基于定向進化技術提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性

邵澤香，焦琳舒，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

基于定向進化技術提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性

邵澤香，焦琳舒，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

為提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性，通過定向進化技術對其進行分子改造。經過兩輪易錯聚合酶鏈式反應和一輪DNA shuffling，從19 100多個突變株中篩選到突變體S10、S16和S21，其酶比活力較野生型分別提高了106%、74%和43%，且突變酶Kcat/Km都有所增大。其中，突變體S10氨基酸序列發生3 個突變，K 43E、N67S和I269L。三維模擬結果顯示，第43位氨基酸突變為谷氨酸、第67位氨基酸突變為絲氨酸，可能提高了底物親和力和催化效率，從而提高酶活性。圓二色譜分析表明，相比野生酶，突變酶的α-螺旋數減少、無規則卷曲有所增加，表明其剛性略有降低，柔性有所增加。利用定向進化策略能夠有效地提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性。

L-天冬酰胺酶；定向進化；酶活性

L-天冬酰胺酶Ⅱ（L-asparaginaseⅡ，EC3.5.1.1）可以催化L-天冬酰胺脫氨基轉化成L-天冬氨酸和氨。近幾年研究發現，L-天冬酰胺酶可以減少熱加工食品中致癌物——丙烯酰胺的形成[1-5]，而丙烯酰胺是由天冬酰胺和還原糖（果糖和葡萄糖）經美拉德反應生成[6]。采用L-天冬酰胺酶去除原料中的天冬酰胺是目前用于控制高熱加工食品中丙烯酰胺含量最有效的方法。同時，對生產工藝、產品外觀、風味以及營養等方面沒有任何改變[7-8]。但目前L-天冬酰胺酶普遍存在穩定性差、酶活性低等問題，難以滿足食品預處理的復雜環境要求。

蛋白質工程是用于克服天然酶在工業應用過程中缺陷的重要手段[9]，通常蛋白質工程策略主要包括理性設計和非理性設計（定向進化）等[10]。目前國內外關于L-天冬酰胺酶分子改造方面的研究主要集中于理性設計，如Sudhir等[11]對地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶進行定點突變使得氨基酸D103V發生變化；Long Shuiqing等[12]通過定點突變改變了枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶氨基酸G107D，定點突變后的突變酶，催化活力和熱穩定性均得到提高。而有關L-天冬酰胺酶的定向進化研究報道甚少。

本實驗室在前期研究中發現地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性很低，限制其在食品工業中的廣泛應用。為提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性，本研究采用易錯聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術與DNA shuffling相結合的方法，對地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶進行分子改造，以期獲得酶活性顯著提高的突變體，為工業化生產L-天冬酰胺酶提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pET30a（+）-BliansZ重組質粒由南京農業大學酶工程實驗室構建。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

限制性內切酶SacⅠ與XhoⅠ 大連寶生物公司；2×Taq PCR M ixture、卡納青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JY 98-Ⅲ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝科學儀器研究所；5840R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；PTC-100TMPCR儀 美國MJ Research公司；PowPacTM高電流電泳儀 美國Bio-Rad有限公司；JS-380C全自動數碼凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 易錯PCR突變文庫構建

以p ET 30a（+）-B liansZ重組質粒為模板，使用含有SacⅠ酶切位點（下劃線）的上游引物（5’-CGAGCTCATGACGAAAAAACGAATG-3’）和含有XhoⅠ酶切位點（下劃線）的下游引物（5’-CCGCTCG AGTCAATATTCTTCAAAATAGG-3’）進行易錯隨機誘變。易錯PCR誘變體系為：0.2 mmol/L dCTP、dTTP，3/5/7mmol/L Mg2+，0.05mmol/L Mn2+，上下游引物各2.0μL，DNA模板1.0μL，2×Taq PCR M ix 25.0μL，ddH2O補足50.0μL。將第1輪PCR的有益突變質粒作為模板，進行第2輪易錯PCR。易錯PCR程序：94℃預變性3 m in，94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 m in，30個循環，72℃延伸10 m in。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，并使用DNA凝膠回收試劑盒進行純化。純化的PCR產物用SacⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，酶切后回收目的片段與pET-30a表達載體進行重組。將重組產物轉入大腸桿菌BL21（DE3），構建隨機誘變文庫。

