百草枯通過(guò)激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)人肺Ⅱ型上皮樣A549細(xì)胞凋亡

孫大壯，王蕊，宋春青，許勇民，董雪松

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110001）

· 論著 ·

百草枯通過(guò)激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)人肺Ⅱ型上皮樣A549細(xì)胞凋亡

孫大壯，王蕊，宋春青，許勇民，董雪松

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110001）

目的探討百草枯（PQ）誘導(dǎo)人肺Ⅱ型上皮樣A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體凋亡通路的發(fā)生機(jī)制。方法體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PQ（50、100、150和200 μ mol/L），2組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞核的形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以及線粒體膜電位；分光光度法檢測(cè)caspase-3和caspase-9的活化程度；Western blotting檢測(cè)線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak的表達(dá)。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，PQ對(duì)A549細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用。Hoechst染色顯示，不同濃度的PQ作用于A549細(xì)胞24和48 h后，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征性改變，如細(xì)胞核固縮、核碎裂、凋亡小體形成，并且細(xì)胞的凋亡程度隨著PQ濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。細(xì)胞凋亡率升高也證實(shí)了這一結(jié)果。線粒體膜電位出現(xiàn)不同程度的降低；caspase-3和caspase-9活性不同程度的增加；抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)量降低；促凋亡蛋白Bax、Bak的表達(dá)量升高。以上結(jié)果均呈時(shí)間與濃度依賴性。結(jié)論P(yáng)Q通過(guò)激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

百草枯；肺泡上皮細(xì)胞；線粒體；凋亡

百草枯（paraquat，PQ）化學(xué)名稱為1，1’-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，在過(guò)去幾十年中PQ是全世界使用非常廣泛的一種季胺類高效能除草劑。最近十余年里，服用PQ自殺或PQ意外中毒的發(fā)生率在亞洲特別是中國(guó)呈增加的趨勢(shì)，且死亡率居高不下［1-2］。PQ經(jīng)皮膚、呼吸道和消化道均可吸收。進(jìn)入體內(nèi)的PQ可迅速分布至各個(gè)器官，從而引起機(jī)體多器官功能損害，其中肺組織是PQ中毒的主要靶器官［3］，急性PQ中毒導(dǎo)致患者出現(xiàn)肺水腫、肺泡出血、肺泡上皮間質(zhì)炎癥和損傷［4-5］。中毒患者早期往往死于急性呼吸窘迫綜合征，存活患者逐漸發(fā)展為肺纖維化，最終死于呼吸衰竭。盡管到目前為止，已有很多PQ導(dǎo)致肺損傷及肺間質(zhì)纖維化的研究，但發(fā)病機(jī)制仍不十分明確［6］。PQ的細(xì)胞毒性是通過(guò)損傷線粒體來(lái)實(shí)現(xiàn)的［7-8］，但是PQ導(dǎo)致線粒體功能障礙的確切機(jī)制并不清楚。已有研究表明，肺泡上皮細(xì)胞凋亡是肺纖維化的起始機(jī)制［9］。因此，本研究的目的是探討PQ誘導(dǎo)人肺Ⅱ型上皮樣A549細(xì)胞凋亡機(jī)制，檢測(cè)細(xì)胞線粒體凋亡通路的作用及意義，為臨床治療PQ中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌A549細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。胎牛血清（美國(guó)Gemini公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司），PQ、胰蛋白酶、MTT、DMSO、羅丹明123（美國(guó)Sigma公司），Hoechst染色試劑盒、ECL發(fā)光液和細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所），caspase活性檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（日本DOJINDO公司），Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak、β-actin、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（美國(guó)Proteintech Group公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PQ（分別為50、100、150和200 μ mol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)：以1×105/mL的密度種植在96孔板內(nèi)，每孔100 μ L，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PQ，同時(shí)對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。孵育完成后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μ L混勻，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，吸干每孔內(nèi)的上清，每孔加入DMSO 150 μ L震蕩，使沉淀充分溶解。酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定吸光度值。

1.2.3 Hoechst 33258染色：按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，吸干培養(yǎng)液，加入固定液，固定10 min，吸出固定液PBS洗3次，然后加入Hoechst染液5 min，吸出染液后PBS洗3次，滴一滴抗熒光淬滅液，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：細(xì)胞于6孔板內(nèi)貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。孵育完成后，使用不含EDTA的胰蛋白酶收集2組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入5 μ L的Annexin V-FITC和5 μ L 碘化丙啶室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 線粒體膜電位檢測(cè)：細(xì)胞按處理因素孵育完成后，每孔加入含有1 μ mol/L羅丹明的培養(yǎng)液，避光室溫孵育30 min。使用不含EDTA的胰蛋白酶收集細(xì)胞，PBS洗滌，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位。

1.2.6 caspases活性檢測(cè)：各組細(xì)胞處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌，加入裂解緩沖液，待細(xì)胞裂解完全，10 000 r/min離心1 min收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白濃度定為3 μ g/μ L，吸取50 μ L細(xì)胞裂解產(chǎn)物加入50 μ L的2×緩沖液與5 μ L caspase反應(yīng)底物37 ℃避光孵育4 h。酶標(biāo)儀405 nm測(cè)定吸光度值。

