凡納濱對蝦組織蛋白酶L性質分析及其對肌肉蛋白的降解

顏龍杰，沈建東，張凌晶,，翁 凌,，胡莉蘋，曹敏杰,,3,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.福建省海洋生物資源開發利用協調創新中心，福建 廈門 361102）

凡納濱對蝦組織蛋白酶L性質分析及其對肌肉蛋白的降解

顏龍杰1，沈建東2，張凌晶1,2，翁 凌1,2，胡莉蘋1，曹敏杰1,2,3,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.福建省海洋生物資源開發利用協調創新中心，福建 廈門 361102）

本研究從凡納濱對蝦肝胰腺中純化獲得一種組織蛋白酶L，其分子質量約為31 kD，肽質量指紋圖譜分析得到8 個片段共112 個氨基酸殘基，與報道的凡納濱對蝦組織蛋白酶L序列完全一致。該酶的最適溫度和最適pH值分別為35 ℃和5.5，且在0～40 ℃以及pH 5.5～6.5之間酶活力穩定。該酶僅對底物Z-Phe-Arg-MCA特異分解。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和Leupeptin對其有明顯的抑制作用，而金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸對其有少量的激活作用。掃描電子顯微鏡觀察結果顯示，隨著低溫貯藏時間的延長，對蝦肌肉纖維的斷裂程度不斷增加。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，組織蛋白酶L可使肌肉蛋白發生分解，推測其可能參與對蝦低溫貯藏過程中肌肉的降解。

凡納濱對蝦；組織蛋白酶L；純化；肌原纖維；掃描電子顯微鏡；降解

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是世界三大養殖蝦品種之一[1]。2014年，我國凡納濱對蝦養殖產量達157.6萬 t[2]。凡納濱對蝦因味道鮮美、營養豐富，深受人們喜愛。對蝦在流通過程中的貯藏通常采用0～4 ℃短期冷藏、-18 ℃長期凍藏等方式。雖然0～4 ℃低溫貯藏可以延長其貨架期，但黑變、肌肉彈性下降等問題難以避免[3-5]。此外，-18 ℃凍藏的對蝦在解凍過程中蝦肉會出現自溶現象。

國內外研究發現，肌肉蛋白的降解是蝦肉貯藏過程中組織軟化、自溶的主要原因[6]，而內源性蛋白酶是造成肌肉蛋白降解的關鍵因素[3,7-9]。在多種內源性蛋白酶中，組織蛋白酶L是一類容易使肌原纖維蛋白降解的蛋白酶[10-12]。研究發現[13]，該酶基因在蝦的肝胰腺、血細胞、腮、肌肉、腸、胃及卵巢等組織均有表達，而在肝胰腺中的表達水平最高。雖然有研究[14-15]嘗試通過添加不同類型抑制劑判斷組織蛋白酶L在貯藏過程中的作用，但是其相關的酶學性質以及對肌肉蛋白降解作用的研究鮮有報道。本研究以凡納濱對蝦為研究對象，運用生化分離技術獲得高純度組織蛋白酶L，分析酶學性質，進一步采用掃描電鏡觀察貯藏過程中蝦肉的微觀變化情況，探索組織蛋白酶L對肌肉蛋白的降解作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活凡納濱對蝦（平均個體質量10 g） 廈門集美農貿市場；SP-Sepharose陽離子層析柱 美國GE Healthcare公司；Z-Phe-A rg-MCA、Z-A rg-A rg-M CA、Boc-G ln-A rg-A rg-M CA等熒光底物 日本Peptide Institute公司；反式琥珀酸-亮氨酰胺-胍基丁酮（E-64） 美國Am resco公司；胃蛋白酶抑制劑Pepstatin 瑞士Roche公司；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、苯甲脒、亮肽素 美國Sigma公司；蛋白標準品 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

Pro高分辨率掃描電鏡 荷蘭Phenom公司；PT2500E高速組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國Agilent公司；Avanti J-265xp高速冷凍離心機、手持式500型pH計 美國Beckman公司；WB-10L1型恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；YP6001N電子天平 中國上海精科天平廠；M ini Protean Cell垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

