鉀礦區海金沙內生真菌多樣性及生態分布研究

張紅芳, 甘會云, 錢旭, 陳曄,2,*

1.九江學院藥學與生命科學學院, 九江 332000 2.九江市區域產業與城市生態重點實驗室, 九江 332000

鉀礦區海金沙內生真菌多樣性及生態分布研究

張紅芳1, 甘會云1, 錢旭1, 陳曄1,2,*

1.九江學院藥學與生命科學學院, 九江 332000 2.九江市區域產業與城市生態重點實驗室, 九江 332000

為探明不同鉀礦區同種植物內生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態分布規律, 運用傳統組織分離方法與分子生物學方法相結合, 對3個不同鉀礦區(龍南安基山、南京小龍山、黎川龍安)的海金沙居群地采樣, 進行了海金沙內生真菌的分離頻率、種類組成、多樣性和生態分布分析, 同時與非鉀礦區(廬山蓮花洞)海金沙內生真菌進行對比分析。結果表明: 從海金沙1200個組織塊中分離出477 株內生真菌, 其中產孢菌株229株, 占總數48 %, 不產孢菌248株, 占52%。根據形態學特征和形態型菌株的rDNA的18S基因和ITS序列的相似性比較和分子系統發育分析確定477菌株中438 菌株鑒定隸屬于Alternaria、Colletotrichum、Fusarium、Peniccillium等75個分類單元, 還有39 株不產孢類群無法鑒定。在真菌屬的水平, 以Colletotrichum(20.96%)、Fusarium(11.32%)和Alternaria(8.81%)為優勢菌群。從分離頻率來看, 不同鉀礦區內生真菌出現頻率存在差異, 各礦區內生真菌菌群之間的相似性低, 相似性系數(Cs)在0.07—0.30之間。鉀礦區海金沙內生真菌出現頻率高于非鉀礦區, 非鉀礦區(蓮花洞)菌株分離頻率為19.08%, 而在鉀礦區中南京分離頻率最高(33.33%)。在宿主組織中, 海金沙葉片、葉柄和根狀莖等不同組織部位內生真菌在數量、種群分布以及優勢種群等方面存在較大差異, 葉柄(44.44%)＞葉片(39.41%)＞根狀莖(16.15%), 在各個組織部位的優勢類群分布也存在一定的差異。形成內生真菌分布差異性與不同地理位置、氣候因素、土壤理化性質和宿主植物組織的生理狀況以及化學組成變化等密切相關。

海金沙; 鉀礦區; 優勢菌群; 多樣性; 相似性系數

1 前言

自1866年Heinrich Anton de Bary提出植物中存在有“內生生物體(Endophyte)”至今, 國內外學者在不斷地拓寬內生真菌宿主植物研究, 已開展了從藻類、地衣、苔蘚、蕨類植物和種子植物等植物內生真菌多樣性研究, 并對不同氣候和生境的植物內生真菌資源進行了發掘, 取得了豐碩的研究成果[1-7]。研究表明內生真菌普遍存在植物組織中, 具有豐富多樣性, 受宿主植物組織、環境等多種因素影響, 體現出一定組織、宿主差異性, 并與宿主植物之間建立了長期穩定的互惠共生關系(Mutualistic symbiosis)[8-9];此外, 這種共生關系在相對極端的環境中也普遍存在, 賦予植物優良生長性狀, 能提高宿主植物抗逆性、促進宿主對營養物質的吸收從而增強宿主植物對此類環境的適應性[10-20]。

蕨類植物是地球上最早出現的陸生植物類群,在世界各地均有分布, 具有豐富的物種多樣性。蕨類植物在適應特殊環境(如干旱環境、污染環境、礦區環境等)方面具有獨特的適應機制[21-22]。這種獨特適應機制是否與內生真菌之間建立了一種特殊關系是值得深入探究的問題。

