抗菌治療對兔頰VX-2鱗癌感染性微環境中樹突狀細胞的影響

陳志紅 易杰 黃桂林 張霓霓 姚禮 張立剛

抗菌治療對兔頰VX-2鱗癌感染性微環境中樹突狀細胞的影響

陳志紅 易杰 黃桂林 張霓霓 姚禮 張立剛

目的探索抗菌治療對兔頰VX-2鱗癌感染性微環境中樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)成熟及功能的影響。方法瘤粒植入形成兔頰VX-2鱗癌后，附加機械創傷及高糖飲食獲得該鱗癌的炎癥模型，再分為3 組(n=6)，A組：頰癌炎癥模型使用抗生素治療3 d；B組：頰癌炎癥模型以生理鹽水代替抗生素對照；C組：單純頰癌不做處理。3 d后收集各組腫瘤標本，制成勻漿，取上清液與正常兔外周血單核細胞共培養，流式細胞儀檢測DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表達，混合淋巴細胞反應檢測DCs刺激T細胞增殖的能力。結果HLA-DR、CD83、CD86陽性率及刺激指數(stimulate index,SI)由高到低均分別為：C組>A組>B組(P<0.05)。結論抗菌治療有助于感染兔頰VX-2鱗癌微環境中樹突狀細胞的成熟及功能恢復。

抗菌治療； 炎癥； VX-2鱗癌； 樹突狀細胞

自1990 年以來，全球范圍內口腔癌的發病率及其在全身各系統中發生腫瘤所占比例逐年上升[1]。口腔中適宜的溫度及濕度、大量的食物殘渣及細菌，以及口腔癌患者在語言或進食時牙齒、食物等對腫瘤造成創傷等原因，導致口腔癌患者腫瘤局部常常伴有感染，出現疼痛、出血等癥狀。近年的研究證實了炎癥與腫瘤的發生有著明顯的因果關系[2]，但口腔癌繼發局部感染后是否會導致腫瘤微環境中與免疫相關的細胞發生功能改變，抗菌治療能否對患者的局部免疫功能產生影響，在我們檢索的文獻中還未見相關報道。本研究擬通過建立兔頰VX-2鱗癌感染性微環境模型，探索抗菌治療能否影響DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表達及DCs的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

種植于新西蘭兔后腿的VX-2荷瘤兔1 只，購自中山大學。2～4 月新西蘭兔25 只，體重約1.5～2 kg，購自重慶滕鑫生物技術有限公司。

1.2 實驗試劑

注射用普魯卡因青霉素(上海公誼獸藥廠)；替硝唑片(重慶科瑞制藥集團有限公司)；兔外周血淋巴細胞分離液 (天津灝洋生物制品科技有限公司)；APC-CD83、PE-CD86、FITC-HLA-DR、APC-IgG1、PE-IgG1、FITC-IgG2a抗體(BD公司,美國)；尼龍毛(鄭州派和泰德醫藥科技有限公司)；活細胞計數試劑盒(同仁化學研究所,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔頰VX-2鱗癌模型的建立及干預 參照張林等[3]建模方法，取荷瘤兔大腿腫瘤制備成大小1 mm3的瘤粒，在無菌操作下植入到實驗兔頰肌內，約6～7 d腫瘤形成。實驗第14天，在腫瘤部位切除體積1 cm×1 cm×0.3 cm的黏膜塊，形成局部創傷，術后全部實驗兔予以高糖黏性牛奶飲用。實驗第17天，腫瘤表面黏膜破潰紅腫，建模成功。根據不同的干預措施分成3 組，每組6 只，共18 只。A組：腫瘤伴炎癥，150 mg/kg替硝唑片灌胃，22 000 U/kg注射用普魯卡因青霉素肌肉注射；B組：腫瘤伴炎癥，20 ml生理鹽水灌胃，1 ml生理鹽水肌注；C組：單純接種的腫瘤，20 ml生理鹽水灌胃，1 ml生理鹽水肌注。1 次/d，連續3 d。實驗第20天，完整切取所有腫瘤，部分標本行HE染色，光鏡觀察。其余標本以200 g/L與RPMI 1640培養基混合后制成勻漿, 3 000 r/min離心20 min×2 次,取上清液，存于-20 ℃冰箱內。

