固定化酶輥多效酶解大豆胚片的工藝優化

李中賓，任 悅，鄒德智，王 旭，于殿宇*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

固定化酶輥多效酶解大豆胚片的工藝優化

李中賓，任 悅，鄒德智，王 旭，于殿宇*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

利用醋酸纖維素修飾聚丙烯微孔膜，再將纖維素酶和中性蛋白酶分別固定在醋酸纖維素/聚丙烯復合膜上，并制成固定化酶輥，以大豆胚片為原料，依次按纖維素酶輥、中性蛋白酶輥的順序共同交替多效循環對其進行碾壓酶解，以冷榨大豆胚片的出油率為指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化固定化酶輥酶解大豆胚片條件。結果表明，最佳條件為酶解環境空氣相對濕度86.0%、大豆料胚溫度55.0 ℃、酶輥碾壓時間91.0 m in，在此條件下酶解的大豆胚片經冷榨出油率為73.8%，瓦餅的蛋白變性較小，2 種固定化酶輥重復使用7 次后，其相對酶活力仍保持在80%以上。

固定化酶輥；多效酶解；冷榨法；出油率；氮溶解指數（NSI）

目前，大豆制油的工業化方法主要為溶劑萃取法、熱榨法和冷榨法[1-3]，其中溶劑萃取法的出油率最高，但油脂的營養價值偏低，同時豆粕中溶劑殘留，使豆粕效能降低[4-5]。熱榨法提取的油脂品質較好，安全健康，但出油率僅為70%左右，且高溫使豆粕蛋白變性嚴重，利用率很低[6-7]。冷榨法是將未經過蒸炒的油料直接在80 ℃以下進行物理壓榨，從而避免了熱榨法的不足，并且冷榨油不需進一步常規的油脂精煉工序，最大限度地保存了油中各種脂溶性營養成分[8-10]，但出油率約為熱榨法的一半，致使其市場售價較高。

近年來，人們對酶法與冷榨技術相結合制油的技術展開的相關研究[11-12]表明，相較于傳統冷榨制油法，酶法與冷榨技術相結合制油的技術使得出油率顯著提高，同時瓦餅中蛋白質變性程度較低，但是此種方法所用的酶大多數為游離酶，在制油的過程中酶的用量大，成本較高，酶無法重復使用等問題限制了其在工業化生產上的廣泛應用。將游離酶固定在載體上制成固定化酶，不僅提高了酶的穩定性，同時可使酶重復使用，從而降低了生產成本[13]，固定化酶載體材料根據其形態大致可以分為微球、多孔材料和膜材料等[14-15]，而將酶固定在膜表面制成酶膜，可以將酶的催化功能和膜的分離功能有機地結合起來，這一點是其他載體材料無法比擬的[16]。

醋酸纖維素/聚丙烯復合膜具有一定的吸附性、化學穩定性好、疏水性和機械性能優異等優點，根據復合膜的吸附特性固定酶，可提高酶在反應體系中的穩定性，從而有利于酶的回收和產品的生產。而將酶膜制成酶輥，并用于大豆胚片酶解反應中，不僅可以降低蛋白與油脂的結合力[17-19]，保證了較高的出油率，又可以用于工業化連續生產。

本實驗利用醋酸纖維素修飾聚丙烯微孔膜，再以醋酸纖維素/聚丙烯復合膜為載體，以吸附交聯法分別將纖維素酶和中性蛋白酶固定在載體上，如圖1所示，并將2 種固定化酶膜分別制成酶輥，依次按纖維素酶輥、中性蛋白酶輥的順序共同交替循環酶解大豆胚片，研究酶輥的相關特性及2 種酶輥連續多效酶解過程的工藝條件，研究酶解后冷榨大豆胚片的出油率及蛋白變性情況，為工業化連續生產提供一定的理論依據。

圖1 酶固定化原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram illustrating the p rincip le of enzyme immobilization

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆胚片（從企業生產線上取樣，工藝參數為大豆破碎4～6 瓣，軟化溫度70 ℃，時間約15 m in，胚片厚度0.3 mm左右；水分質量分數10.6%，蛋白質質量分數41.6%，脂肪質量分數20.8%，灰分質量分數4.3%）黑龍江九三康諾有機農產品科技有限公司；纖維素酶（25 U/mg）、中性蛋白酶（200 U/mg） 諾維信（中國）有限公司；聚丙烯微孔膜 北京塑料研究所；醋酸纖維素 中國醫藥集團上海化學試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SG30-2B型家用螺旋榨油機 北京永恒鑫盛科技發展中心；JF-976G分體式加熱平臺 東莞市長安金峰電子工具廠；SM-03B型電子霧化加濕器 江蘇濕美電氣制造有限公司；N24120型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海凱朗儀器設備廠；PHS-3C精密酸度計 上海雷韻試驗儀器制造有限公司；THZ-82數顯水浴恒溫振蕩器江蘇省金壇市友聯儀器研究所；PP-2000型掃描電子顯微鏡 英國Quorum公司；2300自動定氮儀 杭州福斯特卡托公司。

