棉花矮化突變體AS98差異基因表達cDNA-AFLP分析

鐘文娟，張 超*，戢沛城，龔一耘，牟方生，蒲德強，袁 燦，杜雄明

(1.四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，四川 青白江 610300；2.中國農業科學院棉花研究所/農業部棉花遺傳改良重點實驗室，河南 安陽 455000)

棉花矮化突變體AS98差異基因表達cDNA-AFLP分析

鐘文娟1，張 超1*，戢沛城1，龔一耘1，牟方生1，蒲德強1，袁 燦1，杜雄明2**

(1.四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，四川 青白江 610300；2.中國農業科學院棉花研究所/農業部棉花遺傳改良重點實驗室，河南 安陽 455000)

【目的】為了探究矮化突變體AS98發生變異的分子生物學機制，【方法】本研究利用正常陸地棉品種 LHF10W99(簡稱LHF)與AS98 雜交后代分離出的正常表現型植株和極端矮化表現型植株，在現蕾期提取2種株型的莖尖、莖和根的RNA，利用 cDNA-AFLP 技術分析2種植株莖尖的表達差異。【結果】篩選到差異表達的片段32條，對這32條片段進行克隆測序，利用生物信息學進行分析發現其中一條(HD61)與擬南芥的阿拉伯半乳聚糖蛋白的同源性較高。用棉花的阿拉伯半乳聚糖蛋白(GhAGP)的序列設計引物，用RT-PCR方法檢驗阿拉伯半乳聚糖蛋白在2類植株的莖尖、莖和根等組織上的表達量，結果表明，GhAGP 基因在突變型和正常型材料的莖、根上的表達量基本相同，但是在莖尖上卻表現出明顯的差異，突變型莖尖上的表達量顯著低于正常型莖尖的表達量，說明GhAGP可能參與棉花莖尖細胞的伸長生長過程。【結論】AS98的半乳糖代謝的改變可能與赤霉素(GA)合成中基因發生突變有關，不能合成正常具有生物活性的 GA，使得阿拉伯半乳聚糖蛋白等基因在 AS98 莖尖的表達減少甚至缺乏。

棉花；矮化突變體；cDNA-AFLP

【研究意義】棉花矮化的研究始于1918年， Harland在海島棉中發現 “矮皺突變體”，之后Hutchinson、McMichael、何鑒星、陳旭升等相繼發現了5個不同的棉花矮化突變體，同時它們有一個共同特點就是矮化性狀與葉片皺縮連鎖[1-5]。這些突變體的矮化性狀1個為不完全顯性基因控制，4個為隱性基因控制，且均表現矮化與葉片皺縮連鎖。其中陳旭升[5]報道了一個突變體通過外源激素處理，株高可以達57.8 cm， 并能正常結鈴吐絮，其它幾個矮化突變體未見有關激素敏感性的報道。與水稻、小麥、蔬菜等作物相比棉花上發現的矮化資源很少，在棉花矮化育種上也幾乎沒有得到利用，因此發現和研究新型棉花矮化資源對棉花矮化育種具有重要意義。【前人研究進展】中國農業科學院棉花研究所杜雄明研究員等于1998年在1個陸地棉與野生棉的雜交 F2群體中，發現1株矮化突變體，經自交純化，得到矮化突變體 “AS98”，該突變體在子葉期與正常植株相比沒有區別，從第 3～5 節間起節間明顯比正常植株短，以后節間短縮程度越來越大，最后主莖相鄰葉柄基部連接在一起，而葉片表現為正常的闊葉，與已知葉片皺縮型矮化突變體有明顯區別。【本研究切入點】本研究利用cDNA-AFLP分析正常植株與矮化突變植株的基因表達差異，【擬解決的關鍵問題】通過對矮化突變體“AS98”變異的分子機制研究，為進一步深入探索導致植株矮化產生的原因提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由于本實驗所用的突變體材料AS98沒有對應的野生型，們用LHF與AS98雜交后代雜交合型的單株(半矮化型)連續自交6代，用F7的一個半矮化單株中分離出的正常型植株和極端矮化型植株10株的莖尖、莖和根做供試材料。

1.2 總RNA提取與cDNA 制備

采用改良CTAB法提取棉花總RNA[6]，用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量，同時根據紫外光譜檢測純度和濃度進行稀釋樣品RNA 100 ng·μl-1。

