嗜鹽性蛋白酶產生菌Virgibacillus sp. P-4的篩選鑒定及其特性分析

張延杰，王靜雪*，牟海津

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

嗜鹽性蛋白酶產生菌Virgibacillus sp. P-4的篩選鑒定及其特性分析

張延杰，王靜雪*，牟海津

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

利用酪蛋白瓊脂平板從傳統蝦醬中分離嗜鹽性蛋白酶產生菌，經形態學、生理生化和分子生物學鑒定，確定該菌隸屬于枝芽孢桿菌屬Virgibacillus sp. P-4，并用此菌為后續研究菌株。結果表明，該菌最適生長溫度為30～37 ℃，最適生長NaCl質量分數為5%～15%；所產胞外蛋白酶在20～50 ℃條件下酶活力較高且保持穩定，最適反應溫度為40 ℃，當NaCl質量分數為15%時酶活力達到最高，并且所產胞外蛋白酶種類可能不只一種，但不包含巰基蛋白酶；通過分析酶解液中游離氨基酸釋放速率，預測其酶切位點為Phe-、Tyr-、Lys-、His-、Pro-及Leu-。

蛋白酶產生菌；嗜鹽菌；蝦醬；性質

傳統蝦醬是以蝦為原料，在高鹽條件下，經自然發酵而成的一種風味獨特的黏稠狀紫紅色調味料，富含不飽和脂肪酸以及游離氨基酸等營養物質，深受我國以及東南亞各國人民的喜愛[1]。然而目前我國蝦醬產業存在發酵周期長、鹽度過高（30%～35%）等問題，制約了其產業化的發展[2]。許多學者嘗試通過減少鹽用量和降低pH值[3]、提高發酵溫度[4]、外加蛋白酶[5]等加速蛋白質降解的方式來縮短發酵周期。但是這些方法也存在缺陷，如低鹽會促進致病菌的滋生，高溫則會使必要的蛋白酶變性并且還會增加投資成本，外加酶發酵的產品風味不及自然發酵[6]。

近年來，以微生物為啟動子，通過純培養的方式來發酵水產品，受到越來越多學者的關注，這種方式對提高加工速率、穩定產品質量、改善產品感官品質以及縮短發酵周期等方面都有積極作用[7]，Speranza等[8]利用3 株片球菌（Pediococcus）在實驗室條件下發酵魚露，結果發現這種發酵方式不僅可以縮短發酵時間，并且還能夠改善產品質量。自然發酵方式不受人為控制，產品質量總是參差不齊，選擇合適的嗜鹽菌作為啟動子，優化和控制發酵過程，就成為研究熱點。段杉等[9]研究發現，蝦醬在發酵過程中內源性蛋白酶活力不斷降低，細菌蛋白酶活力逐漸增加，細菌蛋白酶對發酵風味的形成有極大貢獻。呂欣然等[10]研究表明，蝦醬中產蛋白酶的嗜鹽性葡萄球菌和枝芽孢桿菌是導致蝦醬中蛋白質降解的主體微生物類群。鑒于嗜鹽性蛋白酶產生菌在蝦醬發酵過程中起著至關重要的作用，因此一些學者將目光集中于此，例如，Tanasupaw at等[11]從泰國蝦醬中分離到一株鹽脫氮枝芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans TKNR13-3），它的嗜鹽嗜熱特性將在食品發酵方面有巨大的應用潛力；連鑫等[12]從傳統蝦醬中分離出一株具有水解蛋白質能力的黑曲霉（Aspergillus niger），而霉菌在發酵食品中往往會產生良好的風味。綜上所述，有針對性地分離嗜鹽性蛋白酶產生菌，對它的生長特性、酶學性質進行研究，這對于將來用其進行蝦醬的標準化生產有重要意義。

本研究主要是通過分離篩選傳統蝦醬中的嗜鹽性蛋白酶產生菌，并對其特性進行分析，以期為蝦醬的分步發酵提供優良的微生物菌株，最終達到縮短發酵周期、降低鹽度、穩定生產的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬采購于山東青島。

酪蛋白、瓊脂 北京索萊寶科技有限公司；酵母膏北京雙旋微生物培養基制品廠；氯化鈉、三氯乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基及蛋白酶制劑 北京路橋技術有限公司；聚合酶鏈式反應中所用試劑均購自上海生物工程技術有限公司。

酪蛋白液體培養基：酪蛋白10 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 100 g/L，pH 7.2±0.2。

酪蛋白固體培養基：酪蛋白10 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 100 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.2±0.2。

