破骨細胞在骨關節炎中的增殖變化及意義*

肖 壯，唐 濤，朱成華， 孫先潤，李亞國，李曉云，李蓮娥

（1.云南省第一人民醫院藥學部，昆明 650034；2.云南省第一人民醫院康復科，昆明 650034；3.云南新昆華醫院藥學部，昆明 650300；4.云南省第一人民醫院骨科，昆明 650034；5.昆明理工大學醫學院康復醫學教研室，昆明 650500）

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.002

破骨細胞在骨關節炎中的增殖變化及意義*

肖 壯1，唐 濤2,5△，朱成華3， 孫先潤4，李亞國5，李曉云2，李蓮娥5

（1.云南省第一人民醫院藥學部，昆明 650034；2.云南省第一人民醫院康復科，昆明 650034；3.云南新昆華醫院藥學部，昆明 650300；4.云南省第一人民醫院骨科，昆明 650034；5.昆明理工大學醫學院康復醫學教研室，昆明 650500）

目的探討破骨細胞（OC）在骨關節炎（OA）各個時期中的增殖變化及臨床意義。方法20只健康成年SD雄性大鼠用改良Hulht手術方法造模，左膝為對照組，右膝為OA模型組。分別于術后1、2、4、8 周時采集全膝關節（n=5），并置于4 ℃多聚甲醛（PFA）液固定，石蠟包埋切片，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、甲苯胺藍（TB）及番紅-O快綠染色，觀察軟骨形態學改變并半定量TRAP染色陽性的OC數量，通過Mankin′s評價OA軟骨破壞的進展，采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。結果兩組間OC均呈快速增高，然后下降的一過性增殖變化。對照組（左膝）在1周時OC數量為（65.20±4.12）個/mm2，2、4周時逐漸減少，分別為（47.20±4.31）個/mm2、（26.20±3.87）個/mm2，8周時幾乎看不到，細胞數為（7.00±2.28）個/mm2；OA模型組（右膝）在1周時OC數量為（70.40±5.46）個/mm2，2周時增加至（86.20±5.42）個/mm2，4周時減少至（38.00±3.16）個/mm2，8周時幾乎看不到，細胞數為（6.21±2.93）個/mm2。模型組OC數量在2、4周時明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論大鼠膝關節OA實驗的早中期OC大量增殖，OC可能參與了骨關節炎的形成。

破骨細胞；骨關節炎；關節軟骨；軟骨下骨；關節損傷

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是臨床常見多發疾病之一，以老年患者多見，具有較高的發病率和致殘率[1]；主要病理改變是軟骨的進行性蛻變及破壞，風險因素包括年齡、負重改變及外傷等，但發病機制仍不清楚。基礎和臨床研究多集中于軟骨細胞凋亡[2]與細胞因子[如白細胞介素（IL）-1、IL-18、腫瘤壞死因子（TNF）-α、基質金屬蛋白酶（MMPs）家族]等方面[3]，對破骨細胞（osteoclast，OC）在OA整個發病過程中的增殖變化與臨床防治意義方面的關注甚少。本研究擬通過觀察OC在大鼠OA模型中各時期的增殖變化，探討OA的相關發病機制，為臨床更合理地預防和治療OA提供一定的實驗理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特殊病原體（SPF）級8周齡雄性SD大鼠20只（體質量240～260 g）用于本次實驗，均由昆明理工大學動物實驗室提供。

1.2主要試劑及儀器 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒；番紅-O快綠染色劑；生物組織包埋機；光學顯微鏡（日本O-LYMPUS公司）；滑行式組織切片機（日本Funakoshi公司）。

1.3方法

1.3.1大鼠OA模型的制備 采用改良Hulht[4]手術方法制造OA動物模型：大鼠左右膝關節經剃毛、消毒后，右膝關節切斷內側副韌帶（MCL）、前交叉韌帶（ACL）并切除內側半月板（MM），行抽屜實驗確認，用無菌生理鹽水沖洗關節腔，消毒并縫合術口；左膝關節僅切開關節腔，不傷及MCL、ACL、MM，然后用無菌生理鹽水沖洗關節腔，消毒、縫合術口。自然喂養，手術當天和術后第1天給予抗菌藥物預防感染。

