5 株櫻桃果實采后病原真菌分離及rDNA ITS區序列分析

姚 婷，黃津津，任向峰，張 燕，何欣萌，王友升*

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，食品質量與安全北京實驗室，北京工商大學，北京 100048）

5 株櫻桃果實采后病原真菌分離及rDNA ITS區序列分析

姚 婷，黃津津，任向峰，張 燕，何欣萌，王友升*

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，食品質量與安全北京實驗室，北京工商大學，北京 100048）

從采后貯藏過程中自然發病的“拉賓斯”、“紅燈”櫻桃果實中分離到5 株絲狀病原真菌319#、323#、367#、369#和370#。對分離得到的菌株純化、回接、再分離純化，并觀察菌落形態和個體形態。提取5 株病原真菌DNA，PCR擴增rDNA ITS區序列后測序，分析測序結果并構建進化樹。綜合形態學特征和rDNA ITS區序列鑒定分析結果，得到菌株319#為匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、菌株323#為蘋果果腐病菌（Diaporthe perniciosa）、菌株367#為黑附球菌（Epicoccum nigrum）、菌株369#為核果褐腐病菌（Monilinia laxa）和菌株370#為圓孤青霉菌（Penicillium cyclopium），其中D. perniciosa、E. nigrum和P. cyclopium為在櫻桃果實上首次分離到的病原真菌。

櫻桃；病原真菌；形態學觀察；rDNA ITS區序列分析

櫻桃（Cerasus pseudocerasus）果實富含維生素、鈣、鐵、磷及鉀等多種元素，營養豐富，深受消費者喜愛，但由于櫻桃皮薄多汁，果實在采后貯藏過程中易受微生物侵染而發生品質裂變[1-2]。據報道，導致櫻桃果實采后貯藏期間腐爛損失嚴重的病原真菌有灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers. ex Fr.）引起的灰霉病、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起的軟腐病、鏈核盤菌（Monilinia sp.）引起的褐腐病、擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病和鏈格孢菌（A lternaria alternata）引起的交鏈孢霉腐病等[3-4]。目前對引起櫻桃采后病害的其他病原微生物，國內外鮮有報道。

rDNA基因內轉錄間隔區（in ternal transc ribed spacer，ITS）存在保守序列和可變序列，利用可變區分化程度高、變異性強的特點可從分子水平上解決真菌分類鑒定及進化水平上的差異性問題[5-7]?？赏ㄟ^分析較短的rDNA ITS區序列信息，快速有效地對真菌進行分類鑒定，而被廣泛應用，rDNA ITS區序列是真菌鑒定的有效途徑[8-9]。但目前未見利用rDNA ITS區序列分析技術系統研究櫻桃果實采后病原真菌的報道。

本研究從采后櫻桃果實上分離得到5 株絲狀真菌，結合菌落和個體形態學特征及rDNA ITS區序列分析，發現了引起甜櫻桃果實采后病害的新病原微生物，以期進一步豐富櫻桃果實采后病原微生物的種類的同時，為櫻桃果實采后病害的生物防治供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

從采后貯藏過程中自然發病“拉賓斯”櫻桃果實中分離到2 株絲狀真菌319#、323#，“紅燈”櫻桃果實中分離到3 株絲狀真菌367#、369#和370#。

1.1.2 培養基

馬鈴薯瓊脂（potato dex trose agar，PDA）培養基：馬鈴薯去皮后切片，稱取200 g，加1 L無菌水煮沸30 m in后，過濾取汁液，向濾液中加入瓊脂18 g、葡萄糖20 g、最后加水補足至1 L，在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 m in。

麥芽浸粉瓊脂（malt extract agar，ME）培養基：麥芽浸粉20 g、瓊脂18 g，調節pH值至5.5±0.2，在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 m in。

1.1.3 試劑

DNA分子質量標準2×Taq PCR Master M ix、MarkerⅦ、6×Loading Buffer（溴酚藍） 天根生化試劑公司；通用引物ITS-4和ITS-5由Invitrogen公司負責合成。十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸鈉（sodium ethylene diam ine tetracetate，EDTA） 美國Amersco公司；乙醇、鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

微量移液器 美國Effendorf公司；HQ45恒溫搖床武漢中科科儀技術發展有限公司；Imager 2200凝膠成像系統 美國ALpha公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；4 ℃預冷離心機 美國Sigma公司；生物安全柜美國Thermo公司；Axio Image A 1顯微鏡 德國Zeiss公司；PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離、純化與回接[10]

