超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定桑葚中噻蟲嗪殘留量

李國(guó)烈，蘇 旭，杜 鑫，覃明麗，蔣金芳

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定桑葚中噻蟲嗪殘留量

李國(guó)烈，蘇 旭，杜 鑫，覃明麗，蔣金芳

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，四川南充 637000)

建立了桑葚中噻蟲嗪殘留檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS)。桑葚樣品經(jīng)乙腈提取，石墨化碳黑氨基復(fù)合柱(Carbon/NH2)凈化，以甲醇和0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式進(jìn)行采集，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，噻蟲嗪在1.00~200 μg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R大于0.99，方法檢出限為0.20 μg/kg，測(cè)定下限為0.80 μg/kg。在1.00~100 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，準(zhǔn)確度(90.46%~97.20%)、精密度(2.46%~5.48%)和提取回收率(90.46%~99.16%)均滿足分析方法要求。該試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，靈敏，選擇性好，精密度高。

桑葚；噻蟲嗪；殘留；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

噻蟲嗪化學(xué)名稱為3-(2-氯-噻唑-5-甲基)-4--硝基亞胺-1,3,5-噁二嗪，屬于噻煙堿類化合物亞型，是第2代新煙堿類化合物的典型代表，主要作用于昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是煙堿型乙酰膽堿受體的抑制劑[1-2]。由于昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體與脊椎動(dòng)物的煙堿型乙酰膽堿受體的結(jié)構(gòu)具有一定差異性，從而導(dǎo)致了其對(duì)害蟲高效，而對(duì)高等動(dòng)物低毒的高選擇性[3-4]。該劑對(duì)鞘翅目、雙翅目、鱗翅目，尤其是同翅目害蟲有高活性，可有效防治各種蚜蟲、飛虱類、粉虱、葉蟬、金龜子幼蟲、線蟲、地面甲蟲、潛葉蛾等害蟲及對(duì)多種類型化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的害蟲，且與吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺無交互抗性，現(xiàn)被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[5-6]。已報(bào)道的關(guān)于噻蟲嗪在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留檢測(cè)主要涉及到谷物[7-10]、蜂蜜[11]、蔬菜[12-16]、水果[17]和茶葉[18]，檢測(cè)分析方法包括高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜質(zhì)譜法[17]。到目前為止，尚未見關(guān)于噻蟲嗪在桑葚中的殘留檢測(cè)報(bào)道，本試驗(yàn)建立了桑葚中噻蟲嗪殘留檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS)，以期為桑葚中噻蟲嗪的殘留檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品和試劑

噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所(天津)(編號(hào)GSB05-165-2008)，甲醇、乙腈、甲苯、甲酸均為色譜級(jí)，購(gòu)自Fisher公司。

1.2 儀器和設(shè)備

超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(Waters，UPLC-TQS)，色譜柱(Waters，Xbridge C18，3.5 μm 3.0×50 mm)，超純水儀(Millipore，Milli-Q)，旋渦混合器(IKA，Vortex Genius 3)，搖床(IKA，HS501)，離心機(jī)(Sigma，3-18KS)，氮吹儀(Organomation，N-EVAP112)，固相萃取小柱(Agilent，Mega BE CARB/NH2500 mg/6 mL)，固相萃取裝置(Agilent)，50 mL離心管(Eppendorf)以及微孔濾膜(津騰，PTFE 0.22 μm)等。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取勻漿后的桑葚樣品10.00 g于50 mL離心管中，加入20.00 mL乙腈，置于搖床上振搖30 min，加入5 g氯化鈉，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，置于離心機(jī)中10 000 r/min離心10 min，移取上清液10.00 mL待凈化。

1.4 樣品凈化

將上述10.00 mL提取液加入已用5 mL乙腈＋甲苯(體積比3∶1)預(yù)淋洗的Mega BE CARB/NH2柱，收集淋洗液，再用25 mL乙腈＋甲苯(體積比3∶1)分5次洗脫，合并淋洗液，于40 ℃氮吹至近干，用5.00 mL 50%甲醇定容，旋渦混合器混勻后過0.22 μm濾膜，待檢測(cè)。

