OPG、RANKL在2型糖尿病伴牙周炎大鼠牙槽骨中的表達

鐘雯怡 楊琨 高麗 楊孟雪 向文安 劉琪

OPG、RANKL在2型糖尿病伴牙周炎大鼠牙槽骨中的表達

鐘雯怡 楊琨 高麗 楊孟雪 向文安 劉琪

目的探討骨保護素(OPG)和核因子κB受體活化因子(RANKL)在2型糖尿病伴牙周炎大鼠模型中的表達水平。方法46 只Wistar雄性大鼠，隨機分為健康組10 只；單純牙周炎組12 只；2型糖尿病組12 只；2型糖尿病牙周炎組12 只；分別建模，免疫組織化學方法檢測牙槽骨OPG、RANKL蛋白表達。結果與健康組相比， OPG在2型糖尿病組、單純牙周炎組、2型糖尿病伴牙周炎組表達水平依次降低，RANKL的表達水平依次增強；OPG及RANKL的表達除2型糖尿病牙周炎組與單純牙周炎組間比較無差異外，其余組間比較有統計學意義(P<0.05)。結論炎癥可能導致破骨細胞及免疫細胞中RANKL的上調和成骨細胞中OPG的下調。

牙周炎； 2型糖尿病； 2型糖尿病伴牙周炎大鼠； κB 受體活化子; 骨保護素

牙周病和糖尿病都是慢性疾病，牙槽骨丟失是牙周炎的主要癥狀，與糖尿病關聯的重要并發癥是骨代謝的改變。糖尿病又是牙周疾病主要的危險因素[1]。牙周病原菌的炎性反應可造成牙槽骨吸收，全身性疾病可影響宿主反應，比如1、2型糖尿病，能加重牙周疾病的嚴重性和加速骨吸收[2]。實驗證實在糖尿病鼠模型，上調的TNF-α、巨噬細胞集落刺激因子、RANKL、血管內皮細胞生長因子A會促進破骨細胞分化和活化[3-4]；糖尿病也會以不同方式影響牙周組織的破骨細胞和成骨細胞，如增加炎性介質的表達和上調RANKL/OPG及增加AGEs和ROS[5]。破骨細胞表面的RANKL 和受體RANK的相互作用能有效的誘導破骨細胞的形成和活性。OPG與RANK的結合抑制了破骨細胞形成阻止了RANKL的活性[6]。本研究基于OPG/RANKL/RANK軸對骨質形成調控的生物學基礎，檢測了OPG、RANKL在不同模型組動物牙槽骨中的表達情況，為牙槽骨再生及重塑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：超純水儀(MILLIPAK,法國)，離心機(KDC-20447低速冷凍,科大中佳分公司)，倒置顯微鏡及照相系統(TMS-1015型,Olypus,日本)。

主要試劑：鏈脲佐菌素(STZ)及免疫組化SP試劑盒(Sigma 公司,美國)，SABC 兔IgG KIT (北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 46 只6 周齡Wistar雄性大鼠，平均體重196.5 g，來源于第三軍醫大學動物實驗中心。隨機分為10 只健康組、12 只單純牙周炎組、12 只2型糖尿病組、12 只2型糖尿病牙周炎組。本實驗通過遵義醫學院倫理委員會許可。

1.2.2 建模 ①健康組以普通飼料喂養；②12 只牙周炎組用0.25 mm結扎絲結扎其上頜第二磨牙牙頸部, 術后高糖喂養8 周；③12 只2型糖尿病組以高糖高脂飼料喂養6 周后禁食12 h，腹腔低劑量鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg注射，4 d后采尾部血測空腹血糖值>11.8 mmol/L，隨機血糖>16.8 mmol/L，葡萄糖耐量實驗均高于正常血糖值為建模成功；④12 只2型糖尿病伴有牙周炎大鼠組用0.25 mm結扎絲結扎在上頜第二磨牙牙頸部,術后高糖高脂飼料喂養6 周后禁食12 h，注射腹腔低劑量STZ 1 次，4 d后采尾部血，大鼠空腹血糖值>11.8 mmol/L的繼續喂養2周，測空腹血糖穩定在11.8 mmol/L以上，隨機血糖>16 mmol/L，葡萄糖耐量實驗均高于正常血糖濃度值做為模型成功標準。

1.2.3 制作標本 取大鼠上頜牙槽骨4%甲醛固定，10%EDTA脫鈣，常規乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片備用。

