江陵天星觀一號楚墓出土飽水木漆器F446中真菌對硬松木的腐蝕研究

章俊

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

雷瓊，邱祖明

(湖北省荊州文物保護中心，湖北 荊州 434020)

范曉丹，汪儉，馬立安

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

江陵天星觀一號楚墓出土飽水木漆器F446中真菌對硬松木的腐蝕研究

章俊

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

雷瓊，邱祖明

(湖北省荊州文物保護中心，湖北 荊州 434020)

范曉丹，汪儉，馬立安

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

采用ITS序列分析方法對飽水木漆器F446(編號F)及其保存水環境(編號S)中的真菌進行了鑒定，并選取典型菌按5×107個真菌孢子/瓶菌量接種馬尾松(Pinusmassoniana)心材(懸于無菌自來水中)，28℃培養300d，測試木材的損失率。結果發現，從F中分離的真菌犁頭霉屬(Absidia)為優勢菌屬，其余真菌菌屬有曲霉屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)，S中真菌曲霉屬(Aspergillus)為優勢菌屬，其余真菌菌屬為枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉菌屬(Penicillium)及踝節霉菌屬(Talaromyces)。挑選從F和S中分離出的14株典型菌進行木塊腐蝕試驗，與對照組比較，其中有4株菌對馬尾松心材的腐蝕率差異達到極顯著(P<0.01)，2株菌對馬尾松心材的腐蝕率差異達到顯著(P<0.05)；這些真菌對馬尾松木材有一定的腐蝕作用，但是腐蝕率非常低，最高僅2.77%，表明這些真菌對試驗木材馬尾松腐蝕并不嚴重。

飽水木漆器；ITS序列分析；木材腐蝕率；文物保護

我國木漆器歷史悠久，工藝精湛，不同時代有不同的風格，具有很高的考古價值及觀賞價值。然而，木漆器出土以后，易干裂變形，主要還是保存在水池中[1,2]。文物木漆器在地下密封環境下，微生物代謝活動幾乎停滯，對木漆器的腐蝕相對有限[3]，但是，文物出土以后，一旦環境適宜，微生物就會大量繁殖，山西翼城和長沙譚家坡考古遺址都曾爆發過大規模真菌污染現象[4,5]。微生物對木質文物有腐蝕作用，尤其是在環境條件適宜的情況下，有些真菌對木材有著很大的腐蝕率，甚至高達60%以上[6,7]。1978年，飽水木漆器F446出土于天星觀一號楚墓，保存在荊州博物館水池中近40a。本研究對文物木漆器F446樣品及其保存水環境樣品中分離的真菌進行了鑒定，并模擬文物保存的水環境，評價了其對木材腐蝕性影響，并針對腐蝕性強的真菌，擬篩選殺菌抑菌劑，以期為延長飽水木漆器的保存期提供生物學保護依據。

1 材料與方法

1.1材料

菌株：試驗菌株為木漆器F446(編號F)及保存水環境(編號S)中分離的真菌，保存于長江大學生命科學學院微生物實驗室[8]。根據菌落特征、菌絲和孢子結構與形態，將F中分離的真菌初步分為5類，每類選取1株菌，編號分別為F-1～F-5；S中分離的真菌初步分為9類，每類選取1株菌，編號分別為S-1～S-9。

馬尾松：2根，購自湖北省荊州市某木材市場。

試劑：ITS序列擴增通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)[9]由上海生工生物(Sangon)公司合成，PCR所用試劑購于北京鼎國生物公司。其他常用試劑，如CTAB、Tris-HCl、NaCl、EDTA、Tris飽和酚、氯仿和異戊醇等試劑為分析純或化學純。

1.2方法

1.2.1培養基配制

PDA培養基主要成分：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉20g/L。按文獻[10]所述方法進行配制。

1.2.2基因組DNA提取

將PDA培養基上28℃培養2d的真菌菌絲體以無菌刮鏟刮至預冷的研缽(-80℃過夜)中，快速研磨為粉末，裝入1.5mL EP管，并加入800μL 65℃預熱的CTAB緩沖液(2% CTAB，100mmol/L pH為8.0的Tris-HCl，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA)，65℃水浴30min；加入等體積的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，12000r/min離心5min，取上清液，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，12000r/min離心5min，取上清液，加-20℃預冷的無水乙醇，混勻并放置-20℃冰箱中30min；12000r/min離心10min，然后傾倒液體，并用預冷的70%乙醇洗滌沉淀(基因組DNA)2次，晾干后加入50μL ddH2O，4℃或-20℃冰箱中貯存備用。

1.2.3ITS序列分析

PCR反應體積為50μL，其體系為5μL 10×Taq Buffer，5μL dNTPs(2mmol/L)，1μL Taq (2U/μL)，1μL上、下游引物(各10mmol/L)，33μL ddH2O，4μL基因組DNA模板。PCR擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環；72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。真菌ITS4和ITS5擴增的片段長度為500～700bp，合格的PCR產物送上海生工生物公司測序。序列在NCBI上進行比對，單個靶區域序列比對真菌種屬鑒定標準參照文獻[11]，并采用MEGA6.0軟件進行真菌菌群組成分析。