1.5 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

流動(dòng)相采用甲醇、乙腈和含有0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表1，流動(dòng)相使用前用超聲波脫氣。色譜柱溫：35 ℃，樣品室溫度：16 ℃，進(jìn)樣量：2 μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式進(jìn)行采集。脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)猓髁糠謩e為1 000 L/h和150 L/h，碰撞氣為高純氬氣，流量為0.10 mL/min，脫溶劑溫度為500 ℃。定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞電壓等相關(guān)參數(shù)見表2。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限

分別取一定量的噻蟲嗪標(biāo)品溶液用桑葚空白基質(zhì)配制成濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用1.5儀器條件進(jìn)行分析，以噻蟲嗪定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Masslynx V4.1軟件繪制。檢測(cè)限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品進(jìn)行測(cè)定，采用Masslynx V4.1軟件計(jì)算噻蟲嗪的信噪比(S/N)，以S/N≥3時(shí)的樣品濃度為方法檢測(cè)限[19]。

表2 測(cè)定噻蟲嗪在桑葚中殘留的質(zhì)譜參數(shù)

1.7 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度試驗(yàn)采用加標(biāo)回收試驗(yàn)法。取空白桑葚樣品，按照添加濃度為1.00、10.00、100.00 μg/kg 3個(gè)濃度分別加入相應(yīng)的噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行質(zhì)控樣品。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理，采用1.5儀器條件測(cè)定噻蟲嗪濃度，根據(jù)隨行測(cè)定的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測(cè)濃度，準(zhǔn)確度為測(cè)定平均值與參照值的百分比。

1.8 精密度

精密度試驗(yàn)采用加入法。取桑葚空白樣品，按照添加濃度為1.00、10.00、100.00 μg/kg 3個(gè)濃度分別加入相應(yīng)的噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行質(zhì)控樣品。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理，采用1.5儀器條件測(cè)定噻蟲嗪濃度，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)隨行測(cè)定的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測(cè)濃度，即可求得方法的日內(nèi)和日間精密度。

1.9 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過程效率

采用Matuszew ski等[20]提出的方法，比較3個(gè)條件下的峰面積平均值。在純的噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)，桑葚樣品基質(zhì)提取后添加噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)品(B)和桑葚樣品基質(zhì)提取前添加噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)品(C) 3個(gè)條件下，分別采用高、中、低3個(gè)濃度來評(píng)價(jià)噻蟲嗪在桑葚樣品的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過程效率，每個(gè)條件下重復(fù)測(cè)定6個(gè)樣品。基質(zhì)效應(yīng)=B/A，提取回收率=C/B，方法過程效率=C/A。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法選擇性

該試驗(yàn)條件下，采用反相液相色譜分離噻蟲嗪，流動(dòng)相中加入0.1%體積分?jǐn)?shù)的甲酸來提高ESI+的離子化效率。結(jié)果表明，噻蟲嗪保留時(shí)間為2.85 min，峰形及分離度良好，且可獲得較強(qiáng)的分子離子峰強(qiáng)度，桑葚基質(zhì)對(duì)桑葚樣品中噻蟲嗪的測(cè)定無干擾。噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜、桑葚空白樣品圖譜、噻蟲嗪基質(zhì)標(biāo)液圖譜和桑葚加標(biāo)樣品的圖譜分別見圖1、圖2、圖3和圖4。

圖1 噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(5.00 μg/L)

圖2 桑葚空白樣品圖譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限

噻蟲嗪基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線在質(zhì)量濃度為1.00~ 200.00 μg/L時(shí)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為=2.583 7×107+1 009(2=0.999)(權(quán)重1/x)。以3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢測(cè)限，噻蟲嗪在桑葚中的方法檢出限(method detection limit，MDL)為0.20 μg/kg。以4倍MDL為測(cè)定下限，即4倍方法檢出限濃度作為測(cè)定下限，則噻蟲嗪在桑葚中的測(cè)定下限為0.80 μg/kg[19]。

2.3 方法準(zhǔn)確度

該試驗(yàn)條件下，噻蟲嗪在1.00、10.00、100.00 μg/kg 3個(gè)添加濃度下的準(zhǔn)確度分別為97.2%、96.4%和90.5%，均在90.00%~100.00%之內(nèi)(表3)，表明該試驗(yàn)方法在測(cè)定桑葚中噻蟲嗪的殘留時(shí)具有較好的準(zhǔn)確度。

