實時熒光PCR在艾滋病合并肺孢子菌肺炎快速診斷中的應用

陳薇薇，吳翠松，王麗娜，申悅平

（鎮江市第三人民醫院，江蘇 鎮江 212003）

·診斷技術·

實時熒光PCR在艾滋病合并肺孢子菌肺炎快速診斷中的應用

陳薇薇，吳翠松，王麗娜，申悅平

（鎮江市第三人民醫院，江蘇 鎮江 212003）

目的應用實時熒光PCR技術快速診斷艾滋病合并肺孢子菌肺炎患者。方法選取2013年7月～2015年12月本院收治的114例艾滋病合并肺部感染患者中的36例支氣管灌洗液標本作為研究對象，應用實時熒光PCR技術與常規六甲基四胺銀（GMS）染色法檢測艾滋病合并肺部感染的病原菌檢測，比較兩種方法的檢測結果。結果采用實時熒光PCR技術檢測肺孢子菌DNA，顯示27例為陽性，陽性率為75%（27/36），GMS染色鏡下檢測，陽性率為75%（27/36）。結論對艾滋病合并肺孢子菌感染患者支氣管灌洗液的肺孢子菌檢測中，熒光肺孢子菌與GMS染色有極高的一致性，且敏感性明顯高于后者，值得臨床推廣應用。

實時熒光PCR；艾滋病；肺孢子菌肺炎；診斷效果

艾滋病（AIDS）已經成為影響人類生命健康的災難性傳染病。而肺孢子菌是引發機體肺孢子菌肺炎（PCP）的致病真菌，具有宿主種特異性，兩者合并，極大的威脅著患者身心健康[1]。因此，尋找一種有效、快速、準確的診斷方法，對早期診斷艾滋病合并肺孢子菌肺炎具有重要作用。本次研究針對實時熒光PCR在艾滋病合并肺孢子菌肺炎快速診斷中的應用效果進行分析，現匯報如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年7月～2015年12月鎮江市第三人民醫院收治的114例艾滋病合并肺部感染患者。患者中女27例、男87例；年齡19～56歲；平均年齡36.05±8.93歲。CD4+T計數（51.9±93.8）個/ul。本次研究對象為114例患者中的36例支氣管肺泡灌洗液。

1.2 方法

1.2.1 標本收集方法

待患者機體條件允許時，對其實施局麻后，于亞段支氣管開口處嵌入纖維支氣管鏡，將與體溫相近的生理鹽水通過纖維支氣管鏡吸引管推注到亞段支氣管，20～50 ml/次，總量不超過250 ml，注入后隨即負壓吸引。為防止遠端氣道陷閉和回收量的減少，負壓吸引不應壓力過大。

1.2.2 檢查方法

所有患者均實施免疫學檢查、GMS染色檢查、實時熒光PCR法檢查。免疫學檢查：通過流式細胞儀檢測CD4+T淋巴細胞，應用MultiTEST四色試劑、FACS溶血素、TriTEST三色試劑進行檢測，并在絕對數下對其進行質控。GMS染色檢查：支氣管肺泡灌洗液實施細胞涂片，對其進行固定，并對其實施過碘酸鈉氧化，嚴格按順序進行操作。應用樹膠將其進行封片，并于油鏡下實施視野檢查并計數。實時熒光PCR法檢查：采用上海之江生物科技有限公司提供的試劑和引物，嚴格按相關說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件實施數據分析，采用McNemar檢驗兩組間一致性，P＜0.05，具有統計學意義。

2 結 果

2.1 GMS染色結果

在油鏡下，當檢測標本背景呈現粉紅色，有4～8個囊內小體在PCP包囊內，且囊壁不著色、細胞核為黑色，輪廓明顯時。由此可知，在36份支氣管肺泡灌洗液標本中有27（75%）例為GMS染色鏡檢肺孢子菌陽性。見圖1。

2.2 Real-time PCR檢測結果

通過real-time PCR對PCP的定量陽性質控進行校準，橫坐標為起始拷貝數的對數，縱坐標為Cr值，制作曲線，線性相關系數r=0.9978。陽性標準=肺孢子菌DNA＞103拷貝/ml。以上述標準為基礎，在36份支氣管肺泡灌洗液標本中有PCR肺孢子菌陽性27例，陽性率為75%。

圖1 支氣管肺泡灌洗液GMS染色（伊紅復染）

2.3 GMS染色與real-time PCR技術檢測方法一致性檢驗

36份支氣管肺泡灌洗液標本肺孢子菌檢測中GMS染色和real-timePCR行一致性檢驗，結果顯示兩種方法一致。

3 討 論

肺孢子菌肺炎是由肺孢子菌引起的間質性漿細胞性肺炎，是一種條件性肺部感染性疾病。研究表明，當人體感染免疫缺陷病毒后，會降低CD4+T淋巴細胞數，從而提高PCP的感染幾率越。但在艾滋病患者免疫重建過程中，PCP仍是最常見的機會性感染因素[2]。因此，盡早發現、盡早診斷，對提高治療效果具有積極意義。隨著醫療水平的不斷進步，實時熒光PCR法檢查應用于艾滋病合并肺孢子菌肺炎患者中，診斷效果顯著。

PCP的臨床癥狀并不明顯，診斷較困難。通常采用常規檢測方法，但其檢出率較低；無法對定植菌、活動性肺炎進行區分。實時熒光PCR是一種新型的定量檢測法，其是在常規檢測法中創新出來的。熒光PCR是通過引入熒光分子，按熒光信號比例的增加來反映DNA載量的，可有效檢測出基因變異及初始模板濃度情況。此檢測方法彌補了傳統PCR技術普遍存在的漏洞，也解決了產物污染問題。本次研究發現，兩種檢測結果一致性極高，但實時熒光PCR檢測方法可快速、定量地檢測到肺孢子菌DNA，為肺孢子菌感染的診斷、治療方案提供有效的參考依據，值得臨床推廣應用。

[1] 李凌華,唐小平,鄧西龍,等.艾滋病合并肺孢子菌肺炎60例臨床分析[J].中華傳染病雜志,2008,26(12):739-743.

[2] 汪習成,黃曉婕,張 彤,等.HIV/AIDS患者機會性感染特點分析[J].中華內科雜志2007,46(5):379-382.

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ISSN.2095-8242.2017.059.11619.02

本文編輯：吳 衛