鮮活凡納濱對蝦采用冰水混合致死（1∶2（g/m L）冰水中浸泡20 m in）[3]，無菌水洗凈，瀝干，分3 組，裝入無菌真空包裝袋，置于4 ℃冷藏，用于實驗。

1.3.2 組織掃描電鏡分析

平行于凡納濱對蝦肌肉紋理進行切片，獲得片狀組織（1 cm×1 cm×2 mm），體積分數2.5%戊二醛溶液4 ℃固定24 h，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗2 次，再用質量分數1%四氧化鋨溶液25 ℃浸泡1 h，之后采用不同體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇梯度脫水，20 m in/次，再用100%乙醇脫水3 次，15 m in/次，處理后，再用乙酸異戊酯置換乙醇。乙醇置換后，用濺射儀在樣品表面濺射鍍金，最后用掃描電鏡進行觀察，記錄結果。

1.3.3 組織蛋白酶L酶活力的測定

參考Barrett等[16]的方法稍作修改，操作如下：在900 μL 100 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，加入50 μL酶液和50 μL熒光底物Z-Phe-Arg-MCA（10 μmol/L）混勻，37 ℃孵育10 m in，加入1.5 m L終止液（水-甲醇-異丙醇體積比為35∶35∶30），混勻終止反應。采用熒光分光光度計檢測混合液的熒光值，測定時激發波長和發射波長分別為380 nm和450 nm，對照組用緩沖液代替熒光底物。酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol 7-氨基-4-甲基香豆素（7-am ino-4-methylcoumarin，AMC）所需酶量。

1.3.4 組織蛋白酶L的分離純化

分離純化過程均在4 ℃條件下進行，具體步驟如下：取新鮮對蝦肝胰腺，加入4 倍體積50 mm o l/L乙酸鈉緩沖液（pH 4.5，含1 mmo l/L PMSF、1 mmol/L EDTA），進行組織搗碎，于0 ℃，12 000×g離心20 m in，絹布過濾，上清液即為粗酶液。粗酶液進行飽和度為40%～80%硫酸銨溶液分級沉淀，所得沉淀采用少量緩沖液溶解，4 ℃條件下充分透析。透析后的樣品上樣于S P-Sepharose陽離子交換層析柱（1.5 cm×12 cm），并淋洗至280 nm波長處檢測值到基線。接著用含0～0.5 mol/L NaCl的緩沖液線性洗脫。收集酶活性峰透析，再次上樣于SP-Sepharose預裝柱（體積1 m L），用含0.2～0.5 mol/L NaCl緩沖液線性洗脫，獲得純化的蛋白酶，并用于性質分析。

1.3.5 組織蛋白酶L的質譜鑒定

將純化的蛋白酶上樣于質量分數12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecy l sulfatepolyacrylam ide gel electrophoresis，SDS-PAGE），經質譜銀染后，切下目的條帶，送至上海中科新生命生物科技有限公司進行肽質量指紋圖譜鑒定。

1.3.6 酶學性質分析

1.3.6.1 最適溫度和熱穩定性

蛋白酶最適溫度測定按照1.2.3節方法，其中孵育條件為不同溫度（4～80 ℃）孵育10 m in。熱穩定性的測定，首先將酶液置于不同溫度（0～70 ℃）孵育30 m in，立即冰浴冷卻至室溫，在37 ℃條件下測定其剩余酶活力。

1.3.6.2 最適pH值和pH穩定性

蛋白酶最適pH值測定時，孵育液為0.1 mol/L不同pH值的緩沖液（pH 2.0～8.0）。pH穩定性測定方法為：將酶液加到不同pH值的緩沖液（pH 2.0～8.0）中，4 ℃孵育30 m in，取出少量酶液于100 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.5），測定其剩余酶活力。

1.3.6.3 底物特異性

底物特異性是將酶液與不同類型的熒光底物孵育反應，按1.2.3節方法測定其對不同類型底物的水解程度，以水解Z-Phe-A rg-MCA熒光底物為對照。不同類型熒光底物包括Boc-Gln-Arg-A rg-MCA、Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA、Z-Phe-A rg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA。