分離：取發病櫻桃果實的發病、健康交界處組織于PDA固體培養基平板上，25 ℃培養3 d。

純化：取分離菌邊緣菌塊，分別三點轉接到PDA和ME培養基平板上，于25 ℃培養14 d，觀察7 d和14 d菌落形態和個體形態特征。

回接：挑選健康無損傷的櫻桃果實，75%乙醇溶液表面消毒，用無菌接種針刺孔，取純化后的菌塊接種至傷口處，觀察果實接種處的病癥。

1.3.2 形態學觀察

從分離得到生長于PDA上的菌落外沿取菌塊分別三點轉接到到PDA和ME培養基上，于25 ℃條件下培養14 d，分別于7 d和14 d觀察菌落形態、色澤等。培養期間，若培養基上長出孢子，于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，將插片培養的蓋玻片置染色液中，置于顯微鏡下觀察菌落產生分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤，分生孢子隔膜等性狀[11]。

1.3.3 基因組DNA的提取及ITS區PCR擴增

基因組DNA的提?。翰捎酶牧己骃DS-氯化芐法提取待鑒定菌株的基因組DNA[7]作為PCR模板。

ITS區PCR擴增：以真菌rDNA ITS區的通用引物ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS-5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）作為PCR擴增引物。25 μL 2×Taq PCR MasterM ix、ITS4和ITS5兩條正反向引物各4 μL和5 μL基因組模板、12 μL ddH2O，將體系混勻。在PCR儀中94 ℃預變性3 m in，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃再延伸10 min；30 個循環。

反應結束后取5 μL PCR產物加1 μL 6×Loading Buffer（溴酚藍）混勻，進行染色。將染色后的樣品加到1.0%瓊脂糖凝膠膠孔中，180 V、180 m A條件下電泳30 m in，電泳后在EB染液中染色10 m in后于紫外燈下觀察電泳條帶。

1.3.4 測序結果分析

PCR產物由北京六合華大基因科技股份有限公司進行脫鹽、純化和雙向測序，測序結果在CExpress軟件中進行序列拼接，將拼接結果在網站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行核酸比對[10]，根據比對結果在GenBank數據庫中找目的菌株同源序列，通過MEGA 6軟件進行同源性分析，構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與回接

圖1 5 株病原真菌分離與回接病癥Fig. 1 Naturally and artificially infected fruits

從采后自然發病的“拉賓斯”櫻桃果實中分離到絲狀真菌319#和323#，從“紅燈”櫻桃果實中分離到367#、369#和370#（圖1a1～e1），純化后回接到健康無傷的相應品種的櫻桃果實上，在接種部位均出現相同的病癥（圖1a2～e2），并能從該病害部位再次分離得到相應病原菌，因此，可確定上述5種絲狀真菌均為櫻桃果實致病菌。

2.2 病原菌的形態觀察

2.2.1 菌落形態

圖2 5 株櫻桃果實采后絲狀病原真菌分別在PDA和ME培養基上25 ℃培養7、14 d的菌落特征Fig. 2 Colony grow th of five fungal pathogens cu ltured on ME and PDA p lates at 25 ℃ for 7 and 14 days

由圖2可以看出，5 株病原菌在PDA和ME培養基上25 ℃培養條件下均生長旺盛，但菌落形態差異較大?！袄e斯”櫻桃上分離的菌株319#和323#菌絲呈白色，外觀干燥，不透明（圖2a1、a2、b1、b2），其中菌株319#菌絲長而疏松，氣生的匍匐菌絲分布在培養基表層（圖2a1、a2）。而菌株323#菌絲質地緊密，呈溝紋狀（圖2b1、b2），但這兩種菌繼續培養至14 d菌落形態并無明顯變化。

“紅燈”櫻桃上分離的菌株367#、369#和370#在PDA和ME培養基上25 ℃培養7 d后，兩種培養基上菌落形態較一致，菌落質地緊密且菌絲較短。比較而言，菌株367#在PDA和ME培養基上培養7 d后，菌絲均長到2/3平板，呈橙黃色（圖2c1、c2），14 d后，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2c3、c4）。而菌株369#在PDA上7 d后已經鋪滿板，而ME培養基上菌絲長到2/3平板，呈棕褐色（圖2d1、d2），但14 d后，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2d3、d4）。菌株370#在PDA和ME培養基上菌絲零星滿板，菌落呈灰綠色（圖2e1、e2），14 d后，菌絲顏色均加深并分布在板上的面積增大（圖2e3、e4）。