第1鏈cDNA合成。0.5～1.0 μg總RNA，1 μl SMART Ⅳ Oligonucleotide 和1.0 μl CDS Ⅲ/3’ PCR 引物加入到0.5 mL離心管，用DEPC處理過的ddH2O補至5.0 μl，輕輕混勻，72 ℃水浴2 min，冰上放置2 min，短暫離心；分別加入2.0 μl 5×First-strand Buffer，1.0 μl DDT(20 Mm)，1.0 μl dNTP Mix(10 Mm)，1.0 μl PowerScript反轉錄酶至總體積10.0 μl，輕輕混勻，短暫離心，42 ℃反應1 h；將離心管移到冰上終止第1鏈合成反應，-20 ℃保存備用。

第2鏈cDNA合成。總反應體系為100.0 μl：2.0 μl 第1鏈 cDNA，80.0 μl ddH2O，10.0 μl 10×Advantage 2 PCR buffer，2.0 μl 50×dNTP Mix，2.0 μl 5’ PCR 引物，2.0 μl CDS Ⅲ/3’ PCR 引物，2.0 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix。反應程序為：95 ℃ 20 s；95 ℃ 5 s 35個循環，68 ℃ 6 min。取2.0 μl PCR 產物用1.1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余PCR產物稀釋20倍后-20 ℃保存備用。

1.3 cDNA-AFLP

cDNA酶切反應體系: ddH2O 11.0 μl，TANGOTM 10 × buffer 2.0 μl，10 U·μl-1MseI 1.0 μl， 10 U·μl-1EcoR I 1.0 μl，100 ng·μl-1cDNA 模板4.0 μl。混合液于37 ℃ 2 h， 65 ℃ 3 h， 85 ℃ 15 min 進行酶切反應。

cDNA片段接頭的連接反應體系: 在酶切反應液中加入：ddH2O 4.9 μl， 10×Buffer 3.0 μl，5 μmol·L-1EcoRⅠ接頭1.0 μl，50 μmol·L-1MseI 接頭1.0 μl，10 U·μl-1T4-ligase 0.1 μl。22 ℃ 連接10 h， 70 ℃ 10 min，-20 ℃保存備用。

cDNA 片段的預擴增反應體系: 取酶切連接產物5.0 μl，10×buffer 5.0 μl，5 U·μl-1Taq0.2 μl，10 U·μl-1dNTP 1.0 μl，50 ng·μl-1MseI引物(M1～M16，表1) 1.5 μl，50 ng·μl-1EcoR I引物(E1～E16) 1.5 μl，ddH2O 32.8 μl。 PCR 程序: 95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環；72 ℃10 min，4 ℃保存。

選擇性擴增反應體系: 預擴增樣品用0.1×TE稀釋20倍后取5.0 μl，10×buffer 2.0 μl，5 U·μl-1Taq0.1 μl，10 U·μl-1dNTP 0.5 μl，20 ng·μl-1MseI引物1.5 μl，20 ng·μl-1EcoR I引物1.5 μl，ddH2O 9.4 μl； PCR 程序: 95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃(-0.7 ℃ /循環)30 s，72 ℃ 1 min，11個循環；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1min；22個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。用6 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯影后觀察記錄(表1)。

表1 cDNA-AFLP選擇擴增引物序列

表2 稀釋濃度

1.4 差異片段回收與測序

用滅菌的解剖刀準確切下目的條帶，轉入裝有100.0 μl重蒸水的離心管中。將凝膠搗碎，置于沸水浴中10 min，然后5000 r/min離心2 min。取5.0 μl上清液作為模板再次以相應選擇性擴增引物組合擴增。將上述回收再擴增的PCR用BBI公司的EZ柱式PCR產物純化試劑盒純化。純化后的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將純化后的差異片段進行PCR擴增，用T4 DNA 連接酶將PCR產物與T-vector連接、轉化，挑單克隆菌落在加入氨芐青霉素的LB液體培養基中振蕩培養，用菌液PCR驗證陽性克隆。將陽性克隆菌液交由Sangon公司進行雙向測序，每個序列分別進行2次重復。序列分析采用DNAstar軟件，而后在NCBI的GenBank數據庫，進行核苷酸序列的Blast比對。