1.3.6.4 蛋白酶抑制劑的作用

將酶液與不同類型的抑制劑混勻，在4 ℃孵育1 h后，用1.2.3節方法測定酶液剩余酶活力。對照樣品的反應條件一致，但不加任何抑制劑。所用抑制劑包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E-64和Leupeptin）、金屬蛋白酶抑制劑（EDTA、EGTA）、絲氨酸蛋白酶抑制劑（PMSF、苯甲脒）。

1.3.7 組織蛋白酶L與肌肉蛋白降解的關系

1.3.7.1 肌肉蛋白的制備

新鮮凡納濱對蝦去殼取肉，加入4 倍體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，含0.15 moL/L NaCl溶液）組織搗碎，搗碎后的混合液即為肌肉總蛋白。

1.3.7.2 酶在不同時間下對肌肉蛋白的降解

在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，將2.5 mg肌肉全蛋白（含約0.01 U酶活力的組織蛋白酶L）與0.4 U酶活力的組織蛋白酶L充分混合，在35 ℃分別反應0、5、15、30、60、90、120、180 min后，進行SDS-PAGE分析，觀察肌肉蛋白的降解情況。對照樣品的反應條件為35 ℃，180 min，不添加組織蛋白酶L，其他條件相同。

1.4 數據分析

本研究有關相對酶活力數據處理中，以同一組內3個重復樣品的平均變異系數（coefficient of variation，CV）為組內誤差進行分析。

2 結果與分析

2.1 組織蛋白酶L的分離純化

粗酶液經過預處理和硫酸銨鹽析后，上樣于預先平衡的SP-Sepharose陽離子交換層析柱。結果如圖1a所示，目的蛋白吸附于SP-Sepharose層析柱，而大量的雜蛋白未被吸附，因此該層析柱能有效地將雜蛋白與目的蛋白分開。吸附部分的蛋白采用含0～0.5 mol/L NaCl緩沖液線性洗脫，目的蛋白被洗脫下來。由圖1b所示，經SP-Sepharose陽離子交換預裝柱進一步純化。由圖1c可知，組織蛋白酶L在SDS-PAGE顯示單一條帶，分子質量約為31 kD。該結果與來源于藍圓鲹、鮭魚肌肉以及海參內臟的組織蛋白酶L分子質量（30 kD左右）接近[12,17-18]，但略高于鮑魚（28.5 kD和28 kD）[11]、鯉魚（28 kD）[19]等的分子質量。組織蛋白酶L是一種酸性蛋白酶，其等電點在5.0左右。因此，其在pH 4.5的緩沖液中帶正電荷，通過2 次陽離子交換層析柱分離純化，獲得了高度純化的組織蛋白酶L，如表1所示，酶活力、純化倍數和得率分別為666.7 U/mg、349.4 倍和9.6%。

圖1 組織蛋白酶L分離純化層析圖Fig. 1 Column chromatographic purification of cathepsin L

表1 凡納濱對蝦組織蛋白酶L的純化Table 1 Summary of the purification of cathepsin L from shrim p

2.2 肽質量指紋圖譜分析

表2 純化蛋白質譜分析獲得的肽段Table 2 Peptide sequences of purified protein obtained by peptide mass fingerprinting

由表2可知，利用肽質量指紋圖譜技術對純化蛋白進行鑒定，獲得8 個氨基酸片段包含112 個氨基酸殘基。由圖2可知，經過序列比對，發現所得片段與通過分子克隆獲得的凡納濱對蝦（L.vannamei）組織蛋白酶L（GenBank：CAA68066.1）的氨基酸序列完全一致，證明純化的酶為組織蛋白酶L。作為溶酶體中重要的半胱氨酸蛋白酶之一，組織蛋白酶L在多種動物中被發現存有潛在的糖基化位點[11,19-20]。鮑魚的組織蛋白酶L由于糖基化而出現2 個分子質量不同的條帶[11]。凡納濱對蝦組織蛋白酶L的序列中同樣有一個潛在的糖基化位點（Asn298）[20]，但是在蛋白水平上并沒有出現糖基化修飾現象。利用空間預測軟件SW ISS-MODEL，以人的組織蛋白酶L（SMTL ID：1cs8.1）為模板，對凡納濱對蝦組織蛋白酶L進行同源建模，如圖3所示，推測是由于潛在糖基化位點（Asn298）在空間結構上處于蛋白內部，被蛋白質折疊所掩蓋而未發生糖基化。