1.3.2標本收集及檢測方法 （1）分別于術后1、2、4、8周時，選5只大鼠，乙醚麻醉后置于組織攝片機下，X射線對膝關節進行組織攝片。（2）組織攝片完成后處死大鼠，取全膝關節（n=5）。去皮后快速置入4 ℃，4%多聚甲醛（PFA）中固定。左側膝關節為對照組；右側膝關節為模型組。經20%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣后，將全膝關節沿髕尖韌帶正中線矢狀面一分為二切開，常規系列脫脂、脫水、石蠟包埋，切片厚5 μm于4 ℃冷藏備用[5]。（3）TRAP、甲苯胺藍（TB）及番紅-O快綠染色：切片脫蠟至水，蒸餾水浸洗，TRAP染色，浸入TRAP液避光孵育1 h（按試劑盒說明書操作）；TB染色，浸入TB 5 min；番紅-O快綠染色，浸入番紅-O液5 min后迅速浸入快綠液。蒸餾水3次浸洗多余染液； 逐級乙醇（70%、75%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片備查。

1.3.3OC半定量 對軟骨下骨組織中TRAP染色陽性的OC進行分析測定：200倍鏡下選取不相重疊的5個代表性視野，測量單位面積陽性細胞個數（紅色區域內核數量大于或等于2個且緊密堆積細胞核團計為1個OC），見圖1。

1.3.4關節軟骨形態學變化-Mankin′s評分標準 關節軟骨Mankin′s評分標準：（1）軟骨結構，光滑整齊如常為0分；表面出現不規則裂痕為1分；裂痕深達輻射層為2分；裂痕深達移行層為3分；裂痕深達鈣化層為4分；軟骨脫落為5分。（2）軟骨細胞，數量正常為0分；數量彌漫性增多為1分；出現大量簇集樣細胞團為2分；數量減少3分。（3）番紅-O快綠染色，正常染色為0分；染色輕度減少為1分；染色中度減少為2分；染色重度減少為3分；染色完全消失為4分。（4）TB染色，正常染色為0分；染色輕度減少為1分；染色中度減少為2分；染色重度減少為3分；染色完全消失為4分。（5）潮線完整性，完整為0分；多重潮線為1分；軟骨下骨血管入侵潮線為2分。

圖1 OC TRAP染色（A）及陽性細胞半定量（B）示意圖

2 結 果

2.1膝關節X射線攝片 通過X射線攝片觀察（1、2周X射線攝片觀察沒發現關節有明顯變化，故省略），模型組8周時呈現OA的典型表現：關節表面不平整、關節間隙狹窄、骨質質密化和囊性變，骨質增生并伴骨贅形成（圖2）。

2.2TRAP染色及OC數量變化 脛骨軟骨下骨TRAP染色結果顯示：對照組在1周時可見大量TRAP染色陽性的OC，2周時開始逐漸減少，8周時幾乎看不到；模型組在1周時可見大量OC，2周時明顯增加，4周時開始減少，8周時幾乎看不到。1、2、4、8周時OC數量分別為：對照組（65.20±4.12）個/mm2、（47.20±4.31）個/mm2、（26.20±3.87）個/mm2、（7.00±2.28）個/mm2；模型組（70.40±5.46）個/mm2、（86.20±5.42）個/mm2、（38.00±3.16）個/mm2、（6.21±2.93）個/mm2，模型組OC數量在2、4周時高于對照組，兩組之間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

A：對照組4周；B：模型組4周；C：對照組8周；D：模型組8周；模型組8周時呈現典型的OA表現：骨面粗糙（a），骨質密度增加、硬化（b），骨質增生（c），囊腔形成（d），關節間隙變窄（e）
圖2膝關節X射線攝片