采用HE染色觀察各組大鼠牙槽骨的變化。

1.2.4 免疫組化法檢測 PBS代替一抗作為陰性對照。按試劑盒操作說明檢測牙槽骨OPG、RANKL的蛋白表達。全自動彩色圖像分析系統(IPWIN60型,MEDIA CYBERNETICS公司,美國)進行圖像分析。每個標本隨機選取2 張切片，每張切片于第二磨牙牙槽骨近遠中區隨機取4 個視野分析(×400)，每個視野內截取區域測量陽性信號的強度然后計算平均光密度值。

平均光密度=積分光密度/測量面積

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 建模情況

健康組(N)：大鼠牙周情況很好。牙周炎組(P)：牙齦出現不同程度炎癥反應，牙齦紅腫、探診出血、探及牙周袋，牙齒松動>2度、可探及上頜第二磨牙根分叉。2型糖尿病組(D)：探診出血，未探及牙周袋和附著喪失，牙周狀況良好。 2型糖尿病伴牙周炎組(PD)：與單純牙周炎組相比牙齦炎癥較重，牙齒松動度>2度，表現為重度牙周炎。

2.2 2型糖尿病組

6 周高脂高糖飼料喂養糖尿病組大鼠體重明顯增加,出現三多一少癥狀，與非糖尿病大鼠比較差異有統計學意義。糖尿病組STZ注射2 周后，進食量增多而體重明顯減輕，差異有顯著性(表 1)。

Tab 1 The body weight of the rats in the 2 groups(±s,n=10)

注： ①P<0.01

Tab 2 FPG and RBG of the rats in the 2 groups(±s,n=10)

注： ①P<0.01

注射2 周鏈脲佐菌素后，糖尿病組大鼠隨機及空腹血糖顯著高于非糖尿病組大鼠并且血糖能較穩定的維持在較高濃度水平。2 組差異有統計學意義(表 2)。

2.3 牙槽骨吸收情況觀察

2型糖尿病大鼠牙槽骨邊緣見到活躍的破骨細胞性骨吸收陷窩。牙周炎大鼠牙槽骨吸收至根尖1/3處，牙周袋形成，附著喪失很明顯(圖 1)。

2.4 各組大鼠牙槽骨中OPG、RANKL的蛋白表達

健康大鼠OPG陽性表達集中在大鼠牙槽骨骨細胞中，胞膜、胞質及核膜都被染色呈棕黃色顆粒狀,表達細胞量最多且染色最深。其余3組較健康大鼠均有不同程度的減弱，而2型糖尿病伴牙周炎組大鼠表達細胞量最少且染色程度最弱(圖 2)。

圖 1 4 組大鼠牙槽骨組織學變化(HE， A，C： ×400； B，D： ×200)

Fig 1 The histological changes of rat alveolar bone in the 4 experimental groups(HE， A，C： ×400； B，D： ×200)

圖 2 OPG在4 組大鼠牙槽骨中的表達(IHC， A～D： ×200； E～H： ×400)

Fig 2 The expression of OPG in alveolar bone of rats in the 4 groups(IHC， A-D： ×200； E-H： ×400)

RANKL的陽性表達集中在大鼠牙槽骨骨髓基質細胞中，胞膜、胞質及核膜都被染色，呈棕黃色顆粒狀。與健康組大鼠RANKL表達呈弱陽性相比，糖尿病合并牙周炎與單純牙周炎組RANKL表達細胞量最多且染色程度最深(圖 3)。各組間OPG、RANKL平均光密度值的單因素方差分析，N與P、D、PD相比差異有統計學意義；P與D、D與PD差異有統計學意義(P<0.01)；P與PD差異無統計學意義(P>0.05)(表 3)。

圖 3 RANKL在4 組大鼠牙槽骨中的表達(IHC， A～D： ×200； E～H： ×400)

Fig 3 The expression of RANKL in alveolar bone of rats in the 4 groups(IHC， A-D： ×200； E-H： ×400)

表 3 4 組大鼠牙槽骨中OPG、RANKL平均吸光度值(n=10)

Tab 3 A of OPG and RANKL expression in the alveolar bone in the 4 groups (n=10)