圖2 純化蛋白的質譜片段與報道的凡納濱對蝦（L. vannamei）組織蛋白酶L的序列比較Fig. 2 Sequence alignment of the peptide of purified p rotein w ith cathepsin L from Litopenaeus vannamei

圖3 凡納濱對蝦（L. vannamei）組織蛋白酶L中潛在N糖基化位點在三級結構中位置Fig. 3 Potential N-glycosylated site of cathepsin L from Litopenaeus vannamei in the three-dimensional structure

2.3 組織蛋白酶L的性質分析

2.3.1 最適溫度和熱穩定性

如圖4所示，組織蛋白酶L在35 ℃時對Z-Phe-A rg-M CA熒光底物的分解能力最強，與鮑魚來源的組織蛋白酶L（35 ℃）相近[11]，低于藍圓鲹（55 ℃）[12]、海參（50 ℃）[18]等水產動物的組織蛋白酶L。當溫度為4 ℃時，組織蛋白酶L保持40%的相對酶活力，表明該酶在低溫條件下仍表現出較高的酶活力；當溫度為60 ℃時，由于高溫引起蛋白變性，組織蛋白酶L出現了失活狀態。另外，組織蛋白酶L的熱穩定性結果顯示，當溫度低于40 ℃時，酶的穩定性良好，相對酶活力保持在60%以上。當溫度高于40 ℃時，組織蛋白酶L酶活力下降明顯。在50 ℃孵育30 min后，組織蛋白酶L的相對酶活力僅為20%。

圖4 組織蛋白酶L的最適溫度和熱穩定性Fig. 4 Op timal tem perature and thermal stability of cathepsin L

2.3.2 最適pH值和pH穩定性

圖5 組織蛋白酶L的最適pH值和pH穩定性Fig. 5 Optimal pH and pH stability of cathepsin L

如圖5所示，凡納濱對蝦組織蛋白酶L的最適pH值為5.5，這個特性與多數水產動物中組織蛋白酶L的性質相似[11-12,17-18]。當pH值為4.0時，酶活力較低，僅有40%的相對酶活力；當pH值為8.0時，幾乎不表現酶活性?？梢娊M織蛋白酶L是一種在酸性條件下表現酶活力并發揮其功能的蛋白酶。當pH值大于6.5，酶活力下降明顯，到pH 8.0時，酶活力幾乎喪失。當pH值小于5.5時，酶活力也呈下降趨勢，表明組織蛋白酶L在pH 5.5～6.5區域，其穩定性良好，這與本實驗室先前報道的來源于鮑魚[11]、藍圓鲹[12]的組織蛋白酶L性質相似。

2.3.3 底物特異性研究

表3 組織蛋白酶L的底物特異性Tab le 3 Substrate specificity of cathepsin L

本實驗選用不同類型的熒光底物對凡納濱對蝦組織蛋白酶L的底物特異性進行研究，結果如表3所示。組織蛋白酶L對熒光底物的分解十分專一，僅對P1位（切割位點N端第一個氨基酸殘基）為堿性氨基酸[21]，P2位為疏水性氨基酸的底物的組織蛋白酶底物Z-Phe-A rg-MCA進行強烈分解[22]，而對其他類型的熒光底物分解程度較低。Br?mme等[23]通過合成一系列底物進行分析，指出組織蛋白酶L更偏向于切割P2為芳香族氨基酸殘基的底物，這一性質與組織蛋白酶B和S不同?？梢?，組織蛋白酶L、B、S雖均屬于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族，但底物特異性仍存在差異。

2.3.4 蛋白酶抑制劑的影響

不同蛋白酶抑制劑對組織蛋白酶L分解Z-Phe-A rg-MCA的影響如表4所示。絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲脒有一定的抑制，但PMSF對其抑制作用不明顯。蛋白酶抑制劑亮肽素和E-64對該酶活力有強烈的抑制效果。Leupeptin既屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑，也是絲氨酸蛋白酶抑制劑，其抑制類型并不專一，而E-64是一種專一抑制劑半胱氨酸蛋白酶的抑制劑，這2 種抑制劑可以有效抑制該酶活性，也證明了純化的酶屬于半胱氨酸蛋白酶類。金屬蛋白酶抑制劑EDTA、EGTA對該酶有輕微的激活作用，推測是由于某種（或某幾種）金屬離子對該酶的活性存在抑制作用，而EDTA、EGTA螯合金屬離子，進而激活了酶活性。類似的結果在鮑魚組織蛋白酶L也被觀察到[9]。