A、B、C、D：對照組；E、F、G、H：模型組
圖3脛骨下骨TRAP染色（×40）

A、B、C、D：對照組TB染色；E、F、G、H：對照組番紅-O快綠染色；I、J、K、L：模型組TB染色；M、N、O、P：模型組番紅-O快綠染色
圖4膝關節脛骨軟骨面TB及番紅-O快綠染色（×100）

2.3關節軟骨的破壞及Mankin′s評分 脛骨關節軟骨面經TB及番紅-O快綠染色后，光鏡觀察：對照組軟骨表面光整，軟骨4層結構清晰可見，在1～8周的觀察中變化很小，TB和番紅-O快綠染色正常；模型組在第1周時與對照組相當，但在第2周時軟骨細胞即大量減少，表面出現不規則裂痕，染色中重度減少。至4周時軟骨幾乎全部脫落，染色消失，軟骨下骨血管入侵至潮線。各期Mankin′s評分為：對照組1分（1周）、2分（2周）、5分（4周）、6分（8周）；模型組3分（1周）、10分（2周）、17分（4周）、17分（8周），2、4、8周時兩組間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。

3 討 論

筆者通過手術切斷大鼠右膝關節MCL、ACL、MM建立OA疾病模型[4]，與同體異肢未傷及韌帶的左膝關節（對照組）進行對照，模型組關節軟骨的破壞程度明顯高于對照組，8周時X射線攝片呈典型的OA病理改變。實驗結果表明，切斷關節韌帶會導致OA的形成。軟骨下骨TRAP染色結果顯示，對照組與模型組在術后1周時OC數量分別為（65.20±4.12）個/mm2和（70.40±5.46）個/mm2，兩組間差異無統計學意義（P>0.05）；第2周時對照組OC數量減少至（47.20±4.31）個/mm2，模型組則增加至（86.20±5.42）個/mm2，差異有統計學意義（P<0.05）；第4周時，對照組為（26.20±3.87）個/mm2，模型組也減少至（38.00±3.16）個/mm2（P<0.05）；至第8周時，對照組為（7.00±2.28）個/mm2，模型組為（6.21±2.93）個/mm2（P>0.05），兩組OC數量均明顯減少，鏡下幾乎看不到。OC在關節損傷后大量增殖，與Bertuglia等[6]的研究結果一致。不過，本實驗還觀察到關節損傷-康復的整個周期中OC的增殖呈早期快速增高，然后下降的一過性變化，模型組OC的增殖比對照組多，持續時間更長。

OC是一種巨大的多核細胞，起源于單核巨噬細胞/單核系造血前體細胞，具有重要的骨吸收功能，其骨吸收作用與成骨細胞的骨形成作用維持著骨代謝的動態平衡，是人體維系正常骨組織更新，維持骨骼的正常硬度與彈性的關鍵。OC的形成、活化及凋亡受機體眾多因素的調節，為盡量規避大鼠個體間差異的影響，本實驗采用同體異肢進行對照。關節經手術造成損傷后，局部炎癥形成，大量的炎性因子和細胞因子聚集、形成，促進OC大量增殖、分化、成熟和活性增加[7-9]。隨著損傷的逐步修復，炎癥減輕，OC的增殖也逐漸降低。模型組OC的增殖更多，持續時間更長的原因，可能是切斷MCL、ACL、MM后創傷更大、炎癥更重，導致OC增殖、分化更多；同時，韌帶切斷后關節不穩定，恢復較對照組慢，大鼠活動時即以對照側為主要支撐，模型側處于失重狀態，力學刺激減少，OC形成和活化，OC增殖進一步增加[10-11]。

OC大量形成與活化，骨吸收作用極大增強，軟骨下骨基質及鈣化層中有機質和無機礦物質被大量降解，骨質破壞，吸收陷窩形成，骨面坑洼不平，不能將軟骨所承受的壓力均勻分散與傳遞，軟骨在外壓力下直接受損、破裂，局部炎癥形成，炎性因子和細胞因子等形成并聚集，軟骨代謝改變，軟骨內形成骨化點，次級骨化中心形成[12]。另一方面，軟骨下骨連接著骨與軟骨，具有傳導垂直應力、抵抗剪切應力等作用[13]，其結構改變將直接影響所支撐的軟骨的結構和功能，導致軟骨鈣化增加及軟骨損傷。大量OC增殖和活化，打破了軟骨下骨的代謝平衡，促使軟骨下骨重塑增加。軟骨下骨的代謝改變及重塑與OA的發生、發展密切相關，軟骨和軟骨下骨相互作用，形成惡性循環，貫穿 OA病程始終[14-15]。