為探明鉀礦區蕨類植物內生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態分布規律。以海金沙Lygodium japonicum(海金沙系海金沙科海金沙屬多年生蕨類植物, 分布廣泛, 具有抗逆境能力強、生長迅速、繁殖能力強等特點)為材料[23-25], 系統地研究不同鉀礦區海金沙內生真菌類群多樣性及生態分布特點, 探討不同鉀礦區與植物內生真菌群落組成及多樣性變化的關系, 并進一步分析礦區與非礦區植物內生真菌分布特點。研究結果將有助于全面了解鉀礦區植物內生真菌的類群組成和生態分布規律, 為探究植物內生真菌對宿主植物在礦區適應機制提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1標本采集處理 2014年6月下旬分別在3個不同鉀礦區(龍南安基山、南京小龍山、黎川龍安)和 1個非鉀礦區(廬山蓮花洞)等地進行了海金沙L.japonicum樣本采集(樣地基本概況, 見表1)。材料采集處理方法參照文獻[26]。

2.1.2培養基 麥芽汁瓊脂(2%)培養基為分離、純化培養基, 其配比: 麥芽汁 750 mL, 瓊脂 15 g,10%海金沙葉水提液100 mL, 加蒸餾水定容至1000 mL, 自然pH(使用前在培養基中加80 U·mL-1鏈霉素1 mL); PDA培養基為保種培養基。

2.2 內生真菌的分離及純化

內生真菌的分離采用常規的組織分離法, 地上部分從每種植物樣品中隨機選取 20段帶有葉片的小段片, 自來水沖洗干凈, 按文獻進行表面消毒[26-30]。純化已鑒定菌種后, 接入 PDA斜面, 4 ℃冰箱中保藏。分離純化獲得的菌株保存于九江學院藥學與生命科學學院真菌研究室(JJTU)。

2.3 內生真菌的鑒定

2.3.1內生真菌的鑒定 根據菌落的顏色、形態、菌絲和產孢結構的形態特征鑒定到屬。將不產孢菌株在促孢培養基上進行促孢培養, 并檢查其產孢情況, 產孢后按上述方法進行鑒定。經促孢培養后仍不產孢的菌株則根據菌落表面特征、菌絲顏色、菌絲生長速率等分為無孢類群(Mycelia Sterilia)的形態型[9]。通過rDNA中的5.8SITS序列的分子系統學分析方法進行鑒定。真菌屬的鑒定主要依據 Barnett& Hunter(1998)、Dictionary of fungi(10 版, 2008)、Keith Seifer(2011)的分類系統和《真菌鑒定手冊》,并參考國內外相關期刊發表的文獻資料[31-33]。

表1 采集樣地基本概況Tab.1 Basic general situation of sampling sites

2.3.2不產孢內生真菌菌株分子生物學鑒定[8,30]

運用CTAB法進行內生真菌DNA的提取, 利用真菌通用引物 Primer1 (ITS1: 5’- TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’正向)和 Primer4(ITS4: 5’-TCCTCC GCTTATRGATATGC-3’反向)對內生真菌 DNA 的ITS1、ITS2 和 5.8S rRNA 區間進行擴增; PCR 產物用純化試劑盒(QiaQuick PCR purification Kit;Qiagen)進行純化, 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產物的序列測定: 由北京華大基因有限公司完成。

通過對分子數據庫 GenBank中的序列 BLAST進行同源序列的檢索, 分子序列相似性超過 98%的序列被選作是同源序列。同時, 相似性較低的序列被選作為外源序列(Outgroup)。

用軟件 MAFFT 7.0 運算實現分子序列比對,軟件的設置為 Scoring Matrix: 1PAM/κ=2; Gap opening penalty=1.53; Offset value=0.0。比對完的序列用BioEdit 軟件進行剪切編輯。利用 MEGA 4.0軟件進行系統發育樹的構建, 該軟件采用的方法是鄰接法(Neighbour-joining, NJ), 樹的可靠性通過Bootstrap1000次來檢驗。

2.4 土壤和植株中主要成分測定

用TPY-6PC土壤養分化驗儀測定樣品中的速效氮、有效磷、速效鉀、有機質含量、土壤酸堿度, 植株中的主要元素K、P、Si、 Al等[34]。

2.5 數據統計分析[25]

采用分離率(Isolation rate,IR)衡量組織中內生真菌的豐富程度。分離率: 分離到的某一指定類型內生真菌的菌株數占樣品組織塊總數比值。

采用分離頻率(Isolation frequency,IF)比較判斷內生真菌的優勢菌群。分離頻率: 某一指定類型內生真菌的菌株數占獲得總內生真菌菌株數比值。

采用最為常用Shannon-Weiner多樣性指數(He)進行內生真菌種群的多樣性水平分析。He=-∑[ni/NLn(ni/N)], 其中ni為第i個內生真菌菌株數目,N為全部內生真菌菌株數。用Pielou均勻度指數分析菌群分布的均勻程度,E=He/Ln(S)式中:He為Shannon-Wiener 指數,S為物種數。 Margalef豐富度指數:R=(S-1)/lnN。Berger-Parker優勢度指數(D),D=Nmax/N式中:Nmax為優勢種的個體數;N為功能團全部物種的個體數。

采用Jaccard相似性指數(Cj)對不同植物間內生真菌組成的相似程度進行比較和分析。Cj=c/(a + b－c)。式中:a是一種植物內生真菌的種類數,b是另一種植物內生真菌的種類數,c是兩種植物共同具有的內生真菌種類數, 比較兩種植物之間內生真菌種類組成的相似程度。

3 結果與分析

3.1 海金沙內生真菌主要類群組成

從4個居群地的海金沙1200個組織塊中共分離獲得內生真菌477株, 其中產孢菌株229株, 占總菌株數48%, 不產孢菌248株, 占52%。根據菌落、菌絲形態學特征進行鑒定, 不產孢類群根據培養特征(生長速度、顏色以及質地等)將248菌株劃分26個形態型。通過對產孢類群的形態學鑒定和形態型菌株的5.8SrDNA、ITS序列的相似性比較和分子系統發育分析, 將分離獲得 477株內生真菌中 438 菌株鑒定為Alternaria、Colletotrichum、Fusarium、Peniccillium等75 個分類單元, 此外 39株不產孢類群 DNA序列在GenBank中無相近參考菌株信息, 作為無法鑒定的內生真菌, 它們分別為Fungal endophytesp.(9株)、Fungalsp.(22 株)、Uncultured fungus(8株), 這些菌群是否是新的類群有待進一步分析(見表2, 圖1)。在屬的水平以Colletotrichum、Fusarium、Alternaria為優勢菌群, 其分離頻率分別為20.96%、11.32%、8.81%。

表2 海金沙內生真菌的菌群組成Tab.2 Composition of endophytic fungi from L.japonicum (Thunb.) Sw.

續表

圖1 基于 5.8S rDNA 構建的形態型菌株鄰接法系統發育樹Fig.1 Neighbour-Joining phylogenetic tree of mycelia sterilia based on 5.8S rDNA gene sequences

3.2 內生真菌相似性及多樣性分析

3.2.1 海金沙內生真菌菌群組成的相似性

相似性系數是反映兩個不同生境中真菌菌群組成相似程度的重要參數。從內生真菌菌群的相似性來看(表3), 各樣地之間內生真菌類群相似性較低,相似性系數在0.07—0.30之間, 均小于0.5。從鉀礦區海金沙內生真菌菌群組成之間相似性來看, 龍南和黎川的相似性最高(Cs=0.2553), 南京與龍南的相似性最低(Cs=0.0690); 從鉀礦區與非鉀礦區海金沙內生真菌菌群組成之間相似性來看, 黎川和蓮花洞的相似性最高(Cs=0.3023), 南京和蓮花洞最低(Cs=0.1568)。

3.2.2 海金沙內生真菌菌群組成的多樣性

從Pielou均勻度指數(E)來看, 3個鉀礦區海金沙組織的內生真菌菌群的均勻度指數在 0.7015—0.8552 之間(表4), 龍南采樣地點均勻度指數為 0.8552, 南京采樣地點均勻度指數為 0.7015, 而非鉀礦區(蓮花洞)海金沙內生真菌均勻度指數最高為0.8726, 從而體現出各采樣地點的海金沙內生真菌的多樣性是比較穩定的。從 Shannon-Wiener 多樣性指數(He)來看, 龍南采樣地點的最高,He為2.9086, 南京的最低,He為 2.4313。從Berger-Parker優勢度指數來看, 蓮花洞采樣地點的最高, 為6.5000, 南京的最低, 為2.8909。從Margalef 豐富度指數(R)來看, 龍南采集點最高, 為 6.3392, 黎川最低, 為5.7524。

由表4可知, 海金沙內生真菌菌群的Shannon-Wiener 多樣性指數(He)、Margalef 豐富度指數(R)、Berger-Parker優勢度指數和均勻度指數(E)在海金沙不同組織部位之間的變化趨勢一致, 即: 葉片＞葉柄＞根狀莖, 表明海金沙葉片中內生真菌的多樣性最高。

表3 不同地點海金沙內生真菌相似性系數Tab.3 Similarity coefficients of endophytic fungi from L.japonicum in different sampling locations

表4 不同地點海金沙內生真菌多樣性指數Tab.4 Diversity indices of endophytic fungi from L.japonicum in different sampling locations

3.3 海金沙內生真菌生態分布

3.3.1 不同鉀礦區海金沙內生真菌菌群的分布

在 3個鉀礦區之間, 海金沙植物中內生真菌的菌群組成存在著明顯差異, 在分離頻率上表現為南京＞黎川＞龍南的規律, 南京鉀礦區分離頻率最高,為 33.33%。除共有的優勢菌群以外, 海金沙植物中內生真菌還具有其各自地區的優勢菌群存在差異,南京以Alternaria(17.61%)、Colletotrichum(34.59%)為優勢菌群, 黎川以Fusarium(13.85%)、Colletotrichum(17.69%)、Fungalsp.(11.54%)為優勢菌群, 龍南以Colletotrichum(14.43%)、Fusarium(18.56%)為優勢菌群。鉀礦區部分內生真菌類群在同一植物中分布具有特定的地理分布特性, 如Aegerita(0.21%)、Entylomella(0.63%)、Botrytis(3.14%)等僅在南京礦區分離獲得出現,Antromycopsis(0.77%)、Catenulifera(1.54%)、Nigrospora(3.08%)等僅分布在黎川礦區,Fusicladium(2.06%)、Acremonium(0.63%)、Beltrania(1.03%)等僅分布在龍南礦區。

同時, 研究發現從鉀礦區海金沙植物中分離獲得內生真菌在數量、種群分布以及優勢種群等與非鉀礦區之間存在較大差異。從數量來看, 鉀礦區分離獲得菌株數＞非鉀礦區; 非鉀礦區優勢菌群為Peniccillium(15.38%)、Guignardia(11%)、Fusarium(11%)。Alternaria、Colletotrichum、Fusarium、Peniccillium等在鉀礦區和非鉀礦區均有分布。Rhinotrichella(3.30%)等僅分布非鉀礦區。

3.3.2 海金沙不同組織中內生真菌菌群的分布

從總分離頻率來看, 海金沙葉片、葉柄和根狀莖等不同組織部位內生真菌在數量、種群分布以及優勢種群等方面存在較大差異, 葉柄(44.44%)＞葉片(39.41%)＞根狀莖(16.15%)(表2), 尤其葉柄、葉片中的內生真菌在種類與數量上較為豐富, 根狀莖最少;同時, 在各個組織部位的優勢類群分布也存在一定的差異, 在葉片、葉柄中以Colletotrichum分離頻率為較高, 分別 29.26%、19.34%,Fusarium在根狀莖中的分離頻率較高, 為14.29%。除2—3個明顯較重要的屬外(IF＞10), 分離頻率較低(IF＜5)的屬構成了海金沙內生真菌的主要組成。一些內生真菌類群表現出一定組織專一性, 如Arthroboyryum、Blastomyces、Curvularia等僅分布在葉片中,Acroolictys、Aegerita、Beauveria等僅在葉柄中分離得到,Antromycopsis、Cladobotryum、Gibelluiopsis等僅分布在根狀莖中。