表4 不同蛋白酶抑制劑對組織蛋白酶L的影響Table 4 Effect of different p roteinase inhibitors on the activity of cathepsin L

2.4 凡納濱對蝦冷藏過程中肌肉微觀結構的變化

對蝦在4 ℃冷藏過程中，肌肉結構由緊密逐漸變為松散是導致質構不斷下降的原因。掃描電鏡圖分析結果顯示，新鮮對蝦的肌肉結構完整，成束狀平行規則排列，纖維結構緊密（圖6a1、6a2）。冷藏3 d后，肌肉束狀纖維出現斷裂（箭頭所指向處），纖維之間變得疏松（圖6b1、6b2）。5 d后，肌肉束狀結構斷裂加劇，出現片狀化現象（箭頭所指向處），肌肉結構更加松散、肉質軟化（圖6c1、6c2）。Pornrat等[24]運用超微結構分析了羅氏沼蝦在5 ℃貯藏3 d后肌原纖維蛋白的變化情況，發現Z線發生斷裂，4～6 d后，Z線、I線和M線均發生斷裂。有研究發現對蝦在冷藏過程中，蛋白酶會造成肌肉彈性下降，是造成纖維不斷產生斷裂、片狀化的原因之一[25]。

圖6 凡納濱對蝦肌肉在4 ℃貯藏不同時間的掃描電鏡圖Fig. 6 EM photom icrographs of shrim p muscle stored at 4 ℃ for different time intervals

2.5 組織蛋白酶L與肌肉總蛋白降解的關系

為了探究組織蛋白酶L是否能夠導致蝦肌肉軟化，研究了組織蛋白酶L對蝦肌肉蛋白的降解作用，結果如圖7所示。在磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，組織蛋白酶L與肌肉總蛋白在35 ℃共同孵育5 m in，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）迅速發生降解。隨著時間的延長，蝦肌肉中分子質量大于60 kD的蛋白均出現降解現象。反應180 min后，MHC幾乎被完全降解，同時，肌動蛋白和原肌球蛋白，以及其他蛋白（條帶1～5）等也發生降解。在4 ℃條件下，隨著作用時間延長，也可觀察到同樣的結果。

活蝦肌肉pH值約為7.0，蝦死后初期由于體內糖原的降解，三磷酸腺苷分解導致酸類物質的產生，pH值下降至6.5左右。隨著貯藏時間延長，蝦體內的蛋白質、氨基酸及含氮類物質在自身蛋白酶和微生物的共同作用下分解產生胺類、吲哚等堿性物質，使蝦肉pH值逐漸上升至8.0左右[24-25]。組織蛋白酶L的酶學性質顯示，當pH值大于6.5時，酶活力下降十分明顯，因此其可能參與蝦死后初期和中期肌肉蛋白質的降解。

盡管本研究的組織蛋白酶L是從肝胰腺中分離獲得，但該酶廣泛存在于蝦肌肉中[28]，是肌肉中活性較高的內源性蛋白酶之一[29]。同時，對蝦肝胰腺中存在高活力的絲氨酸蛋白酶[4,29-30]。隨著對蝦新鮮度的下降，肝胰腺中的蛋白酶可以逐漸向肌肉擴散，并使肌肉蛋白發生降解。本研究也發現，在4 ℃貯藏過程中，蝦肉的第一腹節處最先出現肌肉斷裂現象，蛋白降解最劇烈，可能是蝦頭部豐富的蛋白酶逐漸向肌肉中擴散并發揮作用。