1.3.2 兔外周血源樹突狀細胞的培養 取1 只正常新西蘭兔，經皮穿刺心臟采血約15 ml，參照說明書分離外周血單個核細胞，將細胞濃度調整至2×106/ml，再以1 ml/孔加入到6 孔板內，37 ℃、5%CO2培養箱中靜置3 h，吸棄上清液，剩余細胞即為單核細胞。將1.3.1中所得上清液以0.22 μm過濾器過濾3 遍后與上述單核細胞一起培養。A組上清液1 ml+10%胎牛血清RPMI 1640培養基2 ml；B組上清液1 ml+10%胎牛血清RPMI 1640培養基2 ml；C組上清液1 ml+10%胎牛血清RPMI 1640培養基2 ml。每組隔日半量換液，在培養第6天，收集各組細胞，相差顯微鏡和掃描電鏡(SEM)下觀察細胞形態。

1.3.3 流式細胞儀(BD公司，美國)檢測HLA-DR、CD83、CD86的表達 制備單細胞懸液，調整濃度至1×106/ml，檢測活細胞率>95%。3 組分別取6 個樣本，每個樣本設實驗管(100 μl細胞懸液，加入HLA-DR-FITC、CD83-APC、CD86-PE各10 μl)和對照管(100 μl細胞懸液，加入IgG2a-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE各10 μl)，室溫避光孵育20 min，然后1 500 r/min離心10 min，棄上清，PBS清洗2 次，以0.5 ml PBS緩沖液混勻，再加0.5 ml 1%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱避光保存，流式細胞儀檢測HLA-DR、CD83、CD86的表達。

1.3.4 同種異源混合淋巴細胞反應 分離外周血單個核細胞，靜置3 h后取懸浮細胞。參照考尼龍毛柱法，分離懸浮細胞中的T細胞，調整細胞濃度至5×106/ml。3 組DCs中分別加入25 mg/L絲裂霉素C，培養箱中孵育30 min ，PBS清洗3次，懸于10%胎牛血清RPMI 1640培養基中，調整細胞濃度至1×106/ml。以3 組DCs為刺激細胞，T細胞為效應細胞，另設單純培養液對照組和陰性對照組(只添加T細胞)。將DCs和T細胞以 1∶5、1∶10、1∶20 的比例，每組3 復孔，混于96 孔板中，終體積200 μl。孵育72 h，然后每孔加入活細胞計數盒試劑20 μl，孵育3 h。酶標儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭)于450 nm處檢測各組A值并計算刺激指數(stimulate index,SI),SI=(待測樣品孔A值-培養液對照組A值)/(陰性對照組A值-培養液對照組A值)。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 兔頰VX-2鱗癌炎癥模型的病理學改變

制備炎癥模型后第3天，肉眼下見A組頰部黏膜破潰，腫瘤外露，稍紅腫，無明顯滲血；B組頰部黏膜破潰，腫瘤外露，腫瘤組織紅腫、滲血；C組兔頰部黏膜完整，未見明顯破潰。鏡下見各組腫瘤組織內大量形態、大小不一的癌細胞，異型性明顯，其中A組鱗癌組織內見少量炎性細胞浸潤；B組炎性細胞浸潤較A組多；C組則炎性細胞少見(圖 1)。

2.2 鏡下DCs形態

細胞培養第6天，相差顯微鏡下見部分細胞呈懸浮或半懸浮狀態生長，并且聚集成團(圖 2A)。掃描電鏡下見DCs表面有大量褶皺及長短、粗細不等的突起(圖 2B)。

圖 1 各組VX-2鱗癌病理學觀察(HE， ×100)

Fig 1 Pathological observation of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma in the 3 groups(HE, ×100)

圖 2 第6天DCs的形態(A: 相差顯微鏡, ×400； B： 掃描電鏡, ×5 000)

Fig 2 Morphology of DCs on the 6th day of cell culture(A: Phase microscope, ×400； B： SEM, ×5 000)

2.3 3 組DCs表型的流式細胞儀檢測

3 組HLA-DR、CD83、CD86陽性率F值分別為18.444、30.033、40.664，P<0.01，具有統計學意義，說明3 組中至少有2 組HLA-DR、CD83、CD86陽性率不相等，進一步使用LSD-t檢驗兩兩比較，P<0.05，具有統計學意義(表 1)。

2.4 同種異源混合淋巴細胞反應

3 組SI相比較的F值分別為12.579、30.042和15.245，P<0.05，具有統計學意義，說明3 組中至少有2 組SI不相等,進一步行LSD-t檢驗兩兩比較，結果P值均小于0.05，具有統計學意義(表 2)。

表 1 3 組細胞表型的流式學分析

Tab 1 Flow cytometry analysis of the cell phenotype in the 3 groups

CD83CD86HLA-DRA組(n=6)2.13±0.3021.17±2.302.03±0.26B組(n=6)1.57±0.38①13.95±2.05①1.47±0.16①C組(n=6)2.60±0.18①②25.07±1.84①②2.63±0.33①②F值18.44440.66430.033P值0.0000.0000.000

注： ①與A組比較，P<0.01； ②與B組比較，P<0.01

表 2 3 組混合淋巴細胞反應刺激指數

Tab 2 Stimulate index of mixed lymphocyte reaction in the 3 groups

1∶51∶101∶20A組(n=6)1.518±0.0821.664±0.0321.530±0.086B組(n=6)1.390±0.078①1.553±0.057①1.431±0.044①C組(n=6)1.629±0.086①②1.741±0.028①②1.618±0.038①②F值12.57930.04215.245P值0.0010.0000.000

注： ①與A組比較，P<0.05； ②與B組比較，P<0.05

3 討 論

所謂腫瘤炎性微環境,就是指腫瘤發生發展過程中所處的炎性內環境，主要包括腫瘤細胞、炎性細胞及炎性因子、細胞外基質成分、血管及淋巴管網絡等。由于大量炎性細胞及因子的存在，進一步促進了腫瘤增殖、轉移及血管生成，使腫瘤微環境更加復雜多變[4]。

DCs是迄今為止體內功能最強大的抗原提呈細胞。在腫瘤微環境中浸潤著大量的DCs，可通過各種途徑發揮抗腫瘤免疫[5]。由于各種抑制因子的作用，使DCs加工及提呈抗原能力減弱[6-7]。在腫瘤炎性微環境中，大量的炎性細胞和炎性因子如腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAM)、髓源性抑制細胞(myeloid derived suppressor cell,MDSC)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、 IL-10等，可進一步抑制DCs成熟及功能，導致免疫逃逸的發生。如：炎癥相關細胞MDSC可直接或通過產生大量Arg-1和iNOS間接抑制DCs的功能[8]。炎性因子IL-6可通過激活JAK2-STAT3信號通路誘導DCs功能障礙，削弱機體的免疫監視[9]。IL-10不僅可通過下調DCs表面標記分子MHC及B7的表達，使其無法提呈抗原至T細胞[10]，還可誘導初始T細胞轉化為調節T細胞(regulatory T cell, Treg)，Treg通過以下途徑進一步阻止imDC的成熟[11]：(1)Treg較初始T細胞更易更快聚集在DCs周圍，阻斷DCs激活初始T細胞；(2)Treg抑制DCs表面CD80、CD86分子，使其無法提呈抗原至T細胞。另外，在腫瘤炎性微環境中VEGF也可通過各種途徑抑制DCs分化、成熟及功能[12]。

