響應面法優(yōu)化巴旦木粕蛋白的提取工藝研究

楊曉平，孫 乾，孔令明

響應面法優(yōu)化巴旦木粕蛋白的提取工藝研究

楊曉平，孫 乾，*孔令明

（新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

以巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率作為衡量指標，利用堿溶酸沉法提取巴旦木粕蛋白質(zhì)。用單因素試驗考查料液比、加熱溫度、加熱時間及pH值對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響，利用數(shù)學模型，確定最佳工藝。結(jié)果表明，巴旦木蛋白的等電點為4.0；其最佳工藝條件為pH值9.0，料液比1∶22（g∶mL），加熱溫度48.2℃，加熱時間59.2 min。在此工藝條件下，巴旦木蛋白提取率可達58.67%。

巴旦木；蛋白質(zhì)；提取；響應面法

巴旦木（又稱巴達木或巴旦杏）屬薔薇科李亞科桃屬，我國種植巴旦杏有1 300多年的歷史，其主要產(chǎn)在天山以南，分布于我國新疆南部的偏遠沙漠等地。新疆是大陸性氣候，早晚溫差大、日照長、干旱，植物為適應此環(huán)境，在植株體內(nèi)大量積累糖分和油分。新疆巴旦杏仁較國外的巴旦杏仁含油和糖量均高，味道更為香甜。據(jù)相關(guān)資料報道，巴旦木杏仁內(nèi)的脂肪含量達58.02%（其中含有的不飽和脂肪酸占總脂肪酸的85%以上），蛋白質(zhì)含量在20.81%（其中人體所必需的氨基酸含量為5.43%），水分為6.3%，總糖8.78%，VE含量為8.34 mg/100 g，還含有豐富的礦物質(zhì)元素和人體所需的多種氨基酸，是一種較為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，使用巴旦木提取油脂后，所剩余的巴旦木餅粕中仍含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，而這些餅粕因不能充分有效利用，常被作為飼料、肥料或被當成殘余物廢棄，這不僅造成了營養(yǎng)資源的極大浪費，同時也在生產(chǎn)過程中對環(huán)境資源造成很大的污染[2]。

由于巴旦木粕的植物蛋白資源相對豐富且較為廉價，并且植物蛋白具有一定的生物活性功能，對其市場的綜合開發(fā)利用已逐漸成為當今熱點。目前，用于提取植物蛋白的方法有很多，如企業(yè)批量化生產(chǎn)所常用的堿提酸沉法、酶法、超聲波輔助提取法、微波法等。在眾多提取方式方法中，堿提酸沉法所需的設(shè)備簡單、易于操作，適合企業(yè)規(guī)模化提取植物蛋白。因此，試驗使用堿提酸沉法在巴旦木粕中提取蛋白，并對提取工藝進行優(yōu)化，使用響應面對堿提酸沉工藝進行優(yōu)化，也為開發(fā)新型植物蛋白資源提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴旦木，購于新疆烏魯木齊農(nóng)貿(mào)市場；考馬斯亮藍、95%乙醇、正己烷、NaOH和HCl，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100型高速萬能粉碎機，永康市榮浩工貿(mào)公司產(chǎn)品；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器，上海有限公司產(chǎn)品；101-1型電熱鼓風干燥箱，天津華北試驗電爐廠產(chǎn)品；TDL-5-A型低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；722N型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；DRH-100型電熱恒溫箱，常州博宏高科技設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海青浦瀘西儀器廠產(chǎn)品；標準分樣篩，浙江省上虞市道墟紗篩廠產(chǎn)品；燒杯；容量瓶。

1.3 試驗方法

1.3.1 試樣的制備

巴旦木經(jīng)粉碎脫脂后，置于40℃下烘干，用正己烷以3∶1（W/V） 的液料比提取12 h，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集正己烷重復浸提，如此操作重復3次，收集殘渣，置于陰涼干燥處備用[3]。將殘渣用粉碎機過40目篩，即為巴旦木粕蛋白。