2.2.2 顯微形態

圖3 5 株病原菌真菌的顯微形態觀察Fig. 3 M orphological characteristics of five pathogenic fungi

圖3顯示了5種絲狀病原真菌在PDA培養基上25 ℃培養7 d后菌絲及孢子形態觀察。結果表明，5 株病原菌菌絲均多分枝且內部具有隔膜，菌絲與孢子梗有明顯的區別。其中菌株319#、323#、367#和370#菌絲細且著色淺，而菌株369#菌絲較粗且著色深（圖3a1～e1）。菌株319#、323#、369#和370#孢子形態各異，而菌株367#未觀察到孢子（圖3a2～e2）。比較而言，菌株319#分生孢子穗呈球形，黑色或黑褐色，分生孢子梗光滑頂囊膨大，分生孢子粗糙，常具黑褐色條紋（圖3a2）。菌株323#菌絲上生出許多橫隔，內部灰色，然后從分隔處斷裂，產生梭形至橢圓形的雙細胞孢子（圖3b2）。菌株369#孢子梗有隔膜，頂端分枝，分生孢子單孢、串生且分枝較多，孢子球形或卵形，孢子壁光滑（圖3d2）。菌株370#分生孢子梗從菌絲垂直生出，有橫隔，頂端生排列成帚狀分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個孢子球狀、卵圓形或橢圓形，綠色（圖3e2）。

本研究分離到的5 株絲狀真菌與《真菌鑒定手冊》等文獻[12-13]中的菌落、菌絲和孢子形態描述進行比較，確定319#屬于藻菌綱、毛霉目、毛霉科的根霉屬；323#屬于子囊菌綱、鹿角菌目、腐皮殼科的腐皮殼屬；367#屬于殼霉目、杯霉科、黑附球菌，369#屬于半知菌類從梗孢目、從梗孢科、串珠霉屬的核果褐腐串珠霉；370#屬于半知菌類從梗孢目、從梗孢科的青霉屬。

2.3 基因組DNA的PCR擴增

圖4 5 株病原真菌的ITS區rDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of ITS rDNA sequence of five pathogenic fungi

5 株病原真菌ITS區產物經1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測結果表明，不同菌株序列長度存在差異，其中菌株369#、323#、367#和370#在500～600 bp之間，而菌株319#片段在900 bp左右（圖4）。這可能由于rDNA ITS區存在長度和序列多態性[8]。

2.4 構建ITS區r DNA系統進化樹分析

將5 株菌株ITS區測序結果在NCBI網站上進行比對，從GenBank數據庫中搜索相似度達97%以上的同源序列，通過MEGA 6軟件Bootstraps功能計算目的菌株所在進化樹各分枝的置信度，發現5 株病原真菌分別屬于5個不同的屬。

圖5 以ITS rDNA基因序列為分子標記的5 株菌株的系統進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree for each fungal strain based on ITS rDNA sequence

菌株319#在NCBI網站上比對只出現根霉屬，進化樹結果表明，319#與匍枝根霉（R. stolonifer）（JQ991620.1）在同一分支上，置信度支持率可達94%（圖5a）。

菌株323#序列與腐皮殼屬D iaporthe、鏈格孢屬Alternaria、擬莖點霉屬Phomopsis相關菌株均具有較高相似度，但與腐皮殼屬Diaporthe的一個亞種相似度最高，找相應屬的同源序列，對目的序列構建進化樹分析，323#與蘋果果腐病菌（D. perniciosa）（HQ908492.1）在同一個分支上，通過Bootstraps的驗證表明它們的置信度支持率可達75%（圖5b）。

菌株367#在NCBI中的比對結果顯示只與黑附球菌（E. nigrum）具有很高的相似度，進化樹分析結果顯示367#與黑附球菌這個種的菌株E. nigrum（GU014950.1）在同一分枝上，與該菌株在進化過程中的親緣性最近，置信度支持率可達93%（圖5c）。

菌株369#在NCB I同源性比對過程中與灰霉屬Botrytis、鏈核盤菌屬Monilinia、核盤霉屬Sclerotinia相關菌株具有較高相似度，但與鏈核盤菌屬Monilinia相似度最高，找3個屬的同源序列，進化樹分析結果表明，369#與M. laxa（KC515383.1）在同一分枝上，置信度支持率可達83%（圖5d）。

菌株370#在NCBI網站上比對只出現青霉屬，構建進化樹分析，發現370#為圓孤青霉菌，與菌株P. cyclopium（KJ783269.1）在同一分枝上，且置信度支持率達100%（圖5e）。