本實驗首先建立兔頰VX-2鱗癌及其炎癥模型，連續3 d使用抗生素進行抗感染治療，然后通過肉眼觀察到A組腫瘤表面紅腫、潰爛情況較B組明顯改善，鏡下見A組腫瘤組織內炎性細胞浸潤較B組少。應用VX-2鱗癌上清液體外模擬腫瘤微環境，并與兔外周血單核細胞共培養，檢測DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86表達情況及其刺激T細胞增殖能力。3 組結果顯示：HLA-DR、CD83、CD86分子表達情況及SI均為C組>A組>B組(P<0.05)。由此可見炎癥對DCs細胞成熟及功能的影響，A組、B組DCs的成熟及功能受到不同程度的抑制，尤其是B組，HLA-DR、CD83、CD86分子表達及SI同A組相比，均明顯降低。由此筆者推測：通過抗菌藥物抗感染治療后，兔頰VX-2鱗癌局部環境中感染性炎癥得到控制，炎性細胞及炎性因子的釋放減少，對DCs分化成熟及功能的抑制作用也隨之減弱。也就說明了在兔頰VX-2鱗癌中，感染性炎癥能抑制DCs分化成熟及功能發揮。這提示臨床醫生應該及時處理口腔癌患者的局部感染，如避免過硬及刺激性食物，摘除腫瘤旁的不良修復體、拔除殘根殘冠等，保持局部清潔，必要時可適當進行全身抗感染，避免腫瘤進一步惡化，及早手術。這都有利于患者體內DCs的分化成熟及功能發揮，提高免疫力。

感染性炎癥抑制DCs成熟及功能的中間環節仍不清楚，需進一步研究炎癥對DCs影響的機制，從而有效阻斷其信號通路，促進DCs成熟及功能發揮。

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TheeffectsofantimicrobialtherapyondendriticcellsintheinfectedmicroenvironmentofrabbitbuccalVX-2squamouscellcarcinoma

CHENZhihong1,YIJie2,HUANGGuilin2,ZHANGNini2,YAOLi2,ZHANGLigang2.

1. 550002Guiyang,DepartmentofStomatology,People'sHospitalofGuizhouProvince,China; 2.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,StomatologicalHospital,ZunyiMedicalCollege

Objective: To study the effects of antimicrobial therapy on the maturation and function of dendritic cells(DCs) in the infected microenvironment of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma.MethodsThe inflammatory models were obtained by mechanical trauma and high sugar diet on the basis of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma models which were established by particle implantation of the tumor tissue. The model rabbits were divided into 3 groups(n=6). In group A the rabbits with buccal VX-2 squamous cell carcinoma and local inflammation were given antibiotics by gavage and intramuscular injection for 3 consecutive days; the rabbits in group B with buccal VX-2 squamous cell carcinoma and local inflammation were given normal saline by gavage and intramuscular injection; the rabbits in group C with tumor and without inflammation were given normal saline by gavage and intramuscular injection.The tumor specimens were collected 3 days after treatment, and made into tissue homogenate, supernatant was collected after centrifugation.Normal rabbit peripheral blood mononuclear cells were separated and co-cultured with the supernatant obtained from the 3 groups respectively. Expressions of DCs surface markers HLA-DR,CD83 and CD86 were detected by flow cytometry. the function of DCs was tested by mixed lymphocyte reaction.ResultsThe positive rate of HLA-DR,CD83,CD86 and stimulate index were group C>group A>group B(P<0.05).ConclusionAntimicrobial therapy can promote the maturation and function of DCs in the infected microenvironment of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma.

Antimicrobialtherapy;Inflammation;VX-2squamouscellcarcinoma;Dendriticcells

貴州省科學技術基金(編號： 黔科合J字LKZ[2013]36號，黔科合J字LKZ[2011]23號)； 遵義市紅花崗區科學技術局項目(編號： 遵紅科合社字[2015]09號)； 貴州省研究生工作站項目(編號： 黔教研合YJSZ字[2013]08)

550002 貴陽， 貴州省人民醫院口腔科(陳志紅)； 遵義醫學院附屬口腔醫院口腔頜面外科(易杰 黃桂林 張霓霓 姚禮 張立剛)

黃桂林 E-mail: chaojiehuanghgl@163.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.005

(收稿： 2016-11-28 修回： 2017-04-25)