1.3.2 DNA shuffl ing突變文庫構建

以易錯PCR突變文庫篩選獲得酶活性最高的4個突變體基因為模板，使用Pfu聚合酶進行擴增。將等濃度的親本DNA片段混合并用DNaseⅠ消化。消化條件為：DNaseⅠ酶0.000 4 U/μL、37 ℃消化10m in。消化完成后90 ℃加熱15 m in終止消化反應。使用2%瓊脂糖凝膠電泳驗證，參考易錯PCR純化方法回收大小為50～100 bp的片段。將50～100 bp片段進行無引物PCR擴增，反應體系組成為25μL 50～100 bp膠回收片段，25μL 2×Taq PCR M ixture緩沖液。無引物PCR擴增程序為：94℃預變性3 m in，94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，40個循環后，72 ℃延伸10 m in。再以無引物PCR純化產物作為模板，使用1.3.1節引物擴增全長基因，建立突變文庫。

1.3.3 突變體文庫的高通量篩選

參考Guo Fangfang等[13]建立的重組大腸桿菌產脂肪氧合酶高通量篩選方法，稍作修改。高通量篩選方法：從LB-卡納青霉素平板上挑取單菌落，接種到96孔板，每孔含有600 μL LB（50 μg/m L卡納青霉素）培養基，以BlansZ作為陽性對照；37 ℃、200 r/m in培養12 h后，將20 μL菌液接種到另一含有600 μL LB（50 μg/m L卡納青霉素）培養基中；37 ℃、200 r/m in培養至OD600nm達到0.6，加入IPTG使終質量濃度為60 μg/m L；16 ℃、200 r/m in培養16 h。離心收集菌體，50 μL質量濃度為1.5 m g/m L的溶菌酶緩沖液重懸，37 ℃水浴30 m in，-70 ℃冷凍30 m in，37 ℃溶解20 m in，反復凍融3 次破碎細胞，離心后上清液即為粗酶液。通過96 孔板高通量篩選獲得酶活性提高的突變體進行搖瓶發酵復篩，以確定酶活性提高的突變體。

1.3.4 酶的表達和純化

將重組菌單菌落接種在LB培養基（50 μg/m L卡納青霉素）中培養10 h，按照1%的接種量轉接。培養至OD600nm達到0.6時，加入IPTG使終質量濃度至100 μg/m L，16 ℃誘導16 h。離心收集菌體，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）重懸，超聲破碎。破碎液離心后上清液即粗酶液。重組L-天冬酰胺酶含有組氨酸標簽，使用鎳柱親和層析對野生型和突變體酶進行純化。純化后的蛋白用Bradford法測定蛋白質濃度[14]，純酶使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析和進行酶學性質研究。

1.3.5 酶活性的測定

參照Pradhan等[15]的方法。向700 μL磷酸鹽緩沖液中加入100 μL 189 mmol/L L-天冬酰胺底物溶液和100 μL粗酶液，37 ℃水浴反應25 m in，加入100μL 1.5 mol/L三氯乙酸終止反應。12 000 r/m in離心2m in，取30 μL上清液加入到2.67 m L蒸餾水和300 μL納氏試劑中，混勻，室溫靜置10 m in，測定436 nm波長處的吸光度。空白對照為先加入三氯乙酸終止反應，再進行后續的水浴處理。酶活力單位定義：在酶反應條件下，單位時間內產生1 μmol/L NH3所需的酶量為1 個酶活力單位。

1.3.6 酶學性質分析

1.3.6.1 酶的最適溫度及溫度穩定性

最適反應溫度測定：將酶液置于25～50 ℃范圍內進行酶促反應，測定酶活性。溫度穩定性測定：將酶液置于50 ℃熱處理8 h，間隔2 h取樣，以處理0 h酶活性作為100%，測定殘余酶活性。每次反應均在同等條件下設置3 個平行，去掉空白后以平均值為此條件下的酶活性。

1.3.6.2 酶的最適pH值及pH值穩定性

最適反應pH值測定：將酶液置于pH 4～10范圍內，測定酶活性。pH值穩定性測定：將酶液置于pH 4～11范圍內處理酶液12 h，以處理0 h酶活性作為100%，測定殘余酶活性。