1.3.2 巴旦木蛋白質(zhì)的提取工藝

脫脂巴旦木粕→蒸餾水溶解→用NaOH調(diào)溶液pH值→離心機離心20 min→取上清液→合并離心所得上清液→用HCl調(diào)上清液pH值→再次離心20 min→棄去上清液收集沉淀→以考馬斯亮藍作為標曲→計算提取率。

取一定量的巴旦木粕，以一定料液比制成溶液，用0.6 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值，水浴加熱一定時間后，可加快可溶性蛋白溶于溶液中，利用離心機以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心20 min，收集上清液[4]。

用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)所收集的上清液pH值，使上清液中大部分蛋白質(zhì)沉淀并析出，恒溫水浴一定時間后，用離心機以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心20 min，棄上清液收集沉淀，將離心分離的沉淀物水洗至中性，恒溫干燥，即為巴旦木粕蛋白質(zhì)[5]。

1.3.3 考馬斯亮藍法測定蛋白標準曲線

取6支具塞試管按順序加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準牛血清蛋白（BSA）溶液，再加入相應量的蒸餾水將溶液定容至1 mL，混合均勻后加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合后室溫下放置5 min，于波長595 nm處測得吸光度，以吸光度（ABS）為縱坐標、標準牛血清蛋白（BSA）質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線[6]。

1.3.4 樣品測定和蛋白質(zhì)提取率計算

樣品測定：蛋白質(zhì)堿提上清液稀釋200倍后，吸取1 mL樣品液于刻度試管中，加入考馬斯亮藍試劑5.0 mL，充分混合2 min后，于波長595 nm處測定吸光度。

式中：m——根據(jù)標準曲線換算成g的蛋白含量，g；

M——稱取的樣品含量，g；

v——樣品定容體積，mL；

V——測定樣液的體積，mL[7]。

1.3.5 單因素試驗方法

以巴旦木粕蛋白質(zhì)的提取率為指標，通過比較料液比 （1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35）、加熱溫度（30，40，50，60，70℃）、加熱時間（30，40，50，60，70 min）、pH 值 （8.0，8.5，9.0，9.5，10.0）對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.6 響應面法試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用四因素三水平的響應面分析法，選取料液比、加熱溫度、加熱時間、pH值4個因素為自變量，以巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率（Y）為響應值。

響應面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 考馬斯亮藍法標準曲線繪制

按照1.3.3的方法繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=0.006 6X+0.008 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，說明Abs在蛋白質(zhì)量濃度為0～100 μg/mL時線性關(guān)系良好。

考馬斯亮藍標準曲線見圖1。

圖1 考馬斯亮藍標準曲線

2.2 巴旦木粕蛋白提取工藝的確定

2.2.1 加熱溫度對巴旦木粕蛋白提取率的影響

準確稱量脫脂巴旦木蛋白質(zhì)粕1 g，在加熱時間60 min，料液比1∶25（g∶mL），pH值9.0的條件下，按照1.3.2工藝提取蛋白，比較加熱溫度為30，40，50，60，70℃對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響，分析試驗結(jié)果，并得出最佳加熱溫度[8]。

加熱溫度對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響見圖2。

圖2 加熱溫度對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，在加熱時間、料液比、pH值一定的條件下，加熱溫度從30℃升高至50℃過程中，蛋白提取率迅速升高，在50℃時達到最大值，這可能是由于逐漸升高的溫度會對蛋白質(zhì)的構(gòu)象產(chǎn)生改變，從而促使巴旦木粕蛋白質(zhì)的快速溶出。但是，當加熱溫度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)提取率開始下降，原因可能是溫度升高導致蛋白質(zhì)變性，使蛋白質(zhì)相互凝結(jié)沉淀，提取率下降。因此，選擇40，50，60℃3個水平進行響應面分析。