4 討論

從分離純化結果顯示: 不產生孢子的菌株的分離率達到 20.67%, 分離頻率更達到 52%, 與其他學者研究植物內生真菌的結果相似[11-19], 其原因可能是由于內生真菌與宿主在長期協同進化中形成的適應關系使得內生真菌不僅在宿主體內不產子實體及孢子, 而且在體外培養時也已不易產生子實體[35]。

研究結果表明: 鉀礦區常見蕨類植物海金沙內生真菌在葉片、葉柄和根狀莖中的分布和分離頻率存在差異, 以葉柄的分離頻率為最高, 根狀莖的分離頻率最低, 這可能與內生真菌的來源及其萌發、生長和擴展有關。蕨類植物莖為根狀莖, 其內部結構為表皮、皮層和中柱, 表皮無氣孔, 蕨類植物根狀莖的內生真菌是通過莖表皮細胞間穿過皮層機械組織細胞間隙侵入到根狀莖的皮層薄壁細胞[29]; 也可能與礦區土壤環境有關, 因為礦區土壤貧瘠, 有些真菌難以在這種環境中生存, 故侵入蕨類植物根狀莖內生真菌數量較少, 而地上部分葉可以接受空氣中大量真菌孢子, 孢子通過不同途徑侵入葉內定植[25]。具體影響內生真菌在蕨類植物不同組織部位分布差異的因素需要進一步探究。

從分離頻率看, 海金沙內生真菌在不同鉀礦區出現的頻率存在較大的差異, 南京小龍山鉀礦區(33.33%)＞江西黎川龍安鉀礦區(27.25%)＞江西龍南安基山鉀礦區(20.34%); 海金沙植物中內生真菌優勢菌群在不同鉀礦區也存在明顯差異。形成這種差異可能與其所處地理位置的氣候因素、土壤因素和海金沙植物組織生理狀況以及化學組成的明顯變化等因素有關。從氣候因素來看, 南京小龍山鉀礦區、黎川龍安鉀礦區、龍南安基山鉀礦區分別位于北、中、南不同的亞熱帶季風氣候區, 它們年平均氣溫、降雨量和光照等均存在差異(見表1)。溫度、濕度、光照等氣候條件的差異, 一方面影響內生真菌對宿主植物的感染、定殖和生長, 從而使得同一植物內生真菌的分布在不同鉀礦區發生明顯變化[14]; 另一方面導致植物組織的生理狀況以及化學組成的明顯變化, 從而影響海金沙內生真菌的類群和分布[14,19]。從測定不同鉀礦區海金沙植株體內元素含量來看(見表5), 不同鉀礦區海金沙植株P、K、Si、A l等含量存在差異, 進一步說明不同氣候條件下導致植物自身化學組成的變化, 影響植物內生真菌的分布。

表5 不同采集地海金沙所含主要礦質元素(mg·kg-1)Tab.5 The main mineral elements from L.japonicum in different sampling locations

表6 不同采集地土壤的主要理化性狀Tab.6 Basic properties of soils used in different sampling locations

為了深入探討地理因素對于海金沙內生真菌分離頻率的影響, 對三個鉀礦區的土壤理化指標(pH、有機質、全N、速效P 和速效K)進行了測定, 結果顯示三個鉀礦區的土壤理化性質差異較明顯(表6),土壤理化性質對內生真菌的菌群結構產生一定的影響。說明地理因素會導致植物內生真菌群結構產生差異, 這與有的學者研究地理因素對植物中內生真菌群落結構影響的結果一致[9,11]。可見, 植物、內生真菌雙方由于受到周圍微環境變化的選擇壓力, 具有選擇性地改變另一方的能力[14,16,19]。這可能是一種跳躍式的協同進化方式, 一方面某些內生真菌可能通過極端環境的篩選作用具備了溶磷解鉀功能,另一方面, 宿主植物組織中的某些基因選擇性表達,從而增強了對P、K等物質的吸收, 使共生體快速適應鉀礦區環境脅迫[5-6]。