1.3 方法

1.3.1 聚丙烯復合膜的表面修飾

聚丙烯微孔膜內部呈纖維狀，微孔較多，這種結構并不利于酶的固定化，因此需用醋酸纖維素對聚丙烯微孔膜進行表面改性，將5.0 g醋酸纖維素溶于100 m L丙酮中，待溶解完全形成均一的膜液，將聚丙烯微孔膜浸于溶有醋酸纖維素的丙酮溶液中，自然成膜，以去離子水沖洗醋酸纖維素/聚丙烯復合膜數次干燥備用[20]。

1.3.2 酶膜的制備

纖維素酶膜的制備：將7.5 m g纖維素酶溶解于45 ℃、500 m L、pH 4的磷酸鹽緩沖液中配制成酶液，取2 份相同大小的醋酸纖維素/聚丙烯復合膜緊密貼合，置于上述酶液中振蕩吸附5 h后，加入2.5 m L戊二醛進行交聯反應4 h，確保纖維素酶固定于單張酶膜的一側，以達到節約成本的目的。取出酶膜以去離子水沖洗數次后于室溫下干燥，制得一側有固定化纖維素酶的酶膜，對酶膜進行表征，觀察其表面形貌，所得電鏡圖片經專業圖象分析軟件分析其孔徑大小[21]。

中性蛋白酶膜的制備：將7.5 mg中性蛋白酶溶解于51 ℃、500 m L、pH 7的磷酸鹽緩沖液中配制成酶液，將2 張緊密貼合的纖維素/聚丙烯復合膜置于酶液中，振蕩吸附4 h后，加入2.5 m L戊二醛進行交聯反應3 h，干燥后制得一側有固定化中性蛋白酶的酶膜，對酶膜進行表征，觀察其表面形貌，所得電鏡圖片經專業圖象分析軟件分析其孔徑大小。

1.3.3 固定化酶膜載酶量的測定

用單位面積的酶膜所固定的酶蛋白含量表示載酶量，采用Bradford[22]的方法測定固定化前后的纖維素酶及中性蛋白酶的酶液含量，同時測定清洗固定化酶膜所用PBS中的酶蛋白含量，同一條件下進行平行重復實驗3 次，取平均值，實驗誤差在5%以下。根據公式（1）計算載酶量：

式中：ρ0為固定化之前酶溶液中蛋白質量濃度/（m g/m L）；ρ為酶經固定化后溶液中蛋白質量濃度/（mg/m L）；ρw為清洗溶液中蛋白質量濃度/（mg/m L）；V為固定化實驗所用酶溶液體積/m L；Vw為清洗溶液體積/m L；S為浸入酶溶液中膜的面積/cm2。

1.3.4 固定化酶膜酶活力測定

測定固定化酶膜活力時，每次取固定化酶膜2 份，其中一份做空白實驗，在樣品瓶中加入另一份固定化酶膜1 cm2，其中纖維素酶活力采用QB 2583—2003《纖維素酶制劑》中的濾紙酶活力法測定；中性蛋白酶活力采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林-酚法測定，以酶活力最大值為100%，其余酶活力與其對比，即相對酶活力，見公式（2）：

式中：A為固定化酶膜初始酶活力/（U/cm2）；B為使用一定時間后固定化酶膜的酶活力/（U/cm2）。

1.3.5 酶輥的制備

輥的規格為直徑60 mm，長400 mm，輥軸長80 mm，輥的表面材質為普通碳鋼板（板厚3.0 mm），酶輥上固定2 層，第1層用牛皮紙包裹輥，將少量乳白膠均勻的涂抹在牛皮紙中間及兩側位置，第2層將制備好的固定化纖維素酶膜的空白一側纏繞于附有乳白膠的牛皮紙上，使酶膜較好的固定在輥上，從而制得固定化纖維素酶輥；同法制得中性蛋白酶輥。