圖3 噻蟲嗪基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(5.00 μg/L)

2.4 方法的日內(nèi)精密度和日間精密度

該試驗(yàn)條件下，噻蟲嗪在添加濃度為1.00、10.00、100.00 μg/kg桑葚樣品中的日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.67%、2.46%和3.78%，日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.48%、3.71%和4.73%，見表4。結(jié)果表明，該試驗(yàn)方法在檢測(cè)桑葚中的噻蟲嗪時(shí)，具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過程效率

該試驗(yàn)條件下，采用提取后加入法從3個(gè)濃度水平來評(píng)價(jià)了桑葚樣品的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和過程效率，其結(jié)果見表5。在1.00、10.00、100.00 μg/L 3個(gè)添加濃度水平下，桑葚樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為(99.69±4.45)%、(95.91±0.44)%和(93.33±0.30)%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，并且基質(zhì)效應(yīng)影響較小；提取回收率分別為(99.16±4.78)%、(96.35±0.87)%和(90.46±1.92)%，相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.82%，0.90%和2.12%，均滿足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求[21]；方法過程效率分別為(98.77±4.80)%、(92.40±0.74)%和(84.43±1.64)%，表明該試驗(yàn)方法過程效率較好。

張連長(zhǎng):“你腳上磨出了這么多泡,自己怎么走?這塔頭甸子里的水,是各種細(xì)菌的大本營(yíng)。五八年,我們那批轉(zhuǎn)業(yè)兵來的時(shí)候,一個(gè)戰(zhàn)友腳上的泡也破了,可他偏要強(qiáng)……結(jié)果得了敗血癥,死啦。我不能忽視那種教訓(xùn),盡管我背的是資本家的女兒。”

圖4 桑葚加標(biāo)樣品圖譜(5.00 μg/kg)

表3 方法的準(zhǔn)確度(n=6)

表4 方法的日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)

表5 3個(gè)不同濃度下的信號(hào)峰面積及基質(zhì)效應(yīng)、回收率和過程效率的計(jì)算結(jié)果(n=6)

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)中桑葚樣品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基復(fù)合柱凈化，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測(cè)定其中噻蟲嗪的殘留量。該方法前處理過程操作簡(jiǎn)便，方法的選擇性、檢測(cè)限、回收率、準(zhǔn)確度、精密度和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及其相關(guān)系數(shù)均滿足樣品分析方法要求，適用于桑葚中噻蟲嗪的殘留檢測(cè)。

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Determination of Thiamethoxam in Mulberry by UPLC-MS/MS

LI Guolie, SU Xu, DU Xin, QIN Mingli, JIANG Jinfang

(Nanchong Monitoring and Test Center for Agricultural Products Quality, Sichuan Nanchong, 637000, China)

An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) assay for quantification of thiamethoxam in mulberry was developed. The thiamethoxam was extracted by acetonitrile from mulberry, purified by Carbon/NH2with a methanol-0.1% formic acid solution-acetonitrile as mobile phase. The residues of thiamethoxam were determined by multiple reaction monitoring (MRM) mode with positive electrospray ionization (ESI+), and quantified by the method of external standard. The results showed that this method was simple, sensitive and has good selectivity and high precision. The calibration curve was in good linear between the ratio of the peak areas and the concentrations from 1.00 to 200 μg/L, the correlation coefficientR＞0. 99. The limit of detection of the method was 0.20 μg/kg and the lower limit of quantitation was 1.00 μg/kg. The accuracy(90.46%~97.20%), precision(2.46%~5.48%) and recovery (90.46%~99.16%) of this method, with 1.00~100 μg/kg additive amount, can meet the requirements of analytical method.

mulberry; thiamethoxam; residue; UPLC-MS/MS

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.05.11

TQ450.7

A

1009-6485(2017)05-0054-05

李國(guó)烈，男，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：藥動(dòng)學(xué)及藥物殘留檢測(cè)。E-mail: glie2012@163.com。

2017-07-02。