小鼠胎兒與幼鼠腦蛋白的SDS-PAGE分析

俞海東，韓榮勛，羅靜波，許巧情，楊軍

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

小鼠胎兒與幼鼠腦蛋白的SDS-PAGE分析

俞海東，韓榮勛，羅靜波，許巧情，楊軍

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

采用SDS-PAGE凝膠電泳法，通過比較分析妊娠16.5d的鼠胎兒腦蛋白樣品及出生后7d幼鼠腦蛋白樣品的蛋白組成，研究了鼠大腦發育過程中出生前后腦蛋白質組成的差異。分離后的凝膠經考馬斯亮藍染色得到的電泳圖譜分析結果表明，采用8%的分離膠時觀察到4條電泳條帶存在差異，而采用15%的分離膠時則有2條電泳條帶存在差異。由此表明，在2個不同發育時期的樣品中共發現有6條蛋白質條帶存在表達差異。

SDS-PAGE；妊娠16.5d；出生7d；腦蛋白；小鼠

蛋白質在基因實現其功能的過程中發揮著重要的作用。腦中蛋白質占腦總重量的1/3左右，同時腦蛋白的研究也是蛋白質研究中的一個重要領域。大腦的發育并不是出生后才開始的，在胎兒階段，大腦就在進行著自己的發育過程。對出生后10、17、24d等不同腦發育期C57/BL6小鼠的研究表明，小鼠腦組織發育期間的細胞增生和分化與發育時期和腦組織區域相關[1]。目前國內外對于蛋白質的研究主要是集中于蛋白質組學的研究和特定蛋白質的功能研究。因此，本研究采用SDS-PAGE分析方法對懷孕16.5d鼠胎兒和出生7d的幼鼠腦蛋白質組成進行了比較分析，從蛋白質分子水平探索出生前后小鼠腦蛋白整體變化規律，以為研究小鼠大腦發育相關蛋白質和找出大腦發育的關鍵蛋白質提供參考。

1 材料與方法

1.1樣品的采集和準備

用健康的4周齡以上小白鼠母鼠和公鼠，母鼠在下午腹腔注射5IU的PMSG 48h后再注射5IU的HCG。注射完HCG的小鼠以1∶1的公母比例合籠過夜。第二天早晨觀察母鼠是否有陰道栓存在，有陰道栓的母鼠即可認為已懷孕并開始計算懷孕日期。之后在妊娠第16.5天和小鼠出生后第7天收集胎兒和幼鼠大腦作為實驗樣品。

收集的腦組織用PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS稱重，將0.1g腦組織放入玻璃勻漿器，加入1000μL裂解液(0.3%SDS、3%DTT、蛋白酶抑制劑、和0.5mol/LTris/HCl，pH8.0)充分混合后在低溫條件下對樣品進行超聲波粉碎處理，再在室溫條件下反應1h后在4℃、12000r/min條件下離心20min去除沉淀物。離心后取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作為標準溶液，采用雙縮脲法測定蛋白濃度后分裝成每管60μg樣品并保存于-70℃冰箱中。

1.2SDS-PAGE分析

SDS-PAGE采用8%和15%分離膠[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40%(29∶1)Acry/Bis、蒸餾水、10% SDS、10% APS、TEMED]，本研究采用同等蛋白質含量與同等樣品體積的上樣方法，上樣順序為Marker、60μg出生7d后的幼鼠腦蛋白、60μg懷孕16.5d的小鼠胎兒腦蛋白。在100V電壓條件下進行分離，實驗所用Marker電泳后出現7條條帶，分子質量分別為200、150、100、80、60、40ku。

電泳結束后取出凝膠，經超純水漂洗后將凝膠放入固定液[30%(v/v)甲醇、10%(v/v)醋酸]中固定1h，然后取出凝膠放入考馬斯亮藍R-250染色液中染色24h。染色結束后用脫色液(1%醋酸)脫色后進行圖像采集。

2 結果與分析

對相同蛋白質質量的懷孕16.5d的小鼠胎兒腦蛋白和出生7d的幼鼠腦蛋白，用8%、15%的分離膠在相同電泳條件下進行SDS-PAGE凝膠電泳，所得的電泳圖譜見圖1和圖2。由圖1可以看出，在8%的分離膠中，分子質量60ku以下的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品少1條；分子質量40ku以上的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品少1條；分子質量40ku以下的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品少1條；分子質量30ku以下的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品多1條。而在15%的分離膠中可觀察到，分子質量40ku以上的條帶，懷孕16.5d的樣品比出生7d的樣品多1條；分子質量30ku以下的條帶，在出生7d的樣品中沒有條帶，在懷孕16.5d的樣品中只有1條(圖2)。