同時，本研究對4 ℃貯藏過程中蝦肌肉中組織蛋白酶L相對活力進行檢測，由圖8所示，隨時間延長，該酶活力有一定程度降低，但即便貯藏5 d，其相對活性仍保持在80%以上。因此，組織蛋白酶L在蝦貯藏過程中持續參與肌肉蛋白的分解，尤其對組成肌肉的主要蛋白MHC的降解最為顯著。

圖7 組織蛋白酶L對蝦肌肉蛋白的降解作用Fig. 7 SDS-PAGE profi les show ing degradation of shrim p muscular proteins by cathepsin L

圖8 4 ℃貯藏不同時間肌肉中組織蛋白酶L相對活力的變化Fig. 8 Relative activities of cathepsin L in shrimp muscle at different time intervals during storage at 4 ℃

3 結 論

本研究運用生化分離技術從凡納濱對蝦中純化獲得一種組織蛋白酶L，結果顯示該酶分子質量為31 kD，最適溫度和pH值分別為35 ℃和5.5，在0～40 ℃以及pH 5.5～6.5之間酶活力穩定。肽質量指紋圖譜進一步確定該酶為組織蛋白酶L。該酶對組織蛋白酶底物Z-Phe-A rg-MCA分解作用顯著，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和Leupeptin對該酶活力有強烈的抑制效果。掃描電鏡結果顯示，蝦肌肉在冷藏解凍過程中，肌肉纖維出現斷裂、片狀化現象。純化的組織蛋白酶L能夠使蝦肉蛋白產生降解，推測其與蝦類貯藏過程中肌肉蛋白品質下降直接相關。

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Characterization of Cathepsin L from Litopenaeus vannamei and Its Effect on Muscular Protein Degradation

YAN Longjie1, SHEN Jiandong2, ZHANG Lingjing1,2, WENG Ling1,2, HU Liping1, CAO M injie1,2,3,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China;2. National and Local Joint Engineering Research Center of Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China;3. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361102, China)

This study aimed to investigate the enzyme that m ight be involved in this process. Cathepsin L was purified to homogeneity from the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei, and its molecular mass was approximately 31 kD as analyzed by sodium dodecyl sulfate- polyacrylam ide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Peptide mass fingerprinting revealed that 8 peptide fragments w ith a total of 112 amino acid residues were completely identical to the cathepsin L gene of L. vannamei. Using Z-Phe-Arg-MCA as substrate, the proteinase revealed optimal activity at 35 ℃ and pH 5.5,respectively. Purified cathepsin L was stable at temperature up to 40 ℃ and in the pH range from 5.5 to 6.5. It exhibited high specificity towards the substrate Z-Phe-Arg-MCA. Its enzymatic activity was significantly suppressed by the cysteine proteinase inhibitors E-64 and leupeptin, while it could be slightly activated by the metalloproteinase inhibitors ethylene diam ine tetraacetic acid (EDTA) and ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA). In addition, the fibrous structure of shrimp meat was increasingly destroyed w ith the prolongation of cold storage time as observed by scanning electron m icroscope(SEM). Purified cathepsin L eff ectively hydrolyzed muscular proteins as detected by SDS-PAGE, suggesting its potential involvement in the degradation of shrimp muscular proteins during cold storage.

Litopenaeus vannamei; cathepsin L; purification; myofibillar protein; degradation; scanning electron m icroscope (SEM)

10.7506/spkx1002-6630-201722006

TS254.4

A

1002-6630（2017）22-0034-07

2016-10-13

國家自然科學基金面上項目（31271838）；廈門南方海洋研究中心項目（14CZP030HJ04）

顏龍杰（1988—），男，博士研究生，研究方向為水產加工。E-mail：yanlongjieg@163.com

*通信作者：曹敏杰（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產品深加工與蛋白質化學。E-mail：m jcao@jmu.edu.cn

顏龍杰, 沈建東, 張凌晶, 等. 凡納濱對蝦組織蛋白酶L性質分析及其對肌肉蛋白的降解[J]. 食品科學, 2017, 38(22):34-40. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722006. http://www.spkx.net.cn

YAN Longjie, SHEN Jiandong, ZHANG Lingj ing, et al. Characterization of cathepsin L from Litopenaeus vannamei and its effect on muscular protein degradation[J]. Food Science, 2017, 38(22): 34-40. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722006. http://www.spkx.net.cn