1.3.6.3 酶動力學參數的測定

以0.5～5 mmol/L L-天冬酰胺為底物，加入過量的純酶液，置于最適條件下反應，測定L-天冬酰胺酶活性，通過Lineweaver-Burk作圖法計算獲得Km和Kcat值。

1.3.6.4 三維結構模擬及分析

將野生型氨基酸序列提交到SW ISS-MODEL服務器得到其三維結構。利用PYMOL軟件分析氨基酸殘基間氫鍵相互作用和突變位點對蛋白質二級結構的影響。

1.3.6.5 突變酶圓二色譜分析

將純化的野生型酶和突變酶溶解在10 mmol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 8.0）中，在190～250 nm波長范圍內進行掃描。蛋白質質量濃度為100 μg/m L，以緩沖液10 mmol/L PBS（pH 8.0）用作空白，分析野生型酶及突變酶蛋白質二級結構的變化情況。

2 結果與分析

2.1 突變文庫高通量篩選

經兩輪易錯PCR，構建突變文庫庫容量約12 600，獲得6株酶活性提高的突變體，結果見表1。由表1可知，最佳突變體F5A11，酶活性是野生型酶活性的2.26倍，其氨基酸序列有4個位點發生突變，分別為K42E、N67S、M 92V、V137I。

表1 野生型酶和易錯PCR突變酶活性和氨基酸突變Table 1 L-asparaginase activity of the w ild-type strain and mutants generated from epPCR

以酶活性提高最多的突變體F5A 11、B7B3、F5G3和A 1D11重組質粒作為模板進行DNA shuffling，構建含有6 500 個突變體的突變文庫，獲得3 株酶活性顯著提高的突變體，結果見表2。最佳突變酶S10，比活力為（306.59±3.21）IU/mg，比野生型酶提高106%。此突變體只發生3 個氨基酸突變，K43E、N67S和I269L。

表2 野生型酶和DNA shuffl ing突變酶活性及氨基酸突變Table 2 L-asparaginase activity and the w ild-type strain and mutants generated from DNA shuffl ing

2.2 純化酶的SDS-PAGE分析

將野生型酶和突變酶表達純化后，通過SDS-PAGE分析，結果見圖1。蛋白目的條帶均在46 kD左右，與理論值相符。

圖1 SDS-PAGE檢測結果Fig. 1 SDS-PAGE electrophoresis of w ild-type and mutant enzymes

2.3 酶學性質分析

2.3.1 酶的最適溫度及溫度穩定性

將野生酶與突變酶純酶液分別置于25～50 ℃條件下，測定酶活性，結果如圖2所示。S10和S16的最適反應溫度與野生酶相同，S21最適反應溫度為45 ℃，高于野生型最適溫度5 ℃。

圖2 野生型酶和突變酶最適反應溫度Fig. 2 Effects of temperature on the activity of wild-type and mutant enzymes

將野生酶與突變酶純酶液置于50 ℃進行溫度穩定性研究，結果見表3。突變酶S16和S21在50 ℃半衰期分別為9.35 h和19.12 h，分別較野生型縮短11.97 h和2.2 h，表明突變酶S16和S21的溫度穩定性有所降低。突變酶S10半衰期為23.27 h，較野生型延長1.95 h，表明其溫度穩定性在突變前后無較大變化。

表3 野生型酶和突變酶熱穩定性Tab le 3 Thermal stability of w ild-type and mutant enzymes

2.3.2 酶的最適pH值及pH值穩定性

將野生酶與突變酶液分別置于pH 4.0～10.0的緩沖液中，測定L-天冬酰胺酶活性，結果如圖3所示。突變酶S10和S21與野生型酶最適反應pH值相同，而突變酶S16在pH 9.0時表現出最高酶活性。

圖3 野生型酶和突變酶最適反應pH值Fig. 3 Effect of pH on the activity of w ild-type and mutant enzymes

野生酶與突變酶液在pH 4.0～11.0的緩沖液處理12 h后，相對酶活性如圖4所示。在弱堿性環境范圍內突變酶S10和S21均具有較高的相對酶活性，表明其具有良好的穩定性，能夠更好地應用于食品加工環境。