2.2.2 加熱時間對巴旦木粕蛋白提取率的影響

準確稱量脫脂巴旦木蛋白質(zhì)粕1 g，在加熱溫度50℃，料液比1∶25（g∶mL），pH值9.0的條件下，按照1.3.2工藝提取蛋白，比較加熱時間為30，40，50，60，70 min對巴旦木粕蛋白提取率的影響，分析試驗結(jié)果，并得出最佳加熱時間[9]。

加熱時間對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響見圖3。

圖3 加熱時間對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，在加熱溫度、料液比、pH值一定的條件下，加熱時間越長，巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率越高，但加熱時間超過60 min后，提取率呈現(xiàn)出平緩并稍有下降，這可能是部分蛋白分子溶脹飽和，促使提取率趨于平穩(wěn)。所以，選擇50，60，70 min 3個水平進行響應面分析。

2.2.3 料液比對巴旦木蛋白提取率的影響

準確稱量脫脂巴旦木蛋白質(zhì)粕1 g，在加熱溫度50℃，加熱時間60 min，pH值9.0的條件下，按照1.3.2工藝提取蛋白，比較料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g∶mL） 對巴旦木粕蛋白提取率的影響，分析試驗結(jié)果并得出最佳提取料液比[10]。

料液比對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，在加熱溫度、加熱時間、pH值一定的條件下，隨著料液比的增大，巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率不斷升高，這種變化可能由于在料液比較低時，溶液較黏稠，溶液溶解一定量的蛋白質(zhì)后就會達到飽和狀態(tài)，因此過低的料液比不利于巴旦木粕蛋白質(zhì)的充分溶出，料液比為1∶25（g∶mL） 時，提取率達到最大，隨著料液比的進一步增大，其提取率增加的幅度幾乎不變；但是料液比過大，會增加提取后廢水處理的負擔，而且會造成提取液中蛋白質(zhì)濃度偏低，不利于蛋白質(zhì)的絮凝沉淀，因此選擇 1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL） 3個水平進行響應面分析。

2.2.4 pH值對巴旦木蛋白提取率的影響

準確稱量脫脂巴旦木蛋白質(zhì)粕1 g，在加熱溫度50℃，加熱時間60 min，料液比1∶25（g∶mL） 的條件下，按照1.3.2工藝提取蛋白，比較pH值為8.0，8.5，9.0，9.5，10.0對巴旦木粕蛋白提取率的影響，分析試驗結(jié)果，并得出最佳pH值[11]。

pH值對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響見圖5。

圖5 pH值對巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖5可知，在加熱溫度、加熱時間、料液比一定的條件下，隨著pH值增加，巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率不斷升高。在強堿條件下，巴旦木的細胞壁遭到破壞，使蛋白溢出，但是過高的pH值有可能生成有毒的賴氨酰丙氨酸；除此之外，高堿條件下還可能導致蛋白質(zhì)變性、水解，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)；不僅會使提取蛋白質(zhì)的純度降低，還會增加一定的成本。因此，選擇pH值8.5，9.0，9.5這3個水平進行響應面分析。

2.3 巴旦木粕蛋白等電點的測定

堿液浸提后，需要用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值，使得溶液pH值達到巴旦木粕蛋白的等電點，從而使得蛋白質(zhì)沉淀出來。在利用響應面優(yōu)化堿液提取工藝試驗的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗對所得堿液進行酸沉的試驗，使用HCl分別調(diào)節(jié)堿液的pH值為3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0，巴旦木粕蛋白會在其等電點附近逐漸形成絮狀，進而沉淀出來，通過靜止后離心，采用考馬斯亮藍法測上清液蛋白的含量，吸光度越低，說明上清液中蛋白被沉淀出來。因此，越接近巴旦木粕蛋白的等電點，出現(xiàn)的沉淀則為巴旦木粕分離蛋白質(zhì)[12]。