1.3.6 酶輥碾壓胚片過程

將大豆胚片平鋪于帶有電熱的600 mm×400 mm不銹鋼板上，大豆胚片厚度大約5 mm，將其支撐在800 mm×450 mm×500 mm的不銹鋼板制作的密封室內，酶輥的兩段軸頭外漏，調節電熱板至一定溫度，利用電子霧化加濕器向酶解室內噴霧，調節酶解室內空氣相對濕度，按照纖維素酶輥在前，中性蛋白酶輥在后的順序多次碾壓電熱板上的大豆胚片，人工轉動輥軸使2 種酶輥連續循環往復碾壓酶解胚片，期間每隔10 m in將胚片翻置1 次。

1.3.7 響應面試驗設計

綜合單因素試驗結果，采用Box-Behnken模型，對空氣相對濕度（A）、大豆料胚溫度（B）、酶輥碾壓時間（C）3 個因素進行優化，以出油率（Y）為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，使用Design-Expert 8.0.6設計響應面試驗以優化制油工藝參數。響應面因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.8 冷榨制油方法

取出酶解后的胚片，對其進行低溫干燥處理，調節物料水分質量分數為5%，將干燥后物料投入冷榨機內，在冷榨壓力3.5 MPa、冷榨溫度65 ℃條件下進行冷榨制油，并計算出油率，見公式（3）：

式中：mA為壓榨后瓦餅含油質量/g；mB為大豆胚片總含油質量/g。

1.3.9 氮溶解指數測定

參照Mattil[23]的方法并做適當改進以測定榨油后瓦餅的氮溶解指數（nitrogen solubility index，NSI），具體方法為：準確稱取100 mg樣品，加入15 m L蒸餾水，室溫下磁力攪拌30 m in， 4 000 r/m in離心30 m in，收集上清液。取20 m L上清液，凱氏定氮法測定上清液中的氮含量，同時測定瓦餅中的總氮含量。

1.3.10 酶輥操作穩定性分析

在響應面優化的最佳操作條件下，用2 種酶輥對大豆胚片進行碾壓酶解操作，每次碾壓時間為優化出酶解的最佳時間，每次碾壓結束后，從酶輥上取約1 cm2的酶膜進行酶活力檢測，重復上述實驗過程，以初始的酶活力記為100%，計算相對酶活力，考察重復使用次數對酶膜相對酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 固定化酶輥的制備

2.1.1 聚丙烯微孔膜及固定化酶膜的微觀結構

從圖2a可知，空白聚丙烯微孔膜內部呈纖維狀，錯亂交叉，微孔較多，其平均孔徑為0.22 μm，這種結構并不利于酶的固定化。圖2b中醋酸纖維素/聚丙烯復合膜的表面平整、致密、均勻，且無明顯的微孔結構，這說明經醋酸纖維素修飾后，聚丙烯膜內部微孔被醋酸纖維素交織成網狀結構，從而有利于酶的固定[24]。圖2c、2d中醋酸纖維素/聚丙烯復合膜的表面大部分被酶覆蓋，且酶在復合膜的表面分布均勻，這表明大部分的酶被固定在醋酸纖維素/聚丙烯復合膜的界面上。

圖2 微孔膜及固定化酶膜的掃描電鏡圖（×1 000）Fig. 2 Scanning electron m icroscopic images of m icroporous membrane and immobilized enzyme membrane (× 1 000)

2.1.2 酶膜載酶量及酶活力由表2可知，固定化纖維素酶膜與固定化中性蛋白酶膜的酶活力分別為18.92 U/mg和142.32 U/mg，雖然酶活力有所降低，但可增加重復利用次數，避免了酶的大量流失[25-26]。

表2 2 種酶膜的載酶量及酶活力Table 2 Enzyme loadings and activities of two immobilized enzyme membranes

2.1.3 固定化酶輥立體結構

圖3 酶輥的立體實物圖Fig. 3 Pictures of immobilized enzyme rollers

如圖3所示，碳鋼材質具有較好的機械強度，可保證在長時間使用下酶輥不變形，牛皮紙使輥表面平整，避免在操作過程中外層固定化纖維素酶膜受到內部輥的機械損傷，同時牛皮紙具有較好的透氣性，可使固定化纖維素酶膜層內外濕度保持相近，從而利于其酶膜在一定的濕度下發揮作用；固定化中性蛋白酶輥結構與固定化纖維素酶輥相同。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 酶解室空氣相對濕度對出油率的影響

通過控制通入水霧量調節酶解室內的空氣相對濕度為75%、80%、85%、90%、95%，料胚溫度為55 ℃，酶輥連續碾壓大豆胚片的時間為90.0 m in，空氣相對濕度對大豆胚片出油率的影響見圖4。