3 討 論

RANKL-OPG雙分子系統是一個在生理和病理條件下調節破骨細胞生成和骨吸收的關鍵[7]。破骨細胞活化引起的骨破壞以RANKL、RANK、OPG為信號，RANKL和RANK結合，破骨細胞和破骨細胞前體細胞表面受體刺激細胞的增殖和分化形成破骨細胞表型[8]。破骨細胞及很多細胞產生的OPG，通過抑制RANKL/RANK的結合改變了RANKL的效果[9]。骨丟失作為RANKL/OPG升高的結果，RANKL/OPG升高是因為RANK升高或OPG降低，或兩者都有。

牙槽骨破壞是牙周炎最主要的診斷特征，宿主反應在牙周炎的發病機制里被證實，免疫應答在牙槽骨破壞中起了非常重要的作用證明了免疫系統和骨代謝的緊密關系。研究證實與慢性牙周炎個體相比，OPG在健康個體齦溝液、唾液和牙齦組織中的含量顯著增高[10-11]，與課題組前期研究一致[12]。本實驗證實了與健康組相比，3 組大鼠的OPG、RANKL蛋白表達有顯著差異，單純糖尿病與牙周炎和糖尿病性牙周炎相比差異也有顯著性，而牙周炎與糖尿病性牙周炎相比差異沒有顯著性。說明炎癥環境，免疫應答對RANKL-OPG系統的作用會影響骨的吸收。吸煙被認為是牙周炎的危險因素之一，研究證實無論吸煙是否通過RANKL-OPG系統影響骨的吸收，慢性牙周炎的RANKL/OPG率高于健康對照組[13]與本實驗結果一致。在炎性環境中，活化淋巴細胞成為RANKL的來源[14]，RANKL在炎性環境中增多，OPG的減少導致RANKL/OPG率增高，增高的RANKL/OPG率與骨吸收和動脈粥樣硬化相關[15]。重組人骨保護素能調節牙周炎大鼠牙槽骨RANKL/OPG的表達，外源性的注入為牙槽骨的修復提供思路[17]。

糖尿病是一組全身多發紊亂伴隨著高血糖的疾病，2型糖尿病提高了線粒體活性氧的水平促進RANKL調解的破骨細胞分化和功能，提高對M-CSF 和RANKL應答的破骨細胞的形成[16-18]。體外實驗中高血糖會促進破骨細胞形成，AGEs增加破骨細胞活性[19]。

控制糖尿病和炎癥利于牙槽骨的形成及牙周組織的健康。

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OPGandRANKLexpressioninalveolarboneoftype2diabeticratswithperiodontitis

ZHONGWenyi1,YANGKun1，GAOLi1，YANGMengxue2，XIANGWen’an3，LIUQi2.

1. 563003,DepartmentofPediatricandPreventiveDentistry,HospitalofStomatology,ZunyiMedicalCollege,China； 2.ThefirstAffiliatedHosptialofZunyiMedicalCollege,China； 3.Zheng’anCountyTraditionalChineseMedicineHospital

Objective: To investigate the expression of osteoprotegerin(OPG) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL) in type 2 diabetic rats with periodontitis.Methods46 male Wistar rats were randomly divided into the healthy group(n=10), the periodontitis group(n=12), the type 2 diabetes mellitus group(n=12) and the type 2 diabetic periodontitis group(n=12). Animal models were prepared respectively. The expression of OPG and RANKL protein in alveolar bone was detected by immunohistochemistry(IHC).ResultsCompared with the healthy group, the expression of OPG in the type 2 diabetes mellitus group, the periodontitis group, the type 2 diabetes mellitus with periodontitis group decreased in turn, however the expression of RANKL increased in turn. The expression of OPG and RANKL had no significant difference between periodontitis group and type 2 diabetes periodontitis group, while there was statistically significant difference among the other groups(P<0.05).ConclusionInflammation may lead to upregulation of RANKL in osteoclasts and immune cells, and downregulation of OPG in osteoblasts.

Periodontitis;Type2diabetesmellitus;Type2diabeticratswithperiodontitis;Receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand;Osteoprotegerin

貴州省科學技術基金(編號： 黔科合LH【2014】7596號)； 貴州省衛生廳科技項目[編號： 黔衛發(2012)84號]； 遵義市科技局[編號： 遵市科合社字(2013)31號]

563003， 遵義醫學院附屬口腔醫院預防兒童牙科(鐘雯怡 楊琨 高麗)； 遵義醫學院附屬醫院(楊孟雪 劉琪)； 遵義市正安縣中醫院(向文安)

劉琪 E-mail: Liuqi1964@hotmail.com

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.008

(收稿： 2017-03-13 修回： 2017-06-14)