1.2 儀器與設備

HH-1恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；M LS-3750全自動滅菌鍋 日本三洋電子公司；WPG-350隔水式電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；HZQ-F恒溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 菌株的篩選及鑒定

1.3.1 菌株的初篩

稱取1 g蝦醬置于酪蛋白液體培養基中進行多次富集培養，吸取100 μL富集培養液進行梯度稀釋后涂布于酪蛋白固體培養基上，37 ℃培養6 d，選取菌落周圍有透明圈的菌株進行純化，然后點種于酪蛋白固體培養基上，37 ℃培養6 d后，在平板上加0.4 mol/L三氯乙酸觀察透明圈的大小。

1.3.2 菌株的復篩

挑取一環菌株接種于50 m L酪蛋白液體培養基中（250 m L錐形瓶），37 ℃、150 r/m in振蕩培養7 d。吸取1、3、5、7 d的適量培養液進行蛋白酶活力測定。參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[13]采用Folin-酚法，利用酶標儀分別測定菌株的酸性、中性、堿性蛋白酶活力。對于酸性、中性、堿性蛋白酶的活力測定需分別使用pH 3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液、pH 7.5磷酸鹽緩沖液和pH 10.0硼酸-硼酸鈉緩沖液進行適當稀釋。一般認為，在40 ℃適當pH值條件下，1 m in水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量為1 個蛋白酶活力單位。

1.3.3 分子生物學鑒定[14]

挑取一環單菌落置于500 μL無菌水中，置于95 ℃水浴加熱5 m in后作聚合酶鏈式反應（polymerase chain reac tion，PCR）模板。PCR體系為50 μL，其中：PCR M aster M ix（2×）25 μL，16S Primer Up 1 μL，16S Primer Down 1 μL，模板2 μL，加RNase-Free Water補至50 μL。PCR條件：94 ℃預變性10 m in；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 m in，共35 個循環；72 ℃延伸10 m in。最后將PCR擴增產物交由上海生物工程技術有限公司測序。將測得的序列登錄EzTaxon數據庫進行比對，應用MEGA 5.0軟件構建系統發育進化樹。

1.3.4 形態學及生理生化鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》[15]和《伯杰細菌鑒定手冊》[16]進行形態學及生理生化鑒定。

1.3.5 生長特性

挑取一環待測菌株接種于50 m L營養肉湯中，37 ℃、150 r/m in振蕩培養24 h，而后按2%（體積分數）接種量接種于營養肉湯中，將其分別設置為不同的培養時間（自0 h開始，每隔4 h測定一次）、培養溫度（10、20、30、35、37、45 ℃）、pH值（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5）、NaCl質量分數（0%、5%、10%、15%、20%、25%）的培養基，在適宜溫度振蕩培養48 h后測定OD600nm，每個梯度設置3 個平行。

1.3.6 酶學性質測定

1.3.6.1 最適反應溫度及溫度穩定性

取適量經緩沖液適當稀釋的粗酶液，將其分別置于20、30、40、50、60、70 ℃條件下測定中性蛋白酶活力，計算相對酶活力。

取經緩沖液適當稀釋的粗酶液，分別置于20、30、40、50、60、70 ℃條件下保溫30 m in，待恢復到室溫后在最適反應溫度測定中性蛋白酶活力，計算相對酶活力。

1.3.6.2 NaCl質量分數對酶活力的影響

將待測菌株置于不同質量分數的NaCl（0%、5%、10%、15%、20%）酪蛋白液體培養基中，取適量粗酶液測定中性蛋白酶活力，計算相對酶活力。

1.3.6.3 金屬離子對酶活力的影響

向粗酶液中分別加入A gNO3、A lC l3、CaC l2、COCl2、CuSO4、Fe2(SO4)3、MgSO4、MnSO4和ZnSO4至最終濃度為5 mmol/L，室溫靜置30 m in，在最適條件下測定中性蛋白酶活力，以不加金屬離子的粗酶液作對照酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.3.6.4 抑制劑對酶活力的影響

向粗酶液中分別加入不同的蛋白酶抑制劑：碘乙酰胺（iodoacetam ide，IAM，巰基蛋白酶抑制劑）、乙二胺四乙酸（ethylenediam inetetraacetic acid，EDTA，金屬蛋白酶抑制劑）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF，絲氨酸蛋白酶抑制劑）、胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）使抑制劑濃度達到1 mmol/L，在室溫靜置30 m in，在相同條件下測定中性蛋白酶活力，未經處理的粗酶液作對照，酶活力為100%，計算加入抑制劑后的相對酶活力。

1.3.7 酶解特異性分析[17]

向經過滅菌處理的100 m L南極磷蝦勻漿液中加入5 m L粗酶液，以不加粗酶液酶解的樣品為空白。在最適溫度條件下，于恒溫振蕩搖床中振蕩酶解1～21 h。酶解結束后，將酶解產物置于沸水中15 min滅酶，冷卻后8 000 r/min離心30 m in，收集上清液即為酶解液，采用氨基酸自動分析儀測定酶解液中游離氨基酸，同時設置空白對照。

1.4 數據分析

運用軟件Origin 8.5對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 嗜鹽性蛋白酶產生菌的篩選

據報道，水產品中存在多樣且復雜的微生物群體[18]，在發酵過程中嗜鹽性蛋白酶產生菌起著主導作用[19]，它的主要作用是在高鹽環境下仍具有蛋白酶活力，降解水產品中的蛋白質。一般來說，當鹽質量分數范圍1%～10%逐步遞增時，就會明顯影響微生物的生長、發酵的速率、產品的感官質量等。因此，從發酵水產品中分離出固有的嗜鹽性微生物，可能會擁有更理想的特性，可以重現原產品的風味甚至提高原產品的質量[8,20]。

圖1 嗜鹽性蛋白酶產生菌在酪蛋白平板上的透明圈Fig. 1 Transparent zones around colonies on casein agar p lates

從蝦醬樣品中初篩得到11 株嗜鹽性蛋白酶產生菌，將這11 株菌在酪蛋白平板上點種培養6 d后，添加0.4 mol/L三氯乙酸，結果如圖1所示。然后對圖1中這11 株菌進行酸性、中性、堿性蛋白酶活力測定，結果如圖2所示。綜合以上結果表明，這11 株菌以產中性蛋白酶為主，尤其以P-4所產中性蛋白酶活力最為突出。此外，P-2雖然在酪蛋白平板上透明圈較小，但是其蛋白酶活力卻比大多數測定菌株都高，這一結果表明透明圈的大小并不能十分準確地反映蛋白酶的活力。此外，連鑫等[12]采用與本實驗相同的篩選方法，在中性酪蛋白瓊脂平板上篩選到一株黑曲霉，采用Folin-酚法測定其蛋白酶活力，結果發現這株黑曲霉的酸性蛋白酶活力最高。

圖2 11 株嗜鹽性蛋白酶產生菌酶活力Fig. 2 Protease activities of 11 selected isolates

2.2 基于16S rDNA序列分析的系統發育樹的構建

將測序結果與Ez Taxon數據庫（h ttp://w w w.ezbiocloud.net/）進行比對，結果發現，P-4與模式菌株V. halodenitrificans DSM 10037T具有最大相似度，可達99.39%。在構建的系統發育樹中，如圖3所示，P-4與V. ha lodenitrificans DSM 10037T最接近，隸屬于同一分支，因此，初步確定P-4屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。為進一步比較分析P-4與枝芽孢桿菌屬已知種相互之間的差異，需要對其進行形態學及生理生化特征的鑒定。

圖3 嗜鹽性蛋白酶產生菌P-4的建樹結果Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree for strain P-4 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 表型鑒定

圖4 嗜鹽性蛋白酶產生菌P-4的透射電鏡照片（×25 000）Fig. 4 Transm ission electron m icrographs of strain P-4 (× 25 000)

將菌株P-4分別接種在NA平板上觀察菌落形態，用顯微鏡觀察細胞形態及染色特征。P-4在NA平板上長出的菌落為圓形，乳白色，表面光滑不透明，革蘭氏染色可變，菌體呈桿狀，周生鞭毛。圖4即為P-4在NA平板上培養3 d后的透射電鏡照片。

經過16S rDNA鑒定之后，認定P-4隸屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。以不產生色素、能降解酪蛋白為標準，目前為止符合上述標準，可供選取的枝芽孢桿菌屬已知種有8 個，表1列出了P-4與這8個枝芽孢桿菌屬已知種在生理生化特征上的異同?？梢钥闯?，P-4擁有大量枝芽孢桿菌屬的特征，如生長范圍、氧化酶活性、V-P實驗、吲哚實驗、精氨酸雙水解酶及鳥氨酸脫羧酶活性等都基本一致；但是也有部分不同于枝芽孢桿菌屬已知種的特征，如革蘭氏染色、硝酸鹽還原性、H2S產氣、賴氨酸脫羧酶活性等。

表1 P-4區別于枝芽孢桿菌屬其他種細菌的不同特征Tab le 1 Differential characteristics between strain P-4 and related species of the genus Virgibacillus