圖4 野生型酶和突變酶pH值穩定性Fig. 4 pH stability of w ild-type and mutant enzymes

2.3.3 酶的動力學參數動力學研究結果見表4，3 個突變酶的Km值均比野生型低，說明突變體酶對底物的親和力有所增強；突變酶的Kcat/Km值都高于野生型，表明其催化效率有所提高。

表4 野生型酶和突變酶動力學參數Tab le 4 K inetics of w ild-type and mutant enzymes

2.3.4 三維結構模擬及分析

圖5 地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶三維建模結構Fig. 5 Protein 3-D structure of L-asparaginase from Bacillus licheniform is

為分析突變體S10、S16和S21酶活性提高的原因，擬建立蛋白質三維結構模型，從氨基酸殘基間的相互作用力和空間結構的變化來分析。因地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶晶體結構尚未解析，將野生型氨基酸序列提交到SW ISS-MODEL服務器，以與其序列相似度達到60.62%的同源四聚體蛋白（PDB，id：5i4B.1A）為模板得到其三維結構模型（圖5A）。地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性中心位點為62位的蘇氨酸和109位的絲氨酸（圖5B）。由圖5B可知，活性位點位于Loop環上，靠近N末端。3 個突變體發生的主要氨基酸突變位點在第43位和第67位，因三維結構模板不全，模型無法構建第43位氨基酸殘基，第67位突變前后的蛋白質二級結構變化見圖5C、D。由圖5可知，67位氨基酸殘基位于柔性較大的Loop環上，由天冬酰胺突變為絲氨酸后可能增大了該處的柔性，更有利于單聚體間相互作用，形成完整四聚體結構進而促進催化作用[16]。突變酶S10和S16均在269位發生氨基酸突變，異亮氨酸突變為亮氨酸，兩者都是脂肪族類氨基酸，性質相似，由圖5E、F可知，突變前后蛋白質二級結構變化不大，表明此位點可能對酶活性無影響。

2.3.5 突變酶圓二色譜分析

表5 突變酶二級結構的比例Tab le 5 Proportions of secondary structures in mutant enzymes二級結構 比例/%野生型 S10 S16 S21 α-螺旋 38.4 39.1 35.7 36.8 β-折疊 28.2 26.5 24.6 27.1轉角 4.3 3.1 5.5 4.4無規則卷曲 29.1 31.3 34.2 31.7

在圓二色譜儀190～250 nm范圍內測定蛋白質的橢圓率[17]，計算突變酶蛋白質二級結構比例，并對突變酶進行蛋白二級結構分析，突變酶蛋白二級結構比例見表5。由表5可知，與野生型酶相比，突變體S10的α-螺旋從38.4%增加到39.1%，無規則卷曲從29.1%增加到31.3%，整體二級結構變化不大，這與突變體S10熱穩定性無明顯變化的實驗結果相一致。突變酶S16和S21的α-螺旋數分別由38.4%減少到35.7%和36.8%，無規則卷曲由29.1%分別增加到34.2%和31.7%。研究表明，α-螺旋具有維持蛋白質結構穩定的作用[18]，無規則卷曲的增加提高了蛋白質柔性結構，不利于維持蛋白質的穩定性[19-21]，這與熱穩定性研究結果相一致。

3 討 論

目前關于L-天冬酰胺酶分子改造方面的研究，主要針對酶催化活力和穩定性的提高，國內外學者大部分采用理性設計的方法。如2007年，Li Liangzhu等[22]通過用脯氨酸替代位于氫鍵環內的Asp178獲得大腸桿菌D178P突變體，突變體具有較高的熱穩定性，且不影響酶活性；Shikha等[23]通過替換表面氨基酸殘基得到幾株酶活性和穩定性均提高的突變株；2014年，Vidya等[24]通過對大腸桿菌克隆的ansB基因的定點誘變研究了表面電荷對L-天冬酰胺酶Ⅱ的穩定性的影響。而關于L-天冬酰胺酶定向進化研究的報道甚少，只有2009年Georgia等[25]使用定向進化方法建立來源于歐文氏菌（Erw inia）的L-天冬酰胺酶突變文庫，獲得熱穩定性有所改善的突變體Asp133Val。

