菌學(xué)檢查 采用自然咳痰法留取痰標本，對留取痰液困難患者，采用吸痰法采集痰標本。將收集的合格痰液標本按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版進行培養(yǎng)和鑒定。

1.3 痰液核酸檢測 使用痰液樣本0.6mL，選擇北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的晶芯?細菌基因組DNA提取試劑盒II（玻璃珠法）作為核酸提取試劑盒進行痰液基因組核酸的提取，使用該公司的呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增芯片法）、RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀和配套軟件對提取的痰液核酸進行檢測，使用核酸檢測試劑盒能檢測常見的8種呼吸道病原（肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌），大約1小時能得到檢測結(jié)果。每個樣本檢測時，取20μL恒溫擴增試劑加入34.5μL提取的核酸混合配成擴增反應(yīng)液，取50μL擴增反應(yīng)液加入芯片進行核酸檢測。

2 結(jié)果

2.1 痰細菌學(xué)檢查結(jié)果 30例患者的痰樣本經(jīng)過培養(yǎng)都得到陽性培養(yǎng)結(jié)果，我們選擇與呼吸道病原菌8項指標一致的檢測項目進行分析，其中有22例陽性培養(yǎng)結(jié)果，檢出率為73.3%，結(jié)果見附表1。其中肺炎鏈球菌陽性例數(shù)最多，為11例，在樣本中的檢出率為36.7%；其次為肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌，各占樣本的13.3%；銅綠假單胞菌的比例為10%。以上結(jié)果與2006年的一項全國性調(diào)查結(jié)果接近[3]，肺炎鏈球菌是肺炎患者中最主要的細菌感染源，其次為肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌的檢出率較高可能是因為其在兒童臨床標本中較常見，當然也不能排除定植菌和環(huán)境污染的影響[4]。

2.2 試劑盒檢測結(jié)果 30例患者的痰液核酸DNA檢測結(jié)果見附表2，肺炎鏈球菌的檢出率最高，為40%，其次肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌檢出率為13.3%，另檢出三例銅綠假單胞菌、一例金黃色葡萄球菌。在試劑盒檢出的肺炎鏈球菌的病例中，有9例與培養(yǎng)法的檢測結(jié)果一致，有2例使用試劑盒檢出肺炎鏈球菌的同時也檢出肺炎克雷伯氏菌，但細菌學(xué)檢查結(jié)果為肺炎克雷伯氏菌陽性；1例試劑盒同時檢出肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的病例，細菌學(xué)檢查結(jié)果為流感嗜血桿菌陽性；試劑盒檢出的3例肺炎克雷伯氏菌陽性病例的細菌學(xué)檢查結(jié)果也是肺炎克雷伯氏菌陽性；試劑盒檢出的3例流感嗜血桿菌陽性病例中，有2例與細菌學(xué)檢查結(jié)果一致。在試劑盒未檢出的病例中，2例細菌學(xué)檢查結(jié)果為肺炎鏈球菌，1例為肺炎克雷伯氏菌，2例為流感嗜血桿菌，3例為銅綠假單胞菌。試劑盒與細菌學(xué)檢測結(jié)果的陽性符合率為77.3%（17/22）。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 分別對兩種檢測方法的肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌檢出情況進行統(tǒng)計分析（附表3、附表4、附表5）。

附表1 細菌學(xué)檢查結(jié)果統(tǒng)計

附表2 呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒檢測結(jié)果

附表3 細菌學(xué)方法和試劑盒檢測肺炎鏈球菌結(jié)果的比較

附表4 細菌學(xué)方法和試劑盒檢測肺炎克雷伯氏菌結(jié)果的比較

附表5 細菌學(xué)方法和試劑盒檢測流感嗜血桿菌的結(jié)果比較

肺炎鏈球菌陽性符合率為81.8%，陰性符合率為84.2%，總符合率為83.3%，試劑盒檢測與細菌學(xué)檢測的結(jié)果一致（Kappa值=64.8%）。

肺炎克雷伯氏菌陽性符合率為75%，陰性符合率為100%，總符合率為96.7%，試劑盒檢測與細菌學(xué)檢測的一致性較好（Kappa值=83.9%）。

流感嗜血桿菌陽性符合率為75%，陰性符合率為96.2%，總符合率為90%，試劑盒檢與細菌學(xué)檢測的結(jié)果一致（Kappa值=71.6%）。

3 討論

兒童是社區(qū)獲得性肺炎的多發(fā)人群，特別是5歲以下兒童的病情常常發(fā)展迅速并且死亡率高。目前，臨床上對社區(qū)獲得性肺炎細菌學(xué)的診斷還主要依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，但痰液的培養(yǎng)耗時較長，而且由于細菌培養(yǎng)有定植菌和非病原菌優(yōu)勢生長甚至環(huán)境菌污染的可能，導(dǎo)致細菌學(xué)結(jié)果與病因相關(guān)性差，容易造成對患者治療的延誤。近年來，LAMP技術(shù)因其快速簡便的特點，已經(jīng)得到了越來越多學(xué)者和專家的推薦，LAMP技術(shù)在肺炎相關(guān)病原的檢測中的應(yīng)用也已經(jīng)有很多報道，比如將LAMP用于肺炎衣原體檢測[5]、腺病毒檢測[6]、呼吸道合胞病毒檢測[7]、肺炎鏈球菌檢測[8]、肺炎常見病原菌檢測等。本研究使用的試劑盒也是基于LAMP技術(shù)，且一次能對8種常見的呼吸道病原菌進行檢測，能大大縮短對未知病原的檢測時間，在實際使用中更具有時效性。

本研究發(fā)現(xiàn)，試劑盒對臨床感染率較高的3種病原，肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌的檢測效果較好，與傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢測方法有較好的一致性。根據(jù)2006年的統(tǒng)計，這3種菌在肺炎病原體檢測中的總陽性率達20%以上[4]，所以我們推薦對初診病人使用本試劑盒進行檢測，這樣能在發(fā)病初期對患者進行分流。

本研究中出現(xiàn)了一些試劑盒檢測結(jié)果與細菌學(xué)結(jié)果不符的情況，其中細菌學(xué)發(fā)現(xiàn)3例銅綠假單胞菌陽性結(jié)果，而試劑盒檢測結(jié)果有2例為銅綠假單胞菌陽性，銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，我們推測這1例樣本的痰液中銅綠假單胞菌數(shù)量過少，細菌學(xué)陽性是因為定植菌生長或環(huán)境污染造成。

使用試劑盒檢測到的幾例兩種致病菌同時陽性的病例中，2例在檢出肺炎鏈球菌的同時檢出肺炎克雷伯氏菌，而細菌學(xué)方法只檢出肺炎克雷伯氏菌陽性；1例同時檢出肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的病例的細菌學(xué)檢查結(jié)果為流感嗜血桿菌陽性；以上結(jié)果顯示出試劑盒檢測方法在混合感染病例檢測中的優(yōu)勢，因為培養(yǎng)法一般只能檢出一種優(yōu)勢生長菌，且優(yōu)勢生長菌可能不是真正的致病菌。

綜上所述，呼吸道病原菌核酸檢測技術(shù)具有較好臨床適用性，能輔助我們對肺炎患者進行早期的診斷。目前，應(yīng)用于臨床的核酸檢測產(chǎn)品越來越多，希望今后能有更多更好的檢測試劑服務(wù)于醫(yī)療機構(gòu)，促進我國醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展。