巴旦木不同酸沉pH值吸光度大小見圖6。

圖6 巴旦木不同酸沉pH值吸光度大小

由圖6可知，酸沉靜置后測得上清液的吸光度呈現(xiàn)出先下降后上升，這主要是由于上清液中的巴旦木粕蛋白在等電點附近因電荷量為零而產(chǎn)生絮狀凝聚沉降，在pH值4.0附近，吸光度顯現(xiàn)出最低值，因此確定巴旦木粕蛋白的酸沉點為pH值4.0。

2.4 響應面模型的建立與結(jié)果分析

試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

通過Design Erpert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到回歸方程為：

在回歸方程中，對所得回歸方程做顯著性檢驗與方差分析。

回歸模型方差分析見表3。

運用Design Erpert 8.0軟件可以得到巴旦木粕蛋白提取率（Y）對自變量料液比（X1）、加熱溫度（X2）、加熱時間（X3）、pH值（X4）的二次多項回歸模型。

由表3可知，該模型的顯著性檢驗p＜0.000 1，說明模型極顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.986，說明該模型可行性好。失擬項不顯著（p=0.062 8），說明回歸模型和實際試驗擬合充分，模型可行性和精確度高，可以用該模型對超聲波輔助提取巴旦木蛋白的工藝進行分析預測[13]。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.5 巴旦木粕蛋白提取的響應面分析

各因素對巴旦木粕蛋白提取率的影響順序為料液比＞pH值＞加熱溫度＞加熱時間，其中料液比和pH值對巴旦木粕蛋白的提取率影響較大[14]。

各因素的交互作用以及對響應值的影響可通過響應面及等高線的形狀反映，響應面坡度越陡、等高線密集成橢圓形表示交互作用的兩因素影響越大，而圓形表示不顯著。等高線的圓心處為極值條件。圖7～圖10為交互作用顯著的因素對巴旦木蛋白質(zhì)提取率的影響[15-16]。

交互作用響應面見圖7，交互作用等高線見圖8，交互作用響應面見圖9，交互作用等高線見圖10。

圖7 交互作用響應面

圖8 交互作用等高線

圖9 交互作用響應面

3 結(jié)論

（1）通過單因素試驗得出巴旦木粕蛋白提取的最適條件為pH值9.0，料液比1∶25（g∶mL），加熱溫度50℃，加熱時間60 min。

圖10 交互作用等高線

（2）運用響應面優(yōu)化結(jié)果并進行回歸分析，確定了巴旦木粕蛋白質(zhì)提取率的試驗模型為：

經(jīng)軟件分析結(jié)果可知，巴旦木粕蛋白質(zhì)的提取的最佳條件為pH值9.0，料液比1∶22（g∶mL），加熱溫度48.2℃，加熱時間59.2 min。在此條件下脫脂巴旦木粕蛋白質(zhì)得率為58.67%。為了便于實踐操作，將其條件稍微改動為pH值9.0，料液比1∶25（g∶mL），加熱溫度50℃，加熱時間60 min，同時進行3次重復試驗，得到實際脫脂巴旦木粕蛋白質(zhì)得率為57.88%，與響應面法預測值較為接近。

新疆特殊的地域條件不僅為栽培巴旦木提供了良好的生態(tài)環(huán)境，同時也在研發(fā)和開發(fā)巴旦木等系列產(chǎn)品并逐步推廣到市場。如巴旦木豆腐、巴旦木植物蛋白發(fā)酵飲料等新型產(chǎn)品都對蛋白含量有一定的要求，而巴旦木粕蛋白是一種營養(yǎng)價值很高、綜合利用性強的優(yōu)良植物蛋白，為日后人們攝取優(yōu)質(zhì)植物蛋白提供了一定的研究基礎(chǔ)。

我國新疆地區(qū)巴旦木種植面積較廣，對巴旦木榨油后的餅粕進行蛋白提取，不僅實現(xiàn)了廢物利用，而且還有較高營養(yǎng)價值的優(yōu)質(zhì)蛋白，可用于保健食品的開發(fā)，為其拓寬了利用蛋白質(zhì)的應用范圍。

[1]劉金榮，但建明，江發(fā)壽，等.巴旦杏仁的營養(yǎng)成分與理化常數(shù)測定 [J].營養(yǎng)學報，2002，24（2）：202-203.