同時研究發現, 鉀礦區海金沙內生真菌出現的頻率高于非鉀礦區。一方面可能由于蓮花洞森林公園植被類型豐富, 喬灌木層發達, 郁閉度大,影響內生真菌孢子在垂直方向的傳播, 而鉀礦區植被類型單一可能有利于內生真菌的定殖; 另一方面, 可能由于蓮花洞森林公園位于市郊, 交通便捷, 游客眾多, 人類活動頻繁和森林管理實踐在一定程度上影響了內生真菌孢子在水平方向的傳播, 例如 Sieber Canavesi等研究發現植物在被砍伐之后比在自然建立的情況下內生真菌出現的頻率更高, 即同種植物中內生真菌出現的頻率差異性與管理實踐有關[36]。不過影響植物內生真菌菌群分布、組成特征和演替變化的因素和作用機制既是多方面的又可能是較為復雜的, 需進一步探究。

致謝:感謝中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗郭良棟研究員給予的幫助和指導。

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Diversity and ecological distribution of endophytic fungi associated withLygodium japonicum in potassium mining areas

ZHANG Hongfang1, GAN Huiyun1, QIAN Xu1, CHEN Ye1,2,*
1.School of Pharmacy and Life Sciences,Jiujiang University,Jiujiang332000,China2.Jiujiang Key Laboratory of Regional Industry and Urban Ecology,Jiujiang332000,China

In order to make clear the species diversity, community composition and ecological distribution of the endophytic fungi isolated from the fern in different potassium mining areas, the study tookLygodium japonicumin three different potassium mining areas (Longnan Anjishan, Nanjing dragon mountain, Lichuan longan) as experimental material.The isolation frequency, species composition, diversity and ecological distribution of the strains fromL.japonicumwere analyzed by the combination of traditional tissue isolation method and molecular biological method.And the endophytic fungi isolated fromL.japonicuminnon-potassium mining areas (Lianhua Hole, Lushan), were applied as a comparative control.The results showed that 477 strains were isolated from the 1200 tissue blocks.Among them, 229 strains were spore producing strains, accounting for 48%, while 248 strains were non spore producing strains, accounting for 52 %.According to morphological identification of the spore producing groups and comparison of the similarity of 5.8 S rDNA and ITS sequences of non spore producing strains, 438 strains were identified asAlternaria, Colletotrichum,Fusarium, Peniccilliumand other 75 genera, the remaining 39 strains of non spore groups could not be identified.The isolation rate ofColletotrichum, FusariumandAlternariawere 20.96%, 11.32%, 8.81%, respectively, indicating they were dominant.The total separation frequency of the endophytic fungi in the potassium mining areas was generally higher than that in the non potassium mining area, and the separation frequency of the non potassium mining area (Lianhuadong) was 19.08%, while the highest frequency was 33.33% in Nanjing.Generally speaking, the similarity coefficient between each mining area was low, ranging from 0.07 to 0.30.There were significant differences in the number, population distribution and dominant species of endophytic fungi in different tissues.The colonization rate of endophytic fungi from petioles (44.44 %) was generally greater than that from leaves(39.41 %) and then was that from rhizomes (16.15 %).The distribution of endophytic fungi was closely related to the geographical location, climatic factors, physical and chemical properties of soil, and the changes of physiological condition and chemical composition of host plant tissues.

Lygodium japonicum; potassium mining areas; dominant strains; diversity; similarity coefficient; ecological distribution

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.05.021

Q939.5

A

1008-8873(2017)05-160-10

張紅芳, 甘會云, 錢旭, 等.鉀礦區海金沙內生真菌多樣性及生態分布研究[J].生態科學, 2017, 36(5): 160-169.

ZHANG Hongfang, GAN Huiyun, QIAN Xu, et al.Diversity and ecological distribution of endophytic fungi associated withLygodium japonicumin potassium mining areas[J].Ecological Science, 2017, 36(5): 160-169.

2016-11-19;

2017-04-21

國家自然科學基金項目(31360064)

張紅芳(1971-), 女, 碩士, 講師, 研究方向為真菌多樣性, E-mail: 939044612@qq.com

*通信作者:陳曄, 碩士, 教授, 研究方向為植物內生真菌多樣性, E-mail:chenyejjtc@126.com