3 討論與結論

在胎兒發育中，腦的發育是重要組成部分。胎兒期、圍產期、新生兒期，各種內外環境的改變和各種因素都可能對發育中的腦造成影響[2]。小鼠大腦的發育過程大體上可以劃分為神經管形成階段、神經上皮-腦泡形成階段、神經元遷移分化階段及神經元成熟階段4個階段[3]。而小鼠腦蛋白的生成是從神經管形成階段就開始的，因此對于小鼠腦蛋白的研究也必須從胎兒時期開始，這是系統性地研究小鼠腦部發育所必須的。在蛋白組學研究方面，已經開展的腦蛋白質組圖譜的繪制研究對象主要有人腦、鼠腦、人腦脊液、垂體等[4]。Tsugita等[5]對近交系C57BL/6小鼠大腦的1000余種蛋白進行了功能上的分類，而在特定蛋白質的功能研究領域方面，李波等[6]發現在小鼠腦發育過程中葡萄糖調節蛋白GRP78和GRP94與神經細胞的分化和腦的形態建成有關，它們分別在腦發育的不同時期可能起著特異性地參與神經細胞分化基因產物的折疊和翻譯調控作用。

而小鼠胎兒的腦形態在懷孕12.5d時初步建立，在后期的胚胎發育過程中，腦的組織形態進一步完善，腦器官形態逐步成熟[7,8]。

為了探討出生前后小鼠腦蛋白整體變化規律及與大腦發育相關的蛋白質，本研究采用SDS-PAGE方法比較分析了懷孕16.5d和出生7d的小鼠腦的主要蛋白質組成。結果表明在凝膠圖譜中兩者蛋白質表達表現出了顯著差異。在8%的分離膠上進行的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上觀察到出生7d小鼠腦蛋白樣品與懷孕16.5d胎兒腦蛋白樣品有4條電泳條帶存在差異。在15%的分離膠上進行的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上觀察到出生7d小鼠腦蛋白樣品與懷孕16.5d胎兒腦蛋白樣品有2條電泳條帶存在差異。15%的分離膠由于較小的孔徑能把分子量較小含量豐富的酪蛋白分離開來，所以能看到高分子量蛋白質組分分離后的條帶。

在此前與老化和發育相關的研究中，王靜等[9]采用雙向電泳方法分析了胚胎16d、出生后7d及出生后60d等3個發育時期的C57/Bl6雌性小鼠腦組織，并鑒定出8個蛋白點，其中α烯醇酶、磷蛋白質P19及2個肌動蛋白在各發育階段均有穩定表達，而C14orf166同源蛋白、28×103熱/酸穩定的磷蛋白、3-巰基丙酮酸硫基轉移酶、40S核糖體蛋白S3a等4個蛋白隨年齡增大而豐度減低。之后，朱蕾[10]在采用雙向電泳方法分析的快速老化模型小鼠年齡增加過程中腦蛋白質組研究中發現，在海馬組織蛋白中有多個差異表達的蛋白點存在。而在與疾病相關的腦蛋白研究中，謝妮等[11]在采用人類巨細胞病毒(HCMV)感染小鼠腦組織前后的比較蛋白質組學雙向電泳技術研究中發現顯著差異點36個，并鑒定出HCMV被膜蛋白pp65等6個蛋白。呂琳等[12]采用iTRAQ技術對弓形蟲慢性感染小鼠與健康小鼠的腦組織進行蛋白組學分析時發現了461個差異表達蛋白。

由于本研究采用的是比較簡便的SDS-PAGE法，所以只能觀察到不同時期蛋白條帶之間的差異，要了解表達有差異的蛋白質條帶的具體信息，需要進行進一步的分析鑒定。本研究揭示了小鼠在胎兒及幼鼠階段的腦蛋白質組成的差異，這對進一步研究小鼠大腦發育相關蛋白質并找出大腦發育的關鍵蛋白質提供了基礎資料。

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2017-07-07

長江大學博士啟動基金項目(120/801200010128)。

俞海東(1978-)，女，講師，博士，主要從事蛋白質的色譜分離與質譜分析研究。通信作者：韓榮勛，hanrongxun@126.com。

[引著格式]俞海東，韓榮勛，羅靜波，等.小鼠胎兒與幼鼠腦蛋白的SDS-PAGE分析[J].長江大學學報(自科版)，2017,14(18)：44～46.

S593+.2；Q959.837

A

1673-1409(2017)18-0044-03

[編輯] 余文斌