1.2.7 Western blotting 檢測(cè)Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白的表達(dá)：收集各組細(xì)胞并提取蛋白，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度。樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，濕電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TBST稀釋的Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak和β-actin抗體，4 ℃過(guò)夜，洗膜后加入TBST稀釋的二抗，室溫2 h。用ECL顯色，最后進(jìn)行顯影，定影。采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用x-±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間兩兩比較采用Dunnett t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn)。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PQ對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

不同濃度的PQ作用24 h后，與對(duì)照組相比，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞活性分別降至98.25%±0.52%、49.57%±2.74%、41.57%±2.21% 和36.68%±1.61%；相同處理?xiàng)l件48 h后，與對(duì)照組相比，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實(shí)驗(yàn) 組A549細(xì) 胞 活性 分 別降 至95.89%±3.68%、38.23%±3.17%、18.33%±4.84%和10.30%±2.68%。PQ的半數(shù)抑制濃度在24和48 h時(shí)分別為131.92和 96.96 μ mol/L。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度的PQ處理A549細(xì)胞24和48 h后對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of PQ on cell viability of A549 cells after 24 and 48 h

2.2 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)

PQ作用于A549細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，隨著PQ濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，視野中凋亡的A549細(xì)胞數(shù)目越來(lái)越多。凋亡的A549細(xì)胞可清晰地看見(jiàn)核固縮、核碎裂和凋亡小體形成。見(jiàn)圖2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

不同濃度的PQ作用A549細(xì)胞24 h后，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為3.80%±0.50%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率分別為4.94%±1.20%、6.01%±0.78%、7.22%±1.50%和7.64%±1.23%。相同處理?xiàng)l件48 h后，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為 3.85%±0.60%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率分別為5.40%±1.30%、10.48%±2.10%、56.64% ±3.20%和77.43%±4.00%。與對(duì)照組相比，PQ處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率隨著PQ濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。

圖2 不同濃度的PQ處理A549細(xì)胞24和48 h后對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of PQ on morphological changes in A549 cells after 24 and 48 h

圖3 不同濃度的PQ處理A549細(xì)胞24和48 h后對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of PQ on apoptosis of A549 cells after 24 and 48 h

2.4 羅丹明123染色檢測(cè)線粒體膜電位變化

不同濃度的PQ作用24 h后，對(duì)照組A549細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低的比例為4.90%±0.80%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低的比例分別為6.20%±1.29%、7.30%±1.52%、9.00%±1.00%和13.10%±1.50%。相同處理?xiàng)l件48 h后，對(duì)照組A549細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低的比例為4.90%±1.00%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低的比例分別為7.30%±1.05%、30.10%±2.15%、57.00%±2.95%和69.00%±4.00%。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞隨著PQ濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明線粒體膜電位逐漸降低。見(jiàn)圖4。

2.5 分光光度法測(cè)定caspase-3和caspase-9活性

不同濃度的PQ作用24 h后，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的 實(shí) 驗(yàn) 組A549細(xì) 胞caspase-3活性與對(duì)照組相比分別增加2.30%±2.11%、18.40%±5.05%、22.50%±3.61%和35.60%±6.12%，caspase-9活性與對(duì)照組相比分別增加1.00%±2.01%、16.20%±1.60%、20.20%±3.59%和 30.30%±7.11%；相同處理?xiàng)l件48 h后，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的 實(shí) 驗(yàn) 組A549細(xì) 胞caspase-3活 性 與 對(duì)照組相比分別增加4.50%±2.50%、55.60%±4.52%、65.30%±7.60%和 80.10%±5.30%，caspase-9活性與對(duì)照組相比分別增加 3.50%±2.51%、 50.20%±4.62%、68.50%±7.59%和 75.20%±5.63%。結(jié)果表明， caspase-3和caspase-9的活性隨著PQ濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。見(jiàn)圖5。

2.6 Western blotting檢測(cè)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)

圖4 不同濃度的PQ處理A549細(xì)胞24和48 h后對(duì)線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of different concentrations of PQ on mitochondrial transmembrane potential in A549 cells after 24 and 48 h

Western blotting結(jié)果顯示，不同濃度的PQ作用24和48 h后，與對(duì)照組相比，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞隨著PQ濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)促凋亡蛋白Bax、Bak的表達(dá)明顯增加，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)明顯減少。見(jiàn)圖6。

圖5 不同濃度的PQ處理A549細(xì)胞24和48 h后對(duì)caspase-3和caspase-9活性的影響Fig.5 Effect of different concentrations of PQ on activities of caspase-3 and caspase-9 in A549 cells after 24 and 48 h