綜上所述，分離得到的5 株病原真菌，rDNA ITS區序列鑒定結果為：菌株319#匍枝根霉（R. stolonifer）、菌株323#蘋果果腐病菌（D. perniciosa）、菌株367#黑附球菌（E. nigrum）、菌株369#核果褐腐病菌（M. laxa）和菌株370#圓孤青霉菌（P. cyclopium）。

3 討 論

據報道，櫻桃果實的病原菌主要有褐腐病菌[2]、灰霉病菌[4]、鏈格孢菌[14]、軟腐病菌[15]和青霉病菌[16]等，前期的研究中也分離到了灰葡萄病菌（B. cinerea）和鏈格孢菌（A. a lternata）（結果待發表）。本研究從采后貯藏期間“拉賓斯”櫻桃果實上分離到匍枝根霉（R. stolonifer）（菌株319#），何煜波等[15]也從甜櫻桃果實上分離到R. stolonifer，且該病原菌還能夠引起橘子、梨、葡萄和油桃[17-20]等果實軟腐病。此外，本研究分離到的蘋果果腐病菌（D. perniciosa）能夠侵染采后貯藏期間的蘋果果實[21-22]，但鮮見該菌侵染采后貯藏期間櫻桃果實的報道。

類似地，從“紅燈”櫻桃果實上分離到的核果鏈核盤菌（M. laxa）（菌株369#），據報道該病原菌與該屬的美澳型核果鏈核盤菌（M. fructicola）均能侵染桃、杏、油桃和櫻桃等核果果實而導致褐腐病[23-25]，表明鏈核盤菌屬（Monilinia）中關系較近的這兩種真菌的寄主特異性并不明顯。

此外，本研究從“紅燈”櫻桃果實上分離到圓弧青霉（P. cyclopium）（菌株370#），該菌在食品工業中主要用于生產葡萄糖酶，也可侵染蘋果、番茄等果實[26-27]，而引起櫻桃果實青霉病的主要是擴展青霉（P. expansum）[28]，但鮮見P. cyclopium侵染櫻桃果實的報道。類似的，本研究分離到的黑附球菌（E. nigrum）（菌株367#）可侵染采后脫水干癟的葡萄果實[29]，也可作為拮抗菌來防治桃果實的褐腐病菌[30]，但鮮見侵染櫻桃果實的報道。

4 結 論

從櫻桃上分離得到的5 株病原真菌，結合形態學特征及rDNA ITS區序列進化樹分析分別鑒定為匍枝根霉（R. stolonifer）、蘋果果腐病菌（D. perniciosa）、黑附球菌（E. nigrum）、核果褐腐病菌（M. laxa）和圓孤青霉（P. cyclopium）。目前鮮見D. perniciosa、E. nigrum和P. cyclopium侵染櫻桃果實的報道，為櫻桃果實采后貯藏期間分離到的病原真菌。

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Morphological Characterization and rDNA ITS Sequence Analysis of Five Pathogenic Fungi Isolated from Cherry Fruits

YAO Ting, HUANG Jinjin, REN Xiangfeng, ZHANG Yan, HE Xinmeng, WANG Yousheng*
(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology & Business University (BTBU), Beijing 100048, China)

Five fungal strains isolated from naturally infected cherry fruit were purified, re-inoculated and identified as pathogens of cherry fruits. The results of morphological characterization and ribosomal DNA internal transcribed spacer(rDNA-ITS) analysis showed that strain 319#, 323#, 367#, 369#and 370#were identified as Rhizopus stolonifer, Diaporthe perniciosa, Epicoccum nigrum, Monilinia laxa and Penicillium cyclopium, respectively. In this study, D. perniciosa,E. nigrum and P. cyclopium were isolated from cherry fruits for the fi rst time.

cherry fruit; pathogenic fungi; morphological characterization; rDNA ITS sequence analysis

10.7506/spkx1002-6630-201722012

Q93-331

A

1002-6630（2017）22-0074-06

姚婷, 黃津津, 任向峰, 等. 5 株櫻桃果實采后病原真菌分離及rDNA ITS區序列分析[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 74-79.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722012. http://www.spkx.net.cn

YAO Ting, HUANG Jinjin, REN Xiangfeng, et al. Morphological characterization and rdna its sequence analysis of five pathogenic fungi isolated from cherry fruits[J]. Food Science, 2017, 38(22): 74-79. (in Chinese w ith English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722012. http://www.spkx.net.cn

2017-05-15

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD16B06）；國家自然科學基金面上項目（31471626）

姚婷（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：yaoting0127@163.com

*通信作者：王友升（1976—），男，教授，博士，研究方向為果蔬綠色保鮮及其高值化。E-mail：wangys@btbu.edu.cn