1.5 分子雜交檢測

為降低假陽性率，將回收純化，并經瓊脂糖凝膠電泳檢測為目的片段的PCR產物用羅氏公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I進行反向Northern雜交。利用不同的稀釋濃度(表2)檢測探針標記效率：顯色反應進行5～10 min時，對照測試條中30 pg濃度的樣點即會出現顏色，30 min時3 pg的樣點也可見顏色，隨即停止顏色反應。漂洗后比較對照與待測樣品顏色，根據對照濃度與待測樣品的稀釋濃度計算標記物的數量。得到可靠結果后根據DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒操作手冊進行分子雜交檢測。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取，檢測與預擴增

利用CTAB法所提取的棉花各組織總RNA樣品，經稀釋后(1∶500)在紫外光下檢測。所有樣品的A260/A280均在1.8～2.0， RNA樣品酚類物質和蛋白質等雜質少，質量較好。1.2 %變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀測到28 S rRNA，18 S rRNA 2條帶，無拖帶現象，基本無降解，無蛋白和DNA污染。利用Clontech公司的SMARTTM技術及其Advantage?2 PCR Enzyme System kit，通過LD-PCR獲得全長cDNA模板。1.2 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測合成的雙鏈cDNA(圖1)。合成的雙鏈cDNA在300～3500 bp呈現彌散拖尾狀(圖1)，與真核生物基因轉錄本大小吻合，說明擴增獲得的全長cDNA 比較理想，可用于后續實驗。

2.2 cDNA-AFLP分析

用64對AFLP引物(E1～E8；M1～M8)對正常型植株和極端矮化型植株莖尖2次重復的cDNA進行擴增，用6 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測不同材料的cDNA差異(圖2)，結果顯示：擴增的AFLP 片段長度在80～500 bp，每對引物組合均能擴增出10～30條清晰的條帶。

通過比較在重復間條帶一致，材料間條帶差異明顯條帶發現，差異基因的表達有3種模式，一是在正常型中表達，在突變型不表達，二是在突變型上表達，在正常型上不表達；三是在2種植株上均表達，但是它們的片段大小有差異。

2.3 反向Northern雜交

2.3.1 探針標記和探針效率檢測 用羅氏公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒，將cDNA模板標記為探針，按照操作說明的方法將探針稀釋為不同的濃度梯度(A～F所示濃度見表2)經免疫顯色結果如圖3所示，標記的探針與標準對照的效率一致，說明標記的探針效率較高。

M: Marker；L: LHF；D: AS98圖1 合成的第二鏈cDNAFig.1 Synthesis of the second strand cDNA

M: Marker；L：正常型植株；D：矮化型植株圖2 變性聚丙烯酰胺電泳檢測cDNA擴增的差異片段Fig.2 Different fragment from amplified cDNA by denaturing PAGE

2.3.2 反向Northern雜交 為進一步減少假陽性，選取上述回收純化的正常型和極端矮化型差異表達明顯，而且重復性好的125條片段與標記的cDNA探針進行反向Northern雜交，剔除假陽性的片段(圖4)，結果在125條差異片段中，有18條是在正常型中特異表達的，有20條是在矮化型中特異表達的。本實驗將這38條特異表達的片段進行克隆。

2.4 差異片段的生物信息學分析

將獲得的32條差異片段送上海生物工程公司測序，然后再NCBI上進行序列分析，經BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。表3表明，在正常植株中表達的片段序列與HSP90、核糖體蛋白、阿拉伯半乳聚糖蛋白、細胞骨架組織蛋白、低聚糖重復聚合蛋白、亮氨酸拉鏈結構蛋白、GRAS轉錄因子及一個陸地棉播種后3周根和花后0～10 d纖維cDNA等的序列具有較高的同源性；在突變型上特意表達的片段序列與脅迫蛋白、結合蛋白、外膜蛋白H、鋅指蛋白、細胞色素蛋白P450、乙醛脫氧酶、核糖體蛋白、聚酮化合物合成酶調節因子、亮氨酸重復蛋白、RNA解旋ATP依賴蛋白、果膠脂酶、硫辛酸蛋白連接酶等的序列具有較高的同源性。但是有幾個片段找到的序列同源性很低，如片段HD21、HD55、HD72、HD74、HD76。還有6個片段(HD76、HD77、HD83、HD106、HD107和HD124)沒有找到同源序列基因。推測這些同源性低和無同源序列的基因為新基因或棉花特有基因。

