血清可溶性CD146水平在早期糖尿病腎病診斷中的作用

劉波，楊生

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 1. 實驗研究中心動物實驗室； 2. 內(nèi)分泌科，沈陽 110004）

血清可溶性CD146水平在早期糖尿病腎病診斷中的作用

劉波1，楊生2

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 1. 實驗研究中心動物實驗室； 2. 內(nèi)分泌科，沈陽 110004）

目的探討血清可溶性CD146（sCDl46）水平在早期糖尿病腎病（DN）診斷中的作用。方法選用SPF級SD雄性大鼠32只，隨機分為2組：空白組（C組）和模型組（DN組），每組16只。造模開始至實驗結束，每周1次測量大鼠體質量、血糖，收集24 h尿液測定尿白蛋白、尿α1徽球蛋白（AIM）、尿轉鐵蛋白（TRU）、尿糖定性、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酸（NAG）等指標。分別于成模第1天、第3周 2個時間點，測定血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、sCD146水平，并計算大鼠腎質量/體質量比（RW/BW）。腎組織PAS染色觀察腎皮質，計算腎小球系膜面積（MMA）。結果DN 組大鼠尿白蛋白、AIM、TRU、NAG指標明顯高于C組（均P ＜ 0.01）。模型制備成功后第3周Scr、BUN指標DN組均高于C組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。模型制備成功后第1天、第3周模型組血清sCD146水平均較C組增高（均P ＜ 0.05）。RW/BW以及腎組織PAS染色結果顯示，DN組RW/BW以及MMA均高于C組（P ＜ 0.01）。結論與C組比較，DN組中血清sCD146水平較早較快增加，sCD146能夠更敏感地反映腎臟損害程度，對監(jiān)測DN的發(fā)生與發(fā)展有重要臨床意義。

可溶性CD146； 早期糖尿病腎病； 腎臟損害

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，是引起終末期腎病最常見的原因之一，嚴重威脅人類健康［1］。目前尚缺乏可靠的反映早期糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的生物標志物。合理解釋其致病機制以及尋求早期診斷生物標志物，較早地發(fā)現(xiàn)DN并及時治療，對預防終末期腎病有重要臨床價值［2］。

DN早期的病理特點是腎臟肥大，腎小球基底膜增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的細胞外基質進行性積聚。其主要生理改變?yōu)楦邽V過率和微量蛋白尿，隨著病情進展最終導致終末期腎病［3］。然而，研究［7］結果表明高血糖狀態(tài)下氧化應激作用增強使得血管內(nèi)皮細胞受損，產(chǎn)生大量循環(huán)內(nèi)皮細胞。CD146屬于免疫球蛋白（Igsf）家族成員，在內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞以及黑色素瘤等癌細胞中表達，參與并調(diào)控細胞之間黏連、聚集以及調(diào)控細胞遷移和增殖，被認為是內(nèi)皮細胞活動和損傷的標志［4］。可溶性CDl46（soluble CD146，sCD146）為CD146溶解狀態(tài)，當血管內(nèi)皮細胞受到氧化應激以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)改變時導致功能受損，從而激活CD146釋放入血［5］。有研究［6］證實2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細胞受損伴有外周血CD146 mRNA表達增加。外周血sCDl46水平與腎功能水平及機體炎癥狀態(tài)密切相關，能較好地反映DN患者腎臟功能損傷、進展及嚴重程度［7-8］。

本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)大鼠早期DN的動物模型觀察sCDl46在血清中的含量以及和相關腎臟指標之間的關系，旨在闡明其對早期DN診斷的指導意義。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

選用32只SPF級雄性大鼠（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心動物實驗室提供），體質量（200±10） g。隨機均分為空白組（C組）和模型組（DN組）。

1.2 動物模型制備

大鼠正常飲食飲水的條件下適應性飼養(yǎng)1周，造模前大鼠分組編號并稱量體質量、測量隨機血糖值。DN組造模前禁食12 h，次日按60 mg/kg腹腔注射STZ溶液［美國Sigma公司，0.1 mol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液（pH 4.2）配制］，C組僅注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液。造模后所有大鼠自由飲食飲水。1周后模型組隨機血糖＞26 mmol/L為糖尿病動物模型造模成功。

1.3 檢測方法和指標

2組分別在模型制備成功后次日和第3周2個時間點各取材8只。采集腹主動脈血進行化學檢驗、取腎臟稱重并保存在4%多聚甲醛內(nèi)固定。

1.3.1 檢測方法：隨機血漿葡萄糖（fast plasma glucose，F(xiàn)PG）用葡萄糖氧化酶法（拜安捷2型血糖儀及配套血糖檢測試碟）經(jīng)鼠尾靜脈采血檢測。尿白蛋白、尿α1微球蛋白、尿轉鐵蛋白、尿糖定性、血肌酐、血尿素氮由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院檢驗科檢測并提供數(shù)據(jù)。尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酸（N-acetylamino-β-D-glucuronide，NAG）采用ELISA法測定（TSZ公司提供）。血清sCD146含量采用ELISA法測定（TSZ公司提供）。

1.3.2 PAS染色法檢測：將置于4%多聚甲醛內(nèi)固定的腎皮質組織常規(guī)組織脫水，浸蠟，組織包埋制成石蠟切片。 應用PAS染色試劑盒將切片行PAS染色。染色后腎組織切片置于光鏡下（40倍），采用醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)（TJTY-300） 攝入圖像，檢測皮質區(qū)的經(jīng)腎門正切的5個腎小球，并計算腎小球系膜面積（mesangial membrane area，MMA）。

1.3.3 檢測指標：從模型制備成功開始至實驗結束，每周1次測量大鼠體質量及血糖。每周1次用代謝籠收集24 h尿液測定大鼠尿白蛋白、尿α1微球蛋白、尿轉鐵蛋白、尿糖定性、NAG指標。分別于模型制備成功后次日和第3周2個時間點2組各取8只大鼠，腹腔麻醉后經(jīng)腹主動脈采血，收集血液標本并分離出血清，測定血肌酐、血尿素氮、sCD146指標。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)用x-±s表示，應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，2組間指標比較采用t檢驗。采用Pearson法進行相關分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腹腔注射STZ誘發(fā)大鼠糖尿病模型鑒定

測量不同時間段大鼠隨機血糖，4項尿檢指標變化以及腎小球病理改變鑒定模型制備是否成功。模型建立成功第1天，DN組大鼠隨機血糖均＞26 mmol/L，并始終保持至實驗結束。DN組與C組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）。實驗結束時DN組尿白蛋白、尿α1微球蛋白、尿轉鐵蛋白、NAG 4項指標均明顯高于C組（均P ＜ 0.01）；DN組RW/BW以及MMA與C組比較均增大，其中RW/BW差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01），表明DN模型制備成功，見表1、圖1。

2.2 2組血清sCD146水平及與4項尿檢指標的相關分析

模型制備成功后次日和第3周2個時間點，DN組與C組比較血清sCD146增高較快（均P ＜ 0.05），見表1。血清sCD146與尿白蛋白、尿α1徽球蛋白、尿轉鐵蛋白、NAG均呈正相關（r 分別為0.543、0.632、0.230、0.341，均P ＜ 0.05）。模型制備成功后第3周DN組血肌酐、血尿素氮指標均高于C組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05），表明DN尚處于早期。見表2。

表1 2組Scr、BUN、RW/BW、MMA比較Tab.1 Comparison of Scr，BUN，RW/BW，and MMA between two groups

圖1 2組腎小球基底膜及系膜形態(tài) PAS染色 ×40Fig.1 The morphologies of the renal glomerular basal and mesangeal membranes in each group PAS staining ×40

表2 2組隨機血糖、血清sCD146及尿檢4項指標比較Tab.2 Comparison of fast plasma glucose level，serum sCD146 level，and 4 indexes of the urine test between the two groups

3 討論

DN早期發(fā)病沒有明顯的癥狀和體征，早期生物檢測標志物不典型，不敏感，容易錯過疾病最佳治療時期。因而，尋找可靠的早期生物標志物迫在眉睫。隨著基因、核酸以及蛋白組學飛速進展，早期糖尿病腎病生物標志物已不僅包括尿白蛋白等指標［9］。CD146是一種內(nèi)皮細胞黏連分子，在多種腫瘤細胞以及腎小管上皮細胞中表達，是內(nèi)皮細胞活動損傷的標志物［10-11］。它通過調(diào)節(jié)細胞骨架［12］以及參與介導多條信號通路調(diào)節(jié)細胞的增殖以及遷移。除此之外，CD146還能通過腎臟早期發(fā)育中大量表達，腎臟發(fā)育成熟后停止表達的方式動態(tài)調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育［13］。

實驗［7，14］證明高糖狀態(tài)能直接刺激腎小管細胞 CD146合成和表達增加，增加外周血sCDl46水平。其機制可能是由于細胞連接處受損導致CD146釋放增加，進而引起外周血sCDl46水平增加。可能由于高糖環(huán)境下增強的氧化應激作用產(chǎn)生大量的葡萄糖氧化物和活性氧，進一步激活聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制糖酵解途徑，從而影響細胞線粒體能量代謝［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病早期sCD146水平明顯升高，隨著糖尿病發(fā)展至DN期間其水平呈遞增趨勢，2組比較差異顯著，表明血清中sCD146水平與DN的發(fā)展有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型制備成功后次日DN組尿白蛋白尚未明顯高于C組時，血清中sCD146就已升高，表明其比尿白蛋白更敏感，更有利于早期發(fā)現(xiàn)DN［16-17］。

本研究對DN組大鼠血清sCD146水平與尿白蛋白、尿α1微球蛋白、尿轉鐵蛋白和尿NAG 4項指標相關分析發(fā)現(xiàn)，血清sCD146水平與4項指標均呈正相關（均P ＜ 0.05）。尿白蛋白、尿轉鐵蛋白反映腎小球損害程度，尿α1微球蛋白，尿NAG是腎小管損害敏感性指標，因此血清sCD146水平不僅反映腎小球受損的程度，也與糖尿病腎小管病變有關。

綜上所述，血清sCD146的水平在一定程度上能反映腎臟損害程度，對DN的早期診斷和監(jiān)測具有臨床指導意義。

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（編輯 武玉欣）

Diagnostic Significance of Serum Soluble CD146 Level in Early-stage Diabetic Nephropathy

LIU Bo1，YANG Sheng2
（1. Animal Laboratory of Experimental Research Center，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China； 2. Department of Endocrinology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate serum soluble CD146 （sCDl46） level in early-stage diabetic nephropathy.MethodsThirty-two SPF-class SD rats were randomly divided into 2 groups as follows：a control group （C group，n = 16） and a model group （DN group，n = 16）.Serum creatinine （Scr），blood urea nitrogen （BUN），sCDl46 level，and renal weight-to-body weight ratio （RW/BW） were estimated at the first day （D1） and third week （W3） after modelling. Periodic acid-Schiff staining was used for observing the renal cortex and calculating the renal glomerular mesangial membrane area （MMA）.ResultsThe serum sCD146 level was significantly higher in the DN group at D1 and W3 （P ＜ 0.05） compared with that in the C group. RW/BW and MMA were significantly higher in the DN group than in the C group （P ＜0.01）.ConclusionSerum sCD146 level reacts to increases much sooner and faster in the DN model，which could be used as a sensitive diagnostic index to reflect the severity of early renal damage.

soluble CD146； early-stage diabetic nephropathy； renal damage

R765.2

A

0258-4646（2017）11-1005-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.010

沈陽市科學技術計劃（F13-316-1-32）

劉波（1986-），男，助理實驗師，本科.

楊生，E-mail：yangsheng1966@163.com

2017-04-14

網(wǎng)絡出版時間：