[2]魏玲，李學琴，孟憲鋒，等.葵花粕蛋白的反膠束萃取 [J].食品研究與開發(fā)，2007，28（11）：16-19.

[3]劉淼，王俊.山核桃仁堿液浸泡法去皮工藝的研究 [J].農(nóng)業(yè)工程學報，2007，23（10）：256-261.

[4]楊偉強，禹山林，袁濤.堿提酸沉法制取花生分離蛋白工藝研究 [J].花生學報，2008，37（4）：12-17.

[5]王振宇，楊麗娜，李宏菊.堿提酸沉提取紅松仁分離蛋白的工藝研究 [J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2008，20（6）：71-74.

[6]楊正坤，王秀麗，龍施華，等.考馬斯亮藍染色法測定大豆莖葉中蛋白質(zhì)含量 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2012，51（20）：4 610-4 612.

[7]張潤楚，鄭海濤，蘭燕，等.試驗設(shè)計與分析及參數(shù)優(yōu)化 [M].北京：中國統(tǒng)計出版社，2003：147-151.

[8]寇明鈺.花椒籽蛋白分離提取及功能性質(zhì)研究 [D].重慶：西南大學，2006.

[9]劉順湖，李桂菊，王曉強，等.大豆蛋白質(zhì)提取工藝中酸沉pH值的簡單效應分析 [J].濟寧學院學報，2010，31（6）：37-41.

[10]李艷，鄭亞軍.杏仁分離蛋白提取工藝的研究 [J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（1）：64-66.

[11]姜莉，徐懷德，何玉君，等.核桃渣中蛋白質(zhì)的提取工藝及其功能性研究 [J].食品科技，2007，32（4）：237-240.

[12]孫月娥，明鳴，王衛(wèi)東，等.巴旦木蛋白提取工藝 [J].食品科學，2011，32（18）：19-23.

[13]王豐俊，楊朝暉，馬磊，等.響應面法優(yōu)化核桃蛋白提取工藝研究 [J].中國油脂，2011，36（3）：33-37.

[14]趙節(jié)昌.響應面法優(yōu)化酸棗仁蛋白提取工藝 [J].食品科學，2013，34（16）：134-138.

[15]施瑛，裴斐，周玲玉，等.響應面法優(yōu)化復合酶法提取紫菜藻紅蛋白工藝 [J].食品科學，2015，36（6）：51-57.

[16]周麗卿，杜雙奎，趙佳，等.響應面法優(yōu)化鷹嘴豆蛋白提取工藝 [J].食品科學，2012，33（8）：66-70.◇

Study on Optimization of Extraction Technology of Sweet Almond Protein by Response Surface Method

YANG Xiaoping，SUN Qian，*KONG Lingming
（College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052，China）

Sweet almond meal to protein extraction rate as the index，the use of alkali solution and acid extraction of sweet almond protein precipitation method.By single factor experiment study ratio of material heating temperature，heating time and pH value，liquid on sweet almond meal protein extraction rate，establishment of mathematical model，to determine the best process.Test results showed that the isoelectric point of sweet almond protein 4.0.The optimal process condition for：pH value 9.0，solid to liquid ratio 1∶22 （g∶mL） and heating temperature 48.2 ℃，heating time 59.2 min.Under the optimum conditions，the extraction rate of sweet almond protein could reach 58.67%.

sweet almond；protein；extraction；response surface analysis

S662.9

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.038

1671-9646（2017） 10b-0029-05

2017-06-01

熱榨植物油餅粕中變性蛋白改性修飾關(guān)鍵技術(shù)研究（201411107）

楊曉平（1976— ），男，碩士，副教授，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。*

孔令明（1976— ），男，博士，教授，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。