通過以上對各項實驗結果的分析，初步認定菌株P-4可能為芽孢桿菌科枝芽孢桿菌屬的一個新種，命名為Virgibacillus sp. P-4。

2.4 Virgibacillus sp. P-4的生長特性

由圖5可知，該菌在經過液體培養之后，20 h之后即可進入生長穩定期；最適生長溫度為30～37 ℃；當pH值小于6.5時，菌體幾乎不生長或生長緩慢，當pH 6.5～7.5時，隨著pH值的升高，菌體呈對數生長；當pH值大于7.5時，菌體生長速率減緩，但仍舊繼續生長；最適生長NaCl質量分數為5%～15%，當NaCl質量分數超過20%，菌體幾乎不再生長。從生長特性來看，該菌對NaCl有一定的耐受性和依賴性，這也為今后將其應用于高鹽發酵提供了可能性。

2.5 Virgibacillus sp. P-4的酶學性質

由圖6可知，Virgibacillus sp. P-4的粗酶液受溫度、NaCl質量分數、金屬離子及添加劑的影響。圖6A表明，Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶的最適反應溫度是40 ℃，并且在20～50 ℃處理30 m in后，仍保持較高且比較穩定的酶活力，這表明Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶具有一定的耐熱能力，而耐熱能力對食品發酵是至關重要的。因為食品發酵過程中會產生一定的熱量，具有耐熱能力的蛋白酶即使溫度升高仍能保持較高且穩定的酶活力[30]。圖6B表明，Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶的活性隨著NaCl質量分數的升高而逐漸升高，當NaCl質量分數達到15%時，蛋白酶活力達到最高，隨后蛋白酶活力隨NaCl質量分數升高而急劇下降。這一結果表明該蛋白酶需要一定濃度的NaCl來達到最高酶活力并且可以在高鹽環境下保持性質穩定。圖6C表明，不同的金屬離子對Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶粗酶液的活性均有不同程度的抑制作用，其中Zn2+、Fe2+、Co2+對酶活力具有明顯的抑制作用。圖6D表明，EDTA、PMSF、Pepstatin對Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶也有不同程度的抑制作用，其原因是，該菌所產胞外蛋白酶的種類可能不只一種。而IAM是一種巰基反應物，在添加了一定濃度的IAM后，蛋白酶的活性幾乎不受影響，表明該粗酶液中不包含巰基蛋白酶。

圖5 Virgibacillus sp. P-4培養過程中時間（A）、溫度（B）、pH值（C）、NaCl質量分數（D）對菌株生長量的影響Fig. 5 Effects of culture time (A), temperature (B), pH (C), and NaCl concentration (D) on biomass of Virgibacillus sp. P-4

圖6 溫度（A）、NaCl質量分數（B）、金屬離子（C）、抑制劑（D）對Virgibacillus sp. P-4蛋白酶活力的影響Fig. 6 Effects of temperature (A), NaCl concentration (B), metal ions (C),and inhibitors (D) on protease activity of Virgibacillus sp. P-4

關于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）的嗜鹽性、胞外蛋白酶性質及發酵特性近年來也曾有報道，Sinsuwan等[31]從發酵1個月的魚露中篩選到1株中度嗜鹽性蛋白酶產生菌Virgibacillus sp. SK37，其粗酶液在0%～25%NaCl下具有穩定酶活力；Udomsil等[32]在魚露發酵過程中相繼接種Virgibacillus sp. SK37和Tetragenococcus halophilus MS33，結果表明這種發酵方式對改善產品的揮發性成分，提高谷氨酸含量和整體可接受度上具有較大潛力。由圖3的建樹結果可知P-4與Virgibacillus sp. SK 37處于同一分支，它們的16S rDNA序列相似度很高，都屬于嗜鹽菌。但是通過對比它們粗酶液的性質，發現Virgibacillus sp.SK 37的酶活力最佳條件為p H 8.0和65 ℃[31]，而Virgibacillus sp. P-4的最佳酶活力則是在pH 7.0和40 ℃處獲得。由此表明，Virgibacillus sp. SK37所產蛋白酶對溫度的要求比較高，而Virgibacillus sp. P-4則可以在適宜溫度同時達到生長最佳和酶活力最高，因此Virgibacillus sp.P-4在實際生產中更具應用潛力。