結合實驗結果，筆者認為，OC大量增殖和活化后，骨吸收大幅增加，骨質被破壞，骨基質表面不平導致關節軟骨受壓而直接損傷，以及由骨吸收病理性增加導致的軟骨下骨骨代謝動態平衡改變，骨重塑增加，是形成OA的又一原因。在嚴重關節損傷的臨床治療中，應注意對OA早期的預防處理。OC在早中期OA中的一過性高增殖，為OA防治提供了新的靶點，也為選擇防治的最佳時間提供了科學、合理的實驗理論依據。早期預防性使用OC抑制劑或許是防治OA的又一有效方法。

綜上所述，大鼠膝關節骨關節炎實驗的早中期OC大量增殖，表明OC可能參與了骨關節炎的形成。

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Proliferationchangeandsignificanceofosteoclastsinosteoarthritis*

XiaoZhuang1,TangTao2,5△,ZhuChenghua3,SunXianrun4,LiYaguo5,LiXiaoyun2,LiLiane5

（1.DepartmentofPharmacy,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650034，China; 2.DepartmentofRehabilitation,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650034，China; 3.DepartmentofPharmacy,NewKunhuaHospital,Kunming,Yunnan650300，China; 4.DepartmentofOrthopedics,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650034，China; 5.TeachingandResearchingSectionofRehabilitation,MedicalCollegeofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650500，China）

ObjectiveTo explore the proliferative changes and clinical significance of osteoclasts （OC） in various stages of osteoarthritis （OA）.MethodsTwenty healthy adult male SD rats were made the model by modified Hulht procedure,the left knee served as the control group and the right knee as the OA model group.The total knee joint （n=5） was collected at postoperative 1,2,4,8 weeks,fixed at 4 ℃ 4% poly formaldehyde（PFA） liquid,embedded by paraffin for conducting sections,and stained by TRAP,toluidine blue（TB） and safranine O （Saf O）fast staining.Then the cartilage morphology change was observed and OC positive cells number with TRAP staining were semi-quantitatively detected,the OA cartilage destruction progression was evaluated by Mankin ′s method and SPSS17.0 statistics software was used to conduct statistical analysis.ResultsOC in the two groups showed the transient change of rapidly increasing and then decreasing.The OC number at 1 week in the control group （left knee） was （65.20±4.12） cells/mm2,and was gradually reduced at 2,4 weeks,which were （47.20±4.31） cells/mm and （26.20±3.87） cells/mm2,which at 8 weeks was almost invisible,the number of cells was （7.00±2.28） cells/mm2;the OC number at 1 week in the OA model group （right knee） was （70.40 ± 5.46） cells/mm2,increased to （86.20±5.42）cells /mm2at 2 weeks,reduced to （38.0±3.16） cells/mm2at 4 weeks,was almost invisible at 8 weeks,the number of cells was （6.21±2.93） cells /mm2.The OC number at 2,4 weeks in the model group was significantly higher than that in the control group,the difference had statistical significance （P<0.05）.ConclusionLarge numbers of osteoclasts are proliferated in the early and middle stages of rat knee osteoarthritis,which indicating that OC might be involved in the formation of osteoarthritis.

osteoclast;osteoarthritis;articular cartilage;subchondral bone;joint injury

云南省應用基礎研究計劃項目（2013FZ182）；昆明理工大學引進人才基金資助項目（KKZ3201460023）。

肖壯（1982-），主管藥師，在讀碩士，主要從事骨關節炎基礎及藥物治療的研究。△

,E-mail：taoer2324@sina.com。

R684.3

A

1671-8348（2017）30-4181-04

2017-01-18

2017-04-06）