本研究利用易錯PCR和DNA shuffling策略對地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶基因進行隨機突變，從19 100 個突變株中獲得酶活性提高的3個突變體S10、S16和S21，突變酶比活較野生型分別提高106%、74%和43%。最佳突變體S10酶比活力達到（306.59±3.21）IU/m g，高于張顯[26]、Long Shuiqing[12]等定點突變的最佳突變體酶活性。動力學研究結果表明突變酶S10的Km值為0.598 mmol/L，高于野生型酶（0.692 mmol/L），Kcat/Km為522.26 L/（mmol·m in），較野生型提高75%，說明該突變酶對底物的親和力有所增強，同時催化效率也大幅度提高，該結果優于Saurabh[27]、Long Shuiqing[12]等定點突變后突變酶催化效率。

為探究突變酶酶活性提高的原因，對野生型氨基酸序列進行三維結構模擬，結果見圖5。突變體S10、S16和S21都在第67位發生突變，該位點氨基酸殘基由天冬酰胺突變為絲氨酸。此突變位點位于Loop環上，靠近四聚體催化活性中心界面，且絲氨酸側鏈較短，是一種柔性較大的強親水性氨基酸。圓二色譜結果顯示，相比野生酶，突變酶的α-螺旋減少、無規則卷曲有所增加，表明其剛性略有降低，這與熱穩定性研究結果相一致[18-21]；柔性有所增加，突變酶Loop環結構與野生酶相比有所上升，柔性結構的增大可能增加了Loop環結構，利于酶與底物結合和產物的釋放，提高了轉化效率，這可能是這3 個突變酶活性提高的主要原因[28-29]。在突變體S10和S16中都發生第43位賴氨酸突變為谷氨酸，但因其三維結構模板不全，模型無法構建出第43位氨基酸殘基。推測第43位賴氨酸突變為谷氨酸后，在此位點引入了更多的氫鍵相互作用，可能增加了酶分子和底物間的氫鍵相互作用，提高了底物親和力[19,23,30]。另一方面，谷氨酸攜帶強的負電荷，可與正電離子相互作用，降低催化反應的活化能，從而提高酶的催化效率[27]。

本研究通過定向進化技術提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的酶活性，提高了該酶的工業應用潛力，說明利用定向進化策略能夠有效地提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性。

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Improving L-Asparaginase Activity from Bacillus licheniformis by Directed Evolution

SHAO Zexiang, JIAO Linshu, LU Zhaoxin, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, ZHANG Chong, Lü Fengxia*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to improve its L-asparaginase activity, the L-asparaginase gene of Bacillus licheniformis was molecularly modified by directed evolution. Mutants S10, S16 and S21 were screened out of more than 19 100 mutants by two rounds of error-prone PCR and one round of DNA shuffl ing, whose specific activities were increased by 106%, 74% and 43%,respectively, as compared to that of the w ild type, together increased Kcat/Km. The am ino acid sequence of S10 showed three mutations, K43E, N67S and I269L. The results of three-dimensional simulation showed that amino acid mutations at position 43 for glutam ic acid and at position 67 for serine may improve substrate affinity and catalytic efficiency, thereby increasing enzymatic activity. The circular dichroism analysis showed that the mutant enzymes contained less α-helix and more random coil than the w ild enzyme, indicating a slight decrease in rigidity and an increase in flexibility. This study indicates that directional evolution can effectively improve the L-asparaginase activity from B. licheniformis.

L-asparaginase; directed evolution; enzyme activity

10.7506/spkx1002-6630-201722002

TS201.3

A

1002-6630（2017）22-0008-06

邵澤香, 焦琳舒, 陸兆新, 等. 基于定向進化技術提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 8-13.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722002. http://www.spkx.net.cn

SHAO Zexiang, JIAO Linshu, LU Zhaoxin, et al. Improving L-asparaginase activity from Bacillus licheniformis by directed evolution[J]. Food Science, 2017, 38(22): 8-13. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722002.http://www.spkx.net.cn

2017-05-11

國家自然科學基金面上項目（31671800）

邵澤香（1990—），女，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：2014108005@njau.edu.cn

*通信作者：呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn