北方漢族缺血性腦卒中人群ABCB1基因rs1045642多態性與氯吡格雷抵抗的相關性研究

胡畔，王加璐，何志義

（中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽 110001）

北方漢族缺血性腦卒中人群ABCB1基因rs1045642多態性與氯吡格雷抵抗的相關性研究

胡畔，王加璐，何志義

（中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽 110001）

目的探討中國北方漢族缺血性腦卒中人群ABCB1基因rs1045642多態性與氯吡格雷抵抗（CR）之間可能存在的關系。方法選取110例急性缺血性腦卒中患者，入院后口服氯吡格雷（75 mg/d），于首日給藥前及服用藥物7 d時分別采集靜脈血（2 mL），測定血小板聚集率。CR定義為2次血小板聚集率的變化值不超過10%。所有患者根據結果被分為CR組和非CR（NCR）組。提取基因組DNA后用PCR擴增目的基因并用RFLP法測定SNP。結果ABCB1基因rs1045642位點TT基因型頻率CR組與NCR組比較明顯升高（P = 0.003）。相比于攜帶C等位基因，攜帶T等位基因頻率在CR組明顯高于 NCR 組（P = 0.001）。結論北方漢族缺血性腦卒中患者中，ABCB1基因在SNP位點rs1045642的多態性可能是CR發生的一個獨立危險因素，T等位基因可能是CR發生的風險基因。

缺血性腦卒中； ABCB1基因； 單核苷酸多態性； rs1045642； 氯吡格雷抵抗

網絡出版時間：

腦卒中是嚴重危害人類健康的一種疾病，其發病率、復發率、致殘率及死亡率均高，其中有60%～80%患者為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）［1］。美國心臟學會和美國卒中學會的腦卒中治療指南指出，在IS或短暫腦缺血發作（transient ischemic attack，TIA）患者的治療中，氯吡格雷是重要的抗血小板聚集藥物［2］。作為一種不具備活性的前體藥物，其抗血小板作用并非直接產生，而是需要通過體內的吸收及代謝轉變為具有活性的成分，進而對血小板的聚集產生抑制作用［3］。部分患者在長期服用氯吡格雷情況下仍有缺血事件發生，該現象被稱為氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）［4-5］。藥物代謝動力學及藥效學研究［6］表明，氯吡格雷在體內吸收、代謝、藥理活性均可能受到基因多態性的調節，基因多態性與CR之間的關系受到越來越多學者們的關注［7］。目前對CR的檢測方法沒有統一標準，最常用的方法是對血小板聚集率的測量［8］。

ABCB1基因變異可能會引起個體間藥物吸收代謝差異，影響或干擾氯吡格雷藥物的吸收，從而參與CR的發生［9］。目前國內外針對與氯吡格雷吸收相關的ABCB1基因多態性在IS患者中研究很少。中國是IS的高發國家，對ABCB1基因多態性與CR間關系的研究能夠為抗血小板藥物的個體化治療提供新的依據，對于降低IS事件發生率具有重要意義及臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑包括ADP誘導劑（美國HELENA公司）、全血基因組DNA小量純化試劑盒（WLA057b，沈陽Wanleibio 公司）、Goldview I （G8140，北京 Solarbio公司）、Powder瓊脂糖（11860，Spain）、50×TAE（N10053，北京海利克思公司）、2×Power Taq PCR MasterMix（PR1702，北京BioTeke公司）、引物（上海生工生物工程公司）。儀器包括血小板聚集儀（Aggram）、離心機（LD5-2A）、超純水系統（NW10LVF）、超速冷凍離心機（H-2050R）、微量移液器（Proline）、PCR儀（Life Express）、電泳儀（DYY-7C）、紫外分光光度計（NANO 2000）、凝膠成像分析儀（WD-9413B）。

1.2 研究對象及方法

1.2.1 研究對象：選取2015年3月至2016年10月期間中國醫科大學附屬第一醫院神經內科收治的IS患者110例。研究經過中國醫科大學倫理委員會批準，所有參與本項研究的患者均已告知具體情況并簽署知情同意書。入選標準：年齡≥18歲；NIHSS評分＜26分；急性動脈粥樣硬化性腦梗死和TIA患者。排除標準：心源性或其他不明原因導致的腦梗死；患有血液系統或出血性疾??；血小板計數＞450×109/L或＜100×109/L；近1月內使用對血小板聚集功能有影響的相關藥物；近1個月內進行較大外科手術；氯吡格雷過敏或其他原因導致不能服用；患有癌癥、自身免疫性疾病或其他嚴重臟器疾?。荒挲g＜18歲；非漢族。

1.2.2 研究方法：收集研究對象的臨床資料，包括身高、體質量、血壓、年齡、性別、是否吸煙、曾用藥物等。實驗室檢測包括血尿常規、凝血功能、肝腎功能、空腹血糖、血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高/低密度脂蛋白膽固醇（high / low density lipoprotein cholesterol，HDL-C/LDL-C）等。入院后清晨空腹采集外周靜脈血（5 mL），EDTA抗凝，以用于基因組DNA的提取，并分析ABCB1 rs1045642位點的基因型。研究對象口服氯吡格雷治療，藥物劑量為75 mg/d，于首日給藥前及給藥7 d時采集靜脈血（2 mL），3.2%枸櫞酸鈉抗凝，通過光比濁法測定血小板聚集率（maximal platelet aggregation rate，MPAR），收集的血樣在室溫條件下2 h內進行檢測。將5 μ mol/L二磷酸腺苷 （adenosine diphosphate，ADP）誘導下的MPAR在服用氯吡格雷前和服用7 d后的差值≤10%定義為CR［4］。并由此將入選患者劃分為CR組和非CR（NCR）組。

1.3 基因型檢測

按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取外周血基因組DNA，通過HapMap數據庫對中國北京漢族人群（Chinese Han in Beijing，CHB）樣本進行查詢，選擇本研究的標簽SNP為rs1045642。從NCBI官網公布的dbSNP庫查詢rs1045642的位點序列，之后通過在線網站WatCut進行內切酶查詢，并選定DpnI作為后續實驗選用的內切酶。根據NCBI網站的Genebank數據庫公布的ABCB1序列信息，利用primer premier 5.0軟件進行引物設計。具體如下：F，5’-TGAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3’；R，5’-TACCCCTAAGGCTGACAAAGG-3’。引 物 設 計完成后由生工生物工程技術有限公司（上海）進行引物合成。利用NCBI的BLAST核酸數據庫驗證，產物片段509 bp。PCR反應體系20 μ L，其中DNA模板1 μ L，上下游引物各1 μ L，2×Taq PCR Master-mix 10 μ L，ddH2O 7 μ L。PCR反應條件為：95 ℃ 預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，35個循環后，25 ℃延伸2 min。酶切反應體系20 μ L：ddH2O 7 μ L，10×Buffer 2 μ L，PCR產物10 μ L，內切酶1 μ L。酶切反應后利用3 %的瓊脂糖凝膠對酶切產物進行電泳檢測。

1.4 統計學分析

將患者的一般臨床資料及實驗室檢查結果建立EXCEL數據庫，根據PCR-RFLP實驗結果整理rs1045642位點SNP分型信息，利用SPSS19.0統計分析軟件進行相關的統計分析。采用χ2擬合優度檢驗進行Hardy-Weinberg （H-W）平衡分析。計量資料用x-±s表示，比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。組間基因型及等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗。P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者臨床資料比較

在5 μ mol/L ADP誘導下，MPAR在服用氯吡格雷前和服用氯吡格雷7 d后變化值≤10%共計35例。110例患者中有31.8%歸于CR組（35例），68.2%歸于NCR組（75例）。2組患者年齡、性別、既往卒中史等比較均無統計學差異（P ＞ 0.05）。常規實驗室檢查結果也未見統計學差異（P ＞ 0.05）。見表1。

2.2 PCR-RFLP電泳結果

擴增后的目的基因片段長度為509 bp，若基因型為CC，則存在一個酶切位點DpnI（GA/TC），經過酶切產生2個片段，分別為384 bp及124 bp；若發生變異（C＞T），則雜合子基因將產生3個片段，509 bp、384 bp及124 bp；若基因型為TT，則酶切后表現為單條帶509 bp，見圖1。

表1 2組患者各項臨床指標比較Tab.1 Comparison of clinical indexes between the CR and NCR groups

2.3 H-W平衡檢驗

圖1 PCR-RFLP電泳結果Fig.1 Electrophoresis results for PCR-RFLP

通過H-W平衡檢驗計算，P = 0.995，說明ABCB1 rs1045642位點基因型頻率分布符合H-W平衡（P ＞0.05），即本實驗選擇的樣本基因頻率分布有群體代表性，適合進行遺傳學分析。

2.4 標簽SNP基因型以及等位基因頻率分布

CR組和NCR組ABCB1基因單核苷酸多態位點rs1045642同時存在3種基因型：CC、TT與CT，基因型頻率分別為20.0%、34.3%、45.7%和41.3%、9.04%、49.3%。3種遺傳模式（顯性、隱性及共顯性）下與NCR組比較，CR組TT基因型頻率明顯增高（P ＜ 0.01）；同時，在rs1045642位點中，CR組攜帶T等位基因的頻率顯著高于NCR組（P = 0.001）。CR組和NCR組ABCB1基因單核苷酸多態位點rs1045642在等位基因以及基因型分布方面均表現出統計學差異（P ＜ 0.05）。見表2。

表2 ABCB1基因標簽SNP基因型及等位基因頻率分布 ［n （%）］Tab.2 Genotype and allele frequency distribution for the ABCB1 SNP ［n （%）］

3 討論

因為存在CR，臨床上仍可見到較多的缺血事件再發。因此，已有學者［10］研究CR與基因多態性間的潛在關系。影響氯吡格雷藥物體內吸收代謝的2個主要基因是ABCB1和CYP2C19， CYP2C19已經證實和CR有關［11］。有研究［12］指出，氯吡格雷給藥應根據患者的不同情況及臨床特點決定，這樣有助于對可能出現藥物抵抗的患者進行區分。

P-糖蛋白（P-gp）是一種依賴于ATP在藥物轉運中發揮作用的膜蛋白［13］。其作為外排泵可對抗有機陽離子、氨基酸、多糖和蛋白質等物質而發揮細胞保護作用［14］。ABCB1基因有50多個單核酸多態性位點存在，可以通過對P-gp蛋白表達的直接調控影響氯吡格雷的吸收、代謝。因此，ABCB1基因多態性可能是CR發生的一個因素。目前ABCB1基因的多個SNPs中rs1045642（C3435T）位點受到研究者的廣泛關注，但結論并不統一［15-17］。在印度卒中人群ABCB1基因位點C3435T與阿司匹林抵抗的研究中，C3435T TT基因型攜帶者發生阿司匹林抵抗的風險明顯升高［15］。研究［16］發現，攜帶ABCB1基因rs1045642位點TT基因型的患者在服用氯吡格雷后再發性缺血事件發生的概率較高，而攜帶野生型CC基因型患者復發率沒有增加，與此相反，另一項研究［17］報道，野生型CC基因型個體氯吡格雷治療后具有更高的復發性缺血性事件風險。但是，這些早期的研究主要集中在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者而不是IS患者。

本研究所得結果提示CR的發生與高血壓、吸煙、LDL-C等因素并無明顯相關性。選取ABCB1的1個標簽SNP，對其與CR患者進行關聯性研究，數據表明，在ABCB1基因單核酸多態位點rs1045642檢測中，CR組患者中攜帶 T等位基因的頻率明顯高于NCR組（P = 0.001）。在3種遺傳模式（顯性、隱性及共顯性）下，CR組TT基因型頻率相比于NCR組明顯升高。因此，ABCB1基因多態性位點rs1045642（C3435T）可能與CR發生存在相關性。

本研究尚不能完全排除樣本的選擇導致的結果差異，同時可能存在其他因素影響氯吡格雷吸收、代謝；另外，CR的實驗室診斷方法主要是血小板聚集功能的測定，且目前尚缺乏統一的診斷標準。如果能建立一種可靠的預測方法，預先對篩選出的CR高發患者進行特殊干預，及時調整抗血小板藥物，對IS患者的預后改善有很大的積極意義。通過對CR以及ABCB1基因多態性之間關系探討，進一步證實基因多態性這個內在因素在CR發生中的作用，為臨床醫生選擇抗血小板聚集藥物提供一定的理論依據。

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（編輯 武玉欣）

The Correlation between the ABCB1 rs1045642 Polymorphism and Clopidogrel Resistance among Chinese Han Patients with Ischemic Stroke

HU Pan，WANG Jialu，HE Zhiyi

（Department of Neurology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between the ABCB1 rs1045642 polymorphism and clopidogrel resistance （CR）among Chinese Han patients with ischemic stroke.MethodsIn total，110 patients with acute ischemic stroke were included in the study.Venous blood samples （2 mL） were collected after oral administration of 75 mg/d clopidogrel；the platelet aggregation rate was measured before clopidogrel administration and after 7 days of clopidogrel administration. CR is defined as no more than 10% change in the platelet aggregation rate over two times . Based on the results，patients were divided into the CR group and non-CR （NCR） group. Genomic DNA was extracted，the target gene was amplified by PCR，and the SNP was determined by RFLP.ResultsThe TT genotype frequency of ABCB1 rs1045642 was significantly higher in the CR group than in the NCR group （P = 0.003）. T allele carriers in CR group show much more （57.1% vs 34%，P = 0.001） compared with those in the NCR group.ConclusionThe ABCB1 rs1045642 polymorphism may be an independent risk factor and the T allele may be a gene indicating risk for CR among Chinese Han patients with ischemic stroke.

ischemic stroke； ABCB1 gene； single nucleotide polymorphism； rs1045642； clopidogrel resistance

R743.3

A

0258-4646（2017）11-1019-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.013

胡畔（1987-），女，助教，碩士.

何志義，E-mail：hezhiyi0301@sina.com

2017-03-03