3 討論

肺臟是PQ作用的主要靶器官。攝入體內(nèi)的PQ在肺組織中的濃度是血漿中濃度的6～10倍，并且在血漿中PQ濃度下降時(shí)，仍可在肺內(nèi)維持［3］。由于PQ可與胺類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)多胺轉(zhuǎn)運(yùn)/攝取系統(tǒng)，經(jīng)Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞攝取，造成廣泛的肺損傷，最終發(fā)展為不可逆的肺纖維化。肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變，也就是正常的肺泡組織被損壞后經(jīng)過(guò)異常修復(fù)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)異常（疤痕形成）。研究［10］表明凋亡在肺纖維化的進(jìn)程中起重要的作用，而且線粒體功能損傷在調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程中非常重要［11］。因此，研究線粒體在PQ誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制具有重要意義，有助于闡明PQ導(dǎo)致肺損傷的發(fā)病機(jī)制，為臨床診治提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

圖6 不同濃度的PQ處理A549細(xì)胞24和48 h后對(duì)Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of different concentrations of PQ on expression of Bcl-2 family proteins in A549 cells after 24 and 48 h

近期有國(guó)外文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道，PQ在肺泡上皮細(xì)胞積累并對(duì)其造成損傷，進(jìn)而干擾抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生的活性氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激對(duì)肺泡上皮細(xì)胞造成損傷，在PQ誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道，PQ引起大鼠肺組織Bcl-2/Bax基因的不均衡表達(dá)［14］，上調(diào)大鼠肺組織線粒體VDAC及caspase-3、caspase-8、caspase-9的表達(dá)［15］。以上研究結(jié)果提示，PQ誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷可能通過(guò)線粒體凋亡通路。因此，本研究通過(guò)MTT、凋亡檢測(cè)、線粒體膜電位檢測(cè)、caspases活性檢測(cè)和Western blotting一系列方法，研究PQ誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制。

MTT是一種常用的實(shí)驗(yàn)方法，用來(lái)研究藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。本研究中MTT結(jié)果表明，PQ對(duì)A549細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。Hoechst染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)以及Annexin V/碘化丙啶染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，是證明藥物是否誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的常用手段。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的A549細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂和凋亡小體形成，并且凋亡率與對(duì)照組相比顯著升高，表明PQ抑制細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要的監(jiān)管作用。細(xì)胞的凋亡受許多內(nèi)在和外在因素的影響，特別是caspase［16］和Bcl-2蛋白家族［17］。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組caspases-3和caspases-9的活性明顯高于對(duì)照組并呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。同時(shí)隨著PQ濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Bax和Bak蛋白的表達(dá)逐漸增加，而B(niǎo)cl-2和Bcl-xL蛋白的表達(dá)逐漸減少。線粒體是能量代謝的中心，其功能障礙可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此線粒體介導(dǎo)的凋亡被視為主要的凋亡通路［18］。其中線粒體跨膜電位的破壞，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體膜電位去極化誘導(dǎo)一些促凋亡因子包括細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來(lái)，激活caspase-9和caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組線粒體膜電位與對(duì)照組相比明顯降低，并呈時(shí)間和濃度依賴性，表明PQ誘導(dǎo)肺上皮樣A549細(xì)胞凋亡可能通過(guò)線粒體凋亡途徑。

綜上所述，本研究以A549細(xì)胞作為人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞模型來(lái)評(píng)估PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，證明PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡通過(guò)線粒體凋亡通路，為新藥的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

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（編輯 陳 姜）

Mitochondria-mediated Apoptosis in Human Lung Type Ⅱ Alveolar Epithelial-like A549 Cells by Paraquat

SUN Dazhuang，WANG Rui，SONG Chunqing，XU Yongmin，DONG Xuesong
（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the apoptosis mechanism induced by paraquat （PQ） in human typeⅡalveolar epithelial-like A549 cells.MethodsA549 cells were cultured in vitro. The cells in the experimental group were exposed to various concentrations of PQ （50，100，150，and 200 μ mol/L），while those in the control group were cultured in RPMI 1640 medium. After treatment for 24 and 48 h，the cell survival rate was assessed by MTT assay. Morphological changes in the nuclei were observed by Hoechst 33258 fluorescence staining.Cellular apoptosis and mitochondrial transmembrane potential were assayed by flow cytometry. The activities of caspase-3 and caspase-9 were assayed by spectrophotometry. Western blotting was used to analyze the expression of proteins in the Bcl-2 family，such as Bcl-2，Bcl-xL，Bax，and Bak.ResultsPQ exhibited significant anti-proliferative activity in A549 cells. PQ-treated A549 cells were subjected to Hoechst 33258 staining. The hallmarks of apoptosis were detected，and the degree of apoptosis increased. Mitochondrial membrane potential was decreased，the levels of active caspase-3 and caspase-9 increased，the expression of Bcl-2 and Bcl-xL was decreased，and the expression of Bax and Bak was increased. These effects occurred in concentration- and time-dependent manners.ConclusionPQ efficiently induced intracellular apoptosis through the mitochondrial pathway in A549 cells.

paraquat； alveolar epithelial cells； mitochondria； apoptosis

R595.4

A

0258-4646（2017）11-0961-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（81471851）；遼寧省博士啟動(dòng)基金（20141033）

孫大壯（1991 -），男，碩士研究生.

董雪松，E-mail：dongxues@163.com

2017-04-14

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