圖4 空氣相對濕度對出油率的影響Fig. 4 Effect of relative air hum idity on oil yield

由圖4可知，隨著酶解室內空氣相對濕度的增大，大豆胚片的出油率呈先升高后平緩趨勢，當空氣相對濕度大于85%時，出油率趨于平穩，這主要是因為酶的催化作用只與少部分與酶結合的“結合水”有關，過高的水分含量會稀釋酶和底物，使酶促反應速率下降[26]，并且空氣相對濕度過高，可能導致酶膜上固定化酶的脫落致使出油率增加不明顯，綜合考慮，空氣相對濕度在85%為宜。

2.2.2 大豆料胚溫度對出油率的影響

選取酶解室空氣相對濕度為85%，料胚溫度為35、45、55、65、75 ℃，酶輥連續碾壓大豆胚片的時間為90.0 min，大豆料胚溫度對大豆胚片出油率的影響見圖5。

圖5 大豆料胚溫度對出油率的影響Fig. 5 Effect of operating temperature on oil yield

由圖5可以看出，當大豆料胚溫度從35 ℃升至55 ℃時，出油率逐漸升高，溫度達到55 ℃時，出油率達到最大。這說明隨著溫度的升高，2 種酶的催化活性部位逐漸暴露，使酶的活性逐漸增強[28]。然而，隨著溫度繼續升高，大豆胚片出油率開始降低，這可能是因為較高溫度使酶輥上的酶部分失活所導致的。因此，2 種酶輥共同作用大豆胚片的最佳大豆料胚溫度為55 ℃。

2.2.3 酶輥碾壓時間對出油率的影響

選取酶解室內空氣相對濕度為85%，料胚溫度為55 ℃，酶輥連續碾壓大豆胚片的時間為75、80、85、90、95 min，酶輥碾壓時間對大豆胚片出油率的影響見圖6。

由圖6可以看出，開始時隨著兩種酶輥連續碾壓大豆胚片時間延長，出油率逐漸增大，酶輥碾壓超過90.0 m in時，出油率增加減緩，原因為纖維素酶輥破壞了大豆胚片細胞壁，中性蛋白酶輥降低了大豆胚片內油脂與蛋白結合力，從而使油脂易于從固體油料中釋放出來[29-30]，延長碾壓時間，雖有利于出油率的提高，但時間過長會導致生產效率的下降，綜合考慮，選取碾壓時間為90.0 m in。

2.3 響應面法優化酶解工藝

2.3.1 響應面試驗設計與結果

綜合單因素試驗的結果，以空氣相對濕度（A）、大豆料胚溫度（B）、酶輥碾壓時間（C）3 個因素進行優化，以出油率（Y）為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，使用Design-Expert 8.0.6設計響應面試驗以優化制油工藝參數。響應面試驗方案與結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design w ith experimental values of oil yield

由表3可知，整個試驗共進行17 次，其中析因試驗為12 次，中心試驗為5 次。采用Design-E xpert 8.0.6軟件對表中數據進行二次多項回歸擬合，得到3 個因素對響應值影響的回歸方程模型如下：

2.3.2 響應面模型的顯著性檢驗與分析

表4 回歸方程的方差分析Tab le 4 Analysis of variance of regression equation

表4中出油率整體模型的F值為119.64，P值小于0.000 1，模型極顯著，表明回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，因變量與所有自變量之間的線性關系顯著，即這種實驗方法是可靠的。失擬項是用來表示模型與實驗擬合的程度，即二者差異的程度[31]。表3中失擬項F值為1.35，P值為0.377 5，失擬項不顯著，表明該模型選擇正確，模型中的調整系數R2Adj為0.984 5，說明98.45%的響應值變化可以通過擬合模型進行解釋，相關系數R2為0.992 2，表明該模型與實際實驗擬合較好，可以用此模型來分析和預測出油率。

從回歸方程系數的顯著性檢驗可以看出：一次項C對響應值的影響高度著性，A、B對響應值的影響顯著。在所確定的實驗水平范圍內，各因素對響應值的影響程度順序為C＞A＞B，即酶輥碾壓時間＞空氣相對濕度＞大豆料胚溫度，3 個因素中，空氣相對濕度和酶輥碾壓時間之間有高度顯著交互作用，空氣相對濕度和大豆料胚溫度之間有顯著交互作用。

通過試驗設計優化得到酶輥處理大豆胚片的最佳工藝參數為空氣相對濕度85.3%、大豆料胚溫度54.4 ℃、酶輥碾壓時間90.6 m in，該條件下出油率預測值為73.2%。根據實際情況將工藝參數進行整理，得出整理值為空氣相對濕度86.0%、大豆料胚溫度55.0 ℃、酶輥碾壓時間91.0 m in，在此條件下進行3 次平行驗證實驗，該條件下出油率平均值為73.8%，實測值與預測值之間具有良好的擬合性，從而證實了模型的有效性。同時本實驗對最佳工藝下冷榨制油后瓦餅的NSI值進行測定，結果表明，實驗冷榨瓦餅NSI為70.0%，通過比較本實驗中的冷榨瓦餅與普通冷榨瓦餅可知，本實驗冷榨瓦餅NSI較其上升3.4%，這說明本實驗方法所得的瓦餅蛋白具有較好的溶解性，相對于普通冷榨榨制油工藝所得的瓦餅蛋白加工特性較好，具有較好的經濟價值以及更廣泛的應用領域。

2.4 固定酶輥的操作穩定性

圖7 2 種酶輥重復使用次數對相對酶活力的影響Fig. 7 Repeated usability of two immobilized enzyme rollers

由圖7可以看出，無論固定化纖維素酶輥還是固定化中性蛋白酶輥的相對酶活力，均隨著重復使用次數的增加而降低，這可能是由于重復使用次數增加，酶膜受到一定的機械損傷，使載體破損，并可能伴有固定化酶脫落現象，或者酶本身的失活導致了固定化酶相對酶活力的降低。但2 種酶輥在重復使用7 次后，相對酶活力仍可保持80%以上，說明其具有良好的操作穩定性。

3 結 論

本實驗研制了固定化纖維素酶輥和固定化中性蛋白酶輥，應用2 種酶輥連續循環往復對大豆胚片進行碾壓酶解處理，降低了大豆胚片內油脂與蛋白結合力，以冷榨出油率為指標，通過響應面法優化了空氣相對濕度、大豆料胚溫度和酶輥碾壓時間對酶解效果的影響，在酶解最佳條件下，冷榨出油率為73.8%。同時測得壓榨后瓦餅的NSI為70.0%，相較于普通冷榨瓦餅有顯著提高，提高了3.4%。2 種固定化酶輥重復使用7 次后，其相對酶活力均可保持80%以上，具有較好的操作穩定性，應用此法對大豆胚片進行酶解處理，不僅提高了冷榨法制油的出油率及冷榨后瓦餅中蛋白的利用率，酶輥的連續使用性能為工業化連續生產提供一定的理論依據。

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Optim ization of Sequential Hydrolysis of Soybean Flakes by Immobilized Enzyme Rollers for Increased Cold-Presssed Oil Yield

LI Zhongbin, REN Yue, ZOU Dezhi, WANG Xu, YU Dianyu*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

An immobilized enzyme roller was developed by immobilizing cellulase and neutral protease onto polypropylene m icroporous membrane modified by cellulose acetate, respectively. Soybean flakes were rolled sequentially w ith the cellulose roller followed by the neutral protease roller and then used for the production of cold-pressed oil. Hydrolysis conditions were optim ized by one-factor-at-a-time method and response surface methodology. An air relative hum idity of 86.0%, an operating temperature of 55.0 ℃ and a rolling time of 91.0 m in were found to be the optimal conditions to obtain a higher oil yield of 73.8% and a lower degree of protein denaturation. A fter seventh repeated use, both immobilized enzyme rollers retained more than 80% of their initial activities.

immobilized enzyme roller; sequential enzymatic hydrolysis; cold pressing method; oil yield; nitrogen solubility index (NSI)

10.7506/spkx1002-6630-201722011

TS224.3；TQ644.1

A

1002-6630（2017）22-0067-07

李中賓, 任悅, 鄒德智, 等. 固定化酶輥多效酶解大豆胚片的工藝優化[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 67-73. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722011. http://www.spkx.net.cn

LI Zhongbin, REN Yue, ZOU Dezhi, et al. Optimization of sequential hydrolysis of soybean flakes by immobilized enzyme rollers for increased cold-presssed oil yield[J]. Food Science, 2017, 38(22): 67-73. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722011. http://www.spkx.net.cn

2017-04-10

“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2016YD0401402）；國家自然科學基金面上項目（31571880）

李中賓（1987—），男，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：380003840@qq.com

*通信作者：于殿宇（1964—），男，教授，博士，研究方向為糧油精深加工技術。E-mail：dyyu2000@126.com