胰島素和小檗堿對Ⅱ型糖尿病大鼠鈦種植體骨整合的影響

朱文忠 張春寶 越野 宋鑫磊

胰島素和小檗堿對Ⅱ型糖尿病大鼠鈦種植體骨整合的影響

朱文忠 張春寶 越野 宋鑫磊

目的研究胰島素和小檗堿對Ⅱ型糖尿病大鼠種植體骨整合的影響。方法53 只SD大鼠，隨機抽取10 只，分入H組(健康組)。剩余大鼠利用高糖飲食+小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導，獲得Ⅱ型糖尿病模型大鼠共40 只，隨機等分為B組(小檗堿組)、I組(胰島素組)、IB組(胰島素+小檗堿組)和N組(未治療組)。將100 枚純鈦種植體植入大鼠雙側股骨干骺端。第7、32、38、66和101天測量大鼠的體重(BW)和空腹血糖值(GLU)。術后10 周，取大鼠股骨行Micro-CT掃描、VG染色及種植體拔出實驗。觀察硬組織切片；測量骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨小梁容積率(TBV)、骨接觸率(BIC)及最大拔出力(MPF)。結果BW和GLU：IB組和H組間無顯著的統計學差異(P>0.05)；但IB組顯著優于I組和B組；I組和B組優于N組(P<0.05)。骨質(BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp)和骨整合(TBV、BIC、MPF)：IB組和H組間無顯著的統計學差異(P>0.05)；但IB組優于I組和B組；I組和B組優于N組(P<0.05)。結論胰島素和小檗堿聯用可有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖，并促進種植體的骨整合。

糖尿病； 胰島素； 小檗堿； 骨整合； 種植體

糖尿病是以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病，累及全身臟器，伴發多種并發癥[1]。其中，Ⅱ型糖尿病最為常見，常并發牙周炎癥，造成牙列缺損或缺失[2]，亟需種植修復。大量實踐表明，糖尿病患者相較于非糖尿病患者，種植體骨整合更差，種植體成功率也更低[3]。隨著種植技術的發展和胰島素的廣泛使用，種植體的骨整合得到了改善，但糖尿病仍是種植修復最為重要的危險因素之一。如何進一步提高其骨整合能力和種植成功率，成為臨床醫生亟需解決的問題。

小檗堿是從毛茛科植物黃連根莖中提取的異喹啉生物堿，主要用于治療細菌性腹瀉。研究表明，小檗堿還具有緩解胰島素抵抗、降血糖以及預防骨質疏松的作用[4]。因此，本實驗擬通過構建Ⅱ型糖尿病大鼠模型，研究胰島素和小檗堿對于種植體骨整合的影響。

1 材料與方法

1.1 Ⅱ型糖尿病SD大鼠模型的建立

第四軍醫大學實驗動物中心提供健康SD大鼠53 只，6 月齡，體重約為200～225 g。常規飼料馴養1 周后，隨機抽取10 只編入H組(健康組)。剩余大鼠，采用高糖飼料(瑞林,鄭州)連續喂養3 周。使用2%STZ(30 mg/kg,Sigma公司,美國)一次性腹腔注射。3 d后，血糖儀(家康,BGM506,日本)測定空腹血糖(GLU)。將GLU≥16.7 mmol/L定義為Ⅱ型糖尿病模型大鼠。本實驗共成功獲得模型大鼠40 只，3 只失敗(死亡1 只，血糖不合格2 只)。同時，H組腹腔注射相同劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)。

1.2 動物分組、種植體植入及藥物治療

隨機數字表法將模型大鼠等分為4 組：N組(糖尿病+未治療)、I組(糖尿病+胰島素)、B組(糖尿病+小檗堿)和IB組(糖尿病+胰島素+小檗堿)。

2%戊巴比妥鈉(2.5 ml/kg)腹腔注射麻醉，備皮消毒。在大鼠雙側下肢股骨頭處向股骨方向做長約1 cm切口，鈍性分離肌肉、骨膜。按照標準種植程序將自制純鈦種植體(1.75 mm×5 mm,圖 1)垂直于骨面植入股骨干骺端(圖 1)。術后連續注射慶大霉素(6 mg/kg，2 次/d)3 d。

圖 1 純鈦種植體及種植體植入

根據文獻報道，I組和IB組給以1-2 U NPH胰島素[5](中效優泌林 禮來，法國)；B組和IB組給以300 mg/kg，1次/d的黃連素[6](中國藥品生物制品檢定所)灌胃；H組和N組則給以等劑量生理鹽水灌胃。連續給藥10 周，處死所有大鼠，取樣檢測。

1.3 檢測BW和GLU

分別于(馴養后)第7天、(造模+種植手術后1 d)第32天、(術后1 周)第38天、(術后5 周)第66天和(術后10 周)第101天測量所有大鼠體重(BW)；通過尾靜脈采血，測定GLU。

1.4 Micro-CT掃描分析

仔細想想，這種歇斯底里應該還是主導的。那個暑假我翻滾沉思，表情如同被人欠了二十萬未索回。以至于最后我媽看不下去我吃飯時都端著碗皺著眉毛的樣子了，強行把我丟出去給初中孩子做家教。

取處死大鼠的雙側股骨，剝離清理軟組織。左側股骨標本，截取種植體周圍1 cm范圍的骨塊，甲醛固定2 d。使用Micro-CT(SIEMENS，德國)掃描。利用Inveon Acquisition Workplace 2.2軟件，重建距種植體表面和底端分別為0.5 mm和1 mm的區域，測定骨形態學參數BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp(圖 2)。

圖 2 Micro-CT三維重建與分析

1.5 骨標本的VG染色

CT掃描后，骨標本經脫水干燥、塑化包埋，使用硬組織切片機(Leica SP 1600，Leica，德國)切片、打磨、拋光。使用Weigert氏鐵蘇木素和Van Gieson氏染液染色并脫水，密封固定。在光學顯微鏡(Olympus BH2日本)下，觀察植體骨整合情況及植體周圍骨小梁結構。通過數字化圖像分析系統(Leica Imaging System，Cambridge, 英國)，獲得形態學指標TBV和BIC。

1.6 測定MPF

取右側股骨標本，修整成塊，自凝塑料包埋，使用電子萬能試驗機(Instron 5848，英斯特朗，美國)沿種植體長軸方向以2 mm/min的速度將種植體拔出，測定最大拔出力(MPF)值。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 體重及血糖水平

表 1 5 組不同時間點大鼠體重和空腹血糖值

2.2 Micro-CT掃描結果

術后10 周，H組和給藥組各組骨形態參數均優于N組(P<0.05)；IB組相較于H組，各組參數無顯著的統計學差異(P>0.05)；在BV/TV、Tb.Th和Tb.N三方面，IB組>I組>B組(P<0.05)。在Tb.Sp方面，則是B組>I組>IB組(P<0.05)(表 2)。

2.3 VG染色結果

術后10 周，H組和IB組植體螺紋間充滿骨組織，骨與植體間緊密結合，無纖維組織，骨整合良好。N組植體與骨組織間主要發生纖維結合，骨整合較少。I組和B組介于兩者之間，骨組織和植體間發生部分骨整合，仍有部分纖維結締組織和紅細胞充填其中(圖 3)。BIC和TBV方面，H組和IB組間無顯著的統計學差異(P>0.05)；I組>B組>N組，且有顯著的統計學差異(P<0.05)(表 3)。

2.4 比較MPF

表 2 種植術后10周各組植體周圍骨形態計量學參數

圖 3 種植術后10 周各組VG染色切片觀察

術后10 周，H組和IB組間MPF無顯著的統計學差異(P>0.05)；I組>B組>N組，且有顯著的統計學差異(P<0.05)(表 3)。

表 3 種植術后10 周各組BIC、TBV和MPF比較

Tab 3 Comparison of BIC, TBV and MPF in the 5 groups 10 weeks after implantation

分組BIC(%)TBV(%)MPF(N)H組63.13±9.2757.31±4.59103.45±15.64N組34.68±10.6531.36±6.4554.39±19.26B組45.71±13.2942.61±5.1773.01±14.32I組50.72±9.8649.72±4.6183.42±18.56IB組64.30±10.1156.84±5.3499.89±16.79

3 討 論

常用于種植研究的動物模型有大鼠股骨模型、兔股[7]/脛[8]骨模型，以及犬頜骨模型。本實驗選取大鼠股骨干垢端作為植入位點。主要原因是：①其骨組織結構與牙槽骨組織類似，有完整豐富的松質骨骨小梁結構，是常用的植入位點；②在糖尿病的作用下，大鼠股骨也能像頜骨一樣呈現出類似的骨質疏松的癥狀。

胰島素是治療糖尿病的特效藥，但本實驗結果顯示，胰島素(I組)并未使得GLU及骨整合恢復至正常水平，提示單純使用胰島素并不能完全改善糖尿病的這些癥狀，這與前人的研究結果一致[9]。這可能與Ⅱ型糖尿病導致的高胰島素血癥及胰島素抵抗有關，體細胞因缺乏胰島素相關的信號轉導而導致對胰島素的利用效能降低。另一方面，單純使用小檗堿雖也可以降低GLU，改善骨質及骨整合狀況，但也并不能完全改善這些癥狀。究其原因，可能是因為小檗堿只能改善胰島素抵抗，但并不能改變因胰島B細胞受損而導致的胰島素分泌量的絕對不足。

IB組(胰島素+小檗堿)無論是GLU、BW、MPF及骨整合等多項指標均接近H組(P<0.05)，且顯著高于I組及B組。說明小檗堿和胰島素的聯用，對血糖的控制和骨整合狀況的改善有疊加效果。原因可能有以下幾點：①胰島素的使用，可以彌補因胰島受損引起的胰島素含量的不足，從而有效控制血糖，降低高血糖毒性；②小檗堿可有效緩解胰島素抵抗，增強胰島素的敏感性，從而控制血糖，降低鈣磷等礦物質的流失[10]；③小檗堿可以通過促進成骨細胞的分化，改善骨整合[11]。

4 結 論

胰島素和小檗堿兩者擁有不同的藥理作用，胰島素補充了糖尿病大鼠體內胰島素的絕對缺乏，小檗堿則改善了其胰島素抵抗，兩者聯用，藥效互補，對Ⅱ型糖尿病血糖的控制及骨整合的改善有相互疊加的作用。但小檗堿影響骨整合的分子機制尚未完全明了，還需在今后的實驗中進行深入研究。

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TheeffectsofinsulinandberberineontheosseointegrationoftitaniumimplantintypeIIdiabeticrats

ZHUWenzhong1,ZHANGChunbao2,YUEYe2,SONGXinlei3.

1. 710005Xi'an,DepartmentofStomatology,theSecondPeople'sHospitalofShaanxiProvince,China； 2.StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology&NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases&ShaanxiKeyLaboratoryofStomatology,DentalLaboratory,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an； 3.NavyOverseasSnailHospitalDepartmentofStomatology,Zhoushan

Objective: To study the effects of insulin and berberine on osseointegration of titanium implant in type II diabetic rats.Methods10 out of 53 SD rats were randomly selected and selected into H group(healthy group)(n=10). The remaining rats were treated with high glucose diet plus low dose of streptozotocin(STZ) and 40 rats were induced into the models of type II diabeties. The 40 dibetic rats were randomly divided into group B(berberine), group I(insulin), group IB(insulin+berberine) and group N(without treatment). 2 pure titanium implants were implanted into the bilateral femoral metaphysis of each rat. After 7, 32, 38, 66 and 101 d, the body weight(BW) and fasting blood glucose(GLU) were measured. After 10 week, the rats were sacrifice, femoral metaphysis samples were subjected to Micro-CT scan, VG staining and implant pull-out test. Hard tissue slices were observed; bone volume fraction(BV/TV), Liang Houdu(Tb.Th), trabecular bone trabecular number(Tb.N), Liang Jianxi(Tb.Sp), trabecular bone trabecular bone volume(TBV), bone contact ratio(BIC) and the maximum pull-out strength(MPF) were measured.ResultsThere was no significant difference of BW and GLU between IB group and H group(P>0.05), but the BW and GLU of IB group was better than those of I group and B group, I group and B group were better than those of group N(P<0.05).BV/TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp, TBV, BIC and MPF of IB group were not statistically different from those of H group(P>0.05); but the indexes of IB group were higher than those of I group and B group, those of I group and B group were higher than those of N group(P<0.05).ConclusionThe combination of insulin and berberine can effectively reduce blood glucose and can promote osseointegration of titanium implants in type II diabetic rats.

Diabetes;Insulin;Berberine;Osseointegration;Implant

710005 西安， 陜西省第二人民醫院口腔科(朱文忠)； 軍事口腔醫學國家重點實驗室， 口腔疾病國家臨床醫學研究中心， 陜西省口腔醫學重點實驗室， 第四軍醫大學口腔醫院修復工藝中心(張春寶 越野)； 海軍外洋螺醫院口腔科(宋鑫磊)

張春寶 029-84776455

R783.3

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.007

(收稿： 2017-02-27 修回： 2017-05-23)