2.6 Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶的酶解特異性

蛋白酶降解蛋白質，使蛋白質的肽鍵破裂，導致氨基酸的釋放，用游離氨基酸的釋放速率來預測Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶優先作用于哪些氨基酸組成的肽鍵。Lei Fenfen等[33]將應用最廣泛、效果較好、酶切位點確定的兩種商業酶（Papain和A lcalase 2.4L）用來酶解鳳尾魚蛋白和大豆蛋白時，通過游離氨基酸的釋放速率來預測酶切位點，所得結果與文獻報道的這兩種商業酶的特異性酶切位點結論幾乎完全一致。因此，游離氨基酸的釋放速率在一定程度上能夠反映蛋白酶的酶解特異性。

然而酶促反應通常很復雜，不一定滿足線性關系，但在酶促反應的初期可以認為是符合線性關系的。在本實驗中，南極磷蝦酶解的前11 h內，游離氨基酸含量與時間有較好的線性關系，在這個時間段內，游離氨基酸的釋放速率如表2所示，Virgibacillus sp. P-4的粗酶液在酶解南極磷蝦時，釋放速率最快的是Phe、Tyr、Lys、His、Pro與Leu，由此可推測Virgibacillus sp. P-4所產胞外蛋白酶在酶解過程中優先酶解含Phe-、Tyr-、Lys-、His-、Pro-及Leu-的肽鍵。

表2 Virgibacillus sp. P-4的蛋白酶酶解南極磷蝦各種氨基酸的釋放速率Table 2 The rate of release of FAAs from Antarctic krill meat hyd rolyzed by the protease from Virgibacillus sp. P-4

3 結 論

蝦醬作為一種特殊的鹽生環境，分布著多種嗜鹽菌，這些嗜鹽菌在蝦醬的發酵成熟過程中起著至關重要的作用。采用酪蛋白瓊脂平板法從蝦醬中分離得到一株在高鹽環境下仍能保持穩定酶活力的蛋白酶產生菌Virgibacillus sp. P-4，并通過分子鑒定、表型鑒定、生長特性研究、酶學性質研究、酶切位點預測等手段對其進行了全面解析，從實驗結果可以看出，Virgibacillus sp.P-4確實是一株嗜鹽性蛋白酶產生菌，其生長特性和胞外蛋白酶活力都對NaCl有較強依賴性，這為將其應用于鹽生環境發酵提供了可能性。其次，Virgibacillus sp. P-4的生長最適溫度和酶解最適反應溫度比較接近，在發酵過程中只需設置適宜溫度，即可讓Virgibacillus sp. P-4同時滿足生長最佳和胞外蛋白酶活力最高。以上這些結果都為進一步利用該菌株進行低鹽發酵提供了理論支持。

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Isolation, Identification and Properties of Protease-Producing Halophilic Bacterium Virgibacillus sp. P-4 from Traditional Shrimp Sauce

ZHANG Yanjie, WANG Jingxue*, MOU Haijin
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Protease-producing bacteria were isolated from traditional shrimp sauce by using casein agar medium containing 10% NaCl. Based on its morphological, biochem ical and molecular properties, Virgibacillus sp. P-4 was determ ined as target strain for further study. The strain grew best at 30–37 ℃ w ith a salinity of 5%–15%. The protease produced by Virgibacillus sp. P-4 showed the optimum activity at 40 ℃, and was stable in the range of 20–50 ℃. The enzymatic activity reached its peak when NaCl concentration was 15%. Besides, Virgibacillus sp. P-4 m ight produce more than one extracellular protease except sulfhydryl protease. According to the rate of release of free am ino acids, the protease m ight preferably hydrolyze peptides containing Phe-, Tyr-, Lys-, His-, Pro- and Leu-.

protease-producing bacteria; halophilic bacteria; shrimp sauce; properties

10.7506/spkx1002-6630-201722016

TS254.1

A

1002-6630（2017）22-0102-07

張延杰, 王靜雪, 牟海津. 嗜鹽性蛋白酶產生菌Virgibacillus sp. P-4的篩選鑒定及其特性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(22):102-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722016. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yanjie, WANG Jingxue, MOU Haijin. Isolation, identification and properties of protease-producing halophilic bacterium Virgibacillus sp. P-4 from traditional shrimp sauce[J]. Food Science, 2017, 38(22): 102-108. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722016. http://www.spkx.net.cn

2017-01-04

山東省自主創新及成果轉化專項計劃項目（2015ZDZX05003）；國家現代農業（海水魚）產業技術體系建設專項（CARS-47）；水產品（甲殼類）高效保鮮模式的建立與示范項目（931566010）

張延杰（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：zhangyjouc@163.com

*通信作者：王靜雪（1976—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：snow@ouc.edu.cn