1.2.4測試菌對木材的腐蝕作用

按文獻[12]的方法選取馬尾松心材(邊部內側與髓心之間顏色較深部分)，切割成2cm×2cm×1cm小塊狀，裝入燒杯放入烘箱中(103±2)℃烘至恒重[13]，每次稱量前將木塊放入干燥器中冷卻。恒重后稱量10g左右的木塊分裝在規格相同的藍蓋螺紋廣口圓瓶中，121℃ 30min滅菌后冷卻備用[12,14]。將菌體接種至PDA培養基上培養5～7d，無菌水沖洗菌體后過濾收集菌孢子，并采用血球計數板顯微鏡下計數，每瓶接種孢子數目為5×107個，用無菌自來水定容至250mL，每菌株6個重復，并設不接菌對照組(CK)，28℃培養300d后，除去木塊表面真菌，烘干至恒重后測定木塊重量，計算木塊損失率[13]，并采用SPSS19.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1真菌的鑒定

真菌ITS4和ITS5擴增片段比對結果如表1所示，結合圖1(真菌菌群組成圖)，將14株真菌鑒定為5個屬。其中，F中，犁頭霉屬(Absidia)為優勢菌屬，占木材樣品真菌總數的69.2%；S中，曲霉屬(Aspergillus)為優勢菌屬，占水樣真菌總數的61.1%。F-1和S-1為黃曲霉(Aspergillusflavus)，F-2和S-8為雜色曲霉(Aspergillusversicolor)，F-3為犁頭霉屬(Absidiasp.)，F-4和S-9為青霉菌屬(Penicilliumsp.)，F-5為煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)，S-2為枝孢霉屬(Cladosporiumsp.)，S-3為土曲霉(Aspergillusterreus)，S-4為菌核曲霉(Aspergillussclerotiorum)，S-5為Penicilliumgeorgiense，S-6和S-7為踝節霉菌屬(Talaromycessp.)的不同種。

表1 F446文物木漆器樣品及其水環境中真菌序列比對結果

圖1 F446文物木漆器樣品及其水環境中真菌菌群組成

2.2真菌對馬尾松心材的腐蝕

14株真菌對木材腐蝕試驗結果見表2。與對照組CK相比較，F-1(Aspergillusflavus)、F-5(Aspergillusfumigatus)、S-1(Aspergillusflavus)、S-2(Cladosporiumsp.)對馬尾松心材的腐蝕率較高，分別為2.77%、2.58%、2.57%和2.66%，達到極顯著性差異(P<0.01)；F-2(Aspergillusversicolor)和S-7(Talaromycessp.)對馬尾松心材的腐蝕率分別為2.56%和2.55%，達到顯著性差異(P<0.05)，其余真菌對馬尾松心材無明顯的腐蝕作用(P>0.05)。

表2 真菌對馬尾松心材的平均損失率

注：**表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(P<0.05)，未標注表示不顯著(P>0.05)。

3 討論與結論

本研究從F和S中分離的真菌共計5個屬，分別為曲霉屬(Aspergillus)、犁頭霉屬(Absidia)、踝節霉菌屬(Talaromyces)、青霉菌屬(Penicillium)和枝孢霉屬(Cladosporium)。F中，犁頭霉屬(Absidia)為優勢菌屬，分離的菌株ITS序列相似度僅96%，可能為一個新種，且在其保存的水環境中未分離得到，說明分離得到的犁頭霉屬可能來源于木漆器樣品而非保存環境。S中，曲霉屬(Aspergillus)為優勢菌屬，還分離得到青霉菌屬(Penicillium)、踝節菌屬(Talaromyces)和枝孢霉屬(Cladosporium)。青霉、曲霉是空氣中常見的微生物，在紙質、紡織及竹木文物病害微生物調查中都曾發現[15～17]，由此可見，水樣中真菌可能主要來源于保存環境。

F和S中分離的真菌皆為霉菌。霉菌喜好潮濕環境，這也是荊州博物館暗室水槽中保存的文物木漆器F446(編號F)及保存水環境(S)真菌為霉菌的原因。但是，荊州博物館保存木漆器的水池深達1m左右，室溫常年保持較低水平，池水定期更換，可以有效控制文物木漆器保存環境中的霉菌的繁殖。所以，F和S中分離的真菌數目較少，分別為90CFU/g和5CFU/L[8]。通過對分離的真菌進行腐蝕作用測定，發現曲霉屬(Aspergillus)、枝孢霉屬(Cladosporium)和踝節霉菌屬(Talaromyces)部分菌株對馬尾松心材存在腐蝕作用。霉菌主要生長在木質文物表面或近表面，但其菌絲也可沿木材紋孔侵入木質文物內部，通過分泌胞外酶分解一些復雜的有機物，如纖維素、幾丁質、蛋白質等，造成文物的破壞。田金英等[18]研究發現大量的霉菌對文物造成巨大的破壞，霉菌包括青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、木霉屬(Trichoderma)等多類霉菌，涉及的文物有書畫、絲織品、竹木、漆器、壁畫等。

本研究中真菌對馬尾松心材的損失率最大僅2.77%，屬于微損，且文物木漆器保存環境及其自身真菌數目均處于一個較低水平，說明真菌對文物木漆器F446的腐蝕作用有限。但是，由于木漆器樣品及其水環境中存在的真菌主要類別為霉菌，霉菌易產生分生孢子，繁殖力極強，一旦條件適宜，短時間會快速爆發，存在著潛在風險，所以博物館對木器漆保存環境的控制不可松懈。

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2017-04-14

出土木漆器保護國家文物局重點科研基地開放課題(33110016)。

章俊(1991-)，男，碩士生，研究方向為環境微生物研究。通信作者：馬立安,malian@yangtzeu.edu.cn。

[引著格式]章俊,雷瓊，邱祖明,等.江陵天星觀一號楚墓出土飽水木漆器F446中真菌對硬松木的腐蝕研究J.長江大學學報(自科版) ，2017，14(18)：47～50，60.

Q939.98

A

1673-1409(2017)18-0047-04

[編輯] 余文斌