AS：極端矮化型探針；L：正常型探針；CK：對照組圖3 DIG標記探針Fig.3 DIG labeled probe

在這些差異片段序列分析中，發現在正常型植株莖尖中表達而在突變體上沒有的片段HD61的序列與擬南芥的阿拉伯半乳聚糖蛋白的同源性較高，而且Willats 和 Knox[7]研究發現AGPs對胡蘿卜細胞伸長具有重要作用，Me等[8]用轉阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(CsAGP1)黃瓜過量表達，轉基因煙草的株高明顯高于野生型，用Y(β-Glc)3對煙草胚軸伸長抑制也發現AGPs是植物細胞伸長必須的物質。因此選擇AGPs基因來檢測其在正常型植株和極端矮化植株不同組織上的表達差異。

L：正常型莖尖cDNA探針；A：極端矮化型莖尖cDNA探針L: cDNA probe from the stem tip of normal；A: cDNA probe from the stem tip of dwarf圖4 差異片段的反向northern檢查Fig.4 Reverse northern blotting profile of differential fragments

2.5 半定量RT-PCR結果

為了分析棉花AGPs基因在極端矮化突變型和正常型之間的表達差異，利用棉花阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(GhAGP)的序列設計引物，用半定量RT-PCR驗證其在極端矮化型和正常型植株的不同組織上的表達差異，UBQ7基因為內參。半定量RT-PCR結果顯示(圖5)，在相同條件下，UBQ7基因在不同材料的不同組織上的表達量表現一致，GhAGP基因在突變型和正常型材料的莖、根上的表達量也基本相似，但是這2個材料的莖尖上卻表現出明顯的表達差異，突變型莖尖上的表達量顯著低于正常型莖尖的表達量。由此可見，GhAGP在突變型和正常型植株之間的莖尖確實存在表達量上的差異，這一結果顯示了GhAGP可能參與棉花莖尖細胞的伸長等生長發育。

3 討 論

3.1 cDNA-AFLP分析基因表達差異

cDNA-AFLP是在基因組DNA的選擇性擴增限制性片段 (AFLP) 的基礎上發明出來的用于基因表達分析的方法[9]。它將RT-PCR和AFLP結合起來，由于在PCR 中使用較高的退火溫度和應用特定引物對包含信息較多的內部特異片段進行選擇性擴增，提升了反應條件的嚴謹度，使其比差異顯示反轉錄PCR (DDRT-PCR) 的可靠性和可重復性大大提高。當轉錄產物高度表達時擴增條帶的強度高低甚至能直接反應出基因表達量的差別，并且獲得的轉錄衍生片段 (transcript-derived fragments, TDF)一般也集中在蛋白的編碼區或者附近，可最大限度的提供基因編碼區的信息。cDNA-AFLP所需的實驗儀器設備也比較簡單，已經成為目前篩選差異表達基因最有效的方法之一。因此，本實驗選用cDNA-AFLP技術來分析一個新的棉花極端矮化突變體植株與正常型植株莖尖的表達差異基因。結果每對引物組合能擴增出10～30條清晰的條帶，而且在重復樣品間表現一致。用64對AFLP引物進行PCR擴增和反向northern雜交，得到18條在正常型中特異表達，20條是在極端矮化型中特異表達片段。

表3 AFLP 差異片段的序列分析結果

TL，SL 和 RL分別是正常植株的莖尖、莖和根；TD，SD 和RD分別是突變植株的莖尖、莖和根TL, SL and RL are the stem tip, stem and root of normal plants, respectively，TD, SD and RD are the stem tip, stem and root of mutant plants, respectively圖5 GhAGP基因在正常型和突變型植株不同組織表達差異Fig.5 Expression analysis of GhAGP for the normal and mutant plants in different tissues

3.2 棉花阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(GhAGP)的表達差異

莖的伸長決定于細胞分裂和細胞延伸，細胞延伸由細胞膨壓和細胞壁在特定方向上的伸展，這是通過纖維素微纖絲和細胞壁母細胞多糖和蛋白[10]。AGPs是一類在植物界廣泛存在的多糖蛋白，越來越多的證據推導AGPs在植物生長發育中發揮重要作用，如Willats 和Knox等[7]研究發現AGPs對胡蘿卜細胞伸長具有重要作用，Me等[8]用轉阿拉伯半乳聚糖蛋白基因 (CsAGP1) 在煙草中過量表達，其轉基因煙草的株高明顯高于野生型，用Y(β-Glc)3對煙草胚軸伸長抑制也發現AGPs是植物細胞伸長必需的物質。由此可以推測AGPs對于莖的伸長具有重要作用。本實驗用cDNA-AFLP須篩選的到差異片段，再通過序列分析發現，其中一個在正常型植株莖尖表達，而在AS98莖尖不表達的片段與擬南芥的AGP同源性很高，然后根據棉花的AGP序列設計，用RT-PCR檢驗該基因在這2個材料的不同器官表達發現，AGP基因在正常型和矮化突變型植株的莖和根的表達沒有明顯差異，但是在莖尖的表達具有顯著不同，表現為在正常型植株的莖尖表達量顯著高于在矮化突變型莖尖的表達量。這一方面印證了前面用cDNA-AFLP篩選到的該片段在2個材料之間差異的真實性，說明極端矮化突變體AS98的矮化表現型有可能是阿拉伯半乳聚糖蛋白基因下調表達引起的。

由于植物的半乳糖代謝與GA信號途徑相關，AS98的GA合成中基因發生突變，不能正常合成具有生物活性的赤霉素，從而引起半乳糖代謝調控相關基因表達發生改變，使得阿拉伯半乳聚糖蛋白等基因在AS98莖尖的表達減少甚至缺乏。這進一步印證了AS98矮化突變體是屬于GA敏感型突變體，與前期AS98對激素的敏感性研究結果一致[11]。

為深入研究該突變體相關的突變基因，下一步計劃測定AS98體內GA合成代謝的中間產物含量，找到該突變體在GA合成過程中的突變位點。

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DifferencesinGeneExpressionofCottonDwarfMutantAS98bycDNA-AFLPAnalysis

ZHONG Wen-juan1，ZHANG Chao1*，JI Pei-cheng1，GONG Yi-yun1，MU Fang-sheng1，PU Deng-qiang1，YU Can1，DU Xiong-ming2**

(1.Sichuan Academy of Agricultural Sciences Industrial Crop Institute, Sichuan Qingbaijiang 610300,China; 2.Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement, Ministry of Agriculture/Cotton Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Henan Anyang 455004,China)

【Objective】 The present paper aims to get the molecular biology mutation mechanism of dwarf mutant AS98.【Method】The normal upland cotton LHF10W99 was crossed with AS98, and the normal plant and extreme dwarf plant from the hybrid offspring plants were isolated. The RNA of stem tip, stem and root from these two kind plants in the budding period were extracted, and the expressing difference in the stem tip of two type plants was analyzed by cDNA-AFLP.【Result】32 fragments were amplified and sequenced, and one of fragment HD61 exhibited high homology withArabidopsisArabinogalactan protein using bioinformatics analysis. Then the special primers were designed according to the cotton Arabinogalactan Protein (GhAGP) sequences, the RT-PCR was done in stem tip, stem and root to verify the expressing difference between the two type plants. The GhAGP expression were the same in stem and root of normal and dwarf mutant plants, while there were obvious difference in the stem tip: the expression of mutant stem tip was significantly lower than normal stem tip, indicating that the GhAGP might participate in the process of cell elongation growth of cotton stem tip. 【Conclusion】The change of AS98 galactose metabolism maybe has relationship with the gibberellin (GA) synthesis gene mutation; The AS98 cannot synthesize bioactive GA normally and reduce or lack the gene expression of GhAGP in AS98 stem tip.

Upland cotton; Dwarf mutant; cDNA-AFLP

1001-4829(2017)5-0994-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.003

2016-05-18

國家科技支撐計劃(2013BAD01B03-06)

鐘文娟(1985-)，女，湖南常德人，助理研究員，主要研究棉花大豆遺傳育種，E-mail：wenjuanmaize@sina.com，*為并列第一作者，**為通訊作者：杜雄明(1963-)，研究員，博士，E-mail：duxm@cricaas.com.cn。

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(責任編輯 陳 虹)