特香型白酒釀造過程中真核微生物菌群演替

李凱敏，付桂明,*，吳酬飛，劉成梅，萬 茵，潘 菲，鄭福平*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院，江西 南昌 330047；2.湖州師范學院生命科學學院，浙江 湖州 313000；3.北京工商大學食品學院，北京 100048）

特香型白酒釀造過程中真核微生物菌群演替

李凱敏1，付桂明1,*，吳酬飛2，劉成梅1，萬 茵1，潘 菲1，鄭福平3,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院，江西 南昌 330047；2.湖州師范學院生命科學學院，浙江 湖州 313000；3.北京工商大學食品學院，北京 100048）

采用高通量測序技術對特香型白酒釀造過程中的真核微生物菌群演替動態變化進行分析。方法：分別于發酵窖池內采集底糟樣品（0、30 d）和表層與下層酒醅樣品（0、3、6、10、15、20、25、30 d），洗脫表面微生物，提取基因組DNA，進行聚合酶鏈式反應擴增和高通量測序分析。結果表明：在整個發酵周期內，酒醅中的真核微生物菌群多樣性與豐度呈現明顯下降趨勢，優勢菌目為Saccharomycetales（酵母目），優勢菌屬依次為Saccharomyces（酵母屬）、Pichia（畢赤酵母）、Galactomyces（耐堿酵母屬）；相比酒醅而言，底糟真核微生物菌群構成更為復雜，主要優勢菌群包括Saccharomycetales（酵母目）、Eurotiales（散囊菌目）、Capnodiales（煤炱目）和Tremellales（銀耳目）等；對整個發酵過程中的菌群結構進行主坐標分析，結果顯示表層酒醅與下層酒醅在真核微生物菌群結構上沒有明顯的差異。

特香型白酒；發酵過程；真核微生物；多樣性

白酒作為我國傳統優勢蒸餾酒，以谷物為原料，采用大曲、小曲或麩曲為發酵劑，用雙邊或固態糖化發酵，蒸餾取酒，經過貯存、勾兌生產出香氣濃郁的蒸餾酒，是世界著名的六大蒸餾酒之一，因釀酒原料、地理位置與釀造工藝的差異，所釀白酒呈現出不同的風味特點[1]；按香型可分為濃香型、清香型、醬香型、特香型[2]等。

特香型白酒是一種“濃頭醬尾清中間”、“三香具備尤不靠”的特殊香型，以四特、樟樹貢、臨川貢酒為主要代表。其釀造工藝不同于其他白酒，是以紅鍺條石建造窖池，“三進四出”的續渣發酵，混蒸混燒“四甑”生產工藝，以優質大米為原料進行釀酒[3-4]。特香型白酒窖池底部鋪有一層酒醅稱為底糟，底糟要在窖池底部發酵1 a以上才會啟封蒸酒，且底糟所蒸白酒香氣濃郁，常作為特香型白酒產品的調味酒。研究表明，微生物在白酒的釀造過程中發揮著重要作用[5]，分析釀酒過程中微生物菌群演替可以了解白酒的發酵機理，解析釀酒過程中的功能微生物[6]。傳統菌群分析采用涂布分離純菌株，再進行分子鑒定，生理生化鑒定，操作復雜，且最大的弊端在于絕大多數的微生物是不能夠被培養或者很難被培養，大量菌群的遺漏導致檢測結果不準確[7]。近年來，16S rRNA克隆建庫[8]、變性梯度凝膠電泳[9]、溫度梯度凝膠電泳[10]、高通量測序（high throughput sequencing，HTS）[11]等分子生物學技術的發展為環境微生物的檢測提供了條件。HTS是一種全新的測序技術，它能一次對多個樣品進行分析，具備一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子同時進行測序的能力，節省了諸多繁瑣的實驗步驟[12]。該方法具有通量高、快速、低成本等優點，廣泛應用于不同的環境中，例如土壤[13]、湖泊淤泥[14]等生態環境。近年來，HTS也逐步應用于傳統發酵食品中菌群多樣性研究，如香腸[15]、米酒[16]、醋[17]等發酵食品。

白酒釀造過程中存在大量微生物，其中霉菌、酵母菌等真核微生物在發酵過程中扮演重要角色。絲狀真菌產生大量淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等，可以大量水解淀粉與蛋白質，提高消化率與生理活性，甚至一些真菌對白酒風味物質的合成有很大貢獻[18-19]；釀酒酵母發酵可產生大量乙醇，而一些非釀酒酵母則可產生多種香氣成分[20]。目前有關特香型白酒微生物的研究較少，尚鮮見對特香型白酒釀造過程中真核微生物菌群的相關研究報道。本研究采用宏基因組學對特香型白酒釀造過程中酒醅與底糟中的真核微生物群落結構進行分析，為解析特香型白酒釀造過程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Soil DNA kit試劑盒 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀賽默飛世爾科技有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一儀器公司；HTS儀 美國Illum ina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采樣點為江西樟樹貢酒廠的生產窖池，取樣時間為2016年4—5月，樣品發酵時間分別為0 d（酒醅入窖當天）、3、6、10、15、20、25 d和30 d；窖池深度2 m；酒醅按縱向分表層（0～20 cm）與下層（80～180 cm）、窖池底糟（180～200 cm），按橫向分中心區域（中心區75 cm以內）和周邊區域（距池邊5～20 cm環帶）；發酵期間內窖池密封，取樣時使用取樣器通過取樣口直接插入酒醅進行取樣，不破壞窖池整體的密封環境，同區域取6 點樣均勻混合；混勻后，置無菌容器中于-80 ℃冰箱保藏。

1.3.2 樣品基因組DNA提取

分別稱取酒醅樣品2 g，用無菌水對微生物進行洗脫，并用玻璃珠破碎法，對樣品進行破碎處理，采用Soil DNA kit試劑盒進行提取宏基因組DNA。

1.3.3 目的區段擴增及高通量測序

根據實驗設計對18S rRNA基因進行擴增，采用引物SSU 1196R：TCTGGACCTGGTGAGTTTCC和SSU0817F：TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA[21]。為了對所有樣品進行區分，上游引物前加一段barcode序列。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 m in，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環；最后72 ℃延伸10 m in。PCR體系參見Liu Wenjun等[22]報道，PCR擴增結束后，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳純化，并對樣本濃度定量，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，利用M iSeq PE300平臺進行高通量測序分析。

1.4 數據分析

用M othur軟件以97%為劃定閾值對序列劃分操作分類單元（operational taxonom ic units，OUT），根據各樣品物種豐富度情況，利用得出的OTU結果計算樣品中生物多樣性指數、豐富度指數（Chao、ACE指數）、多樣性指數（Shannon、Sim pson指數）、覆蓋率指數（Coverage）等。此外，在測序前需要將各序列的引物和barcode去掉，并對序列長度進行篩選，以減少錯誤的測序，確保測序質量[12]。經過處理后的序列與SILVA數據庫進行比對，然后基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。使用加權UniFrac距離算法進行主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）[23]。

2 結果與分析

2.1 18S rDNA的擴增結果

圖1 基因組DNA的PCR擴增產物電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of PCR amplification products of genomic DNA

圖1是以提取的樣品宏基因組DNA為模板，對18S rDNA進行PCR擴增，由瓊脂糖凝膠電泳后的成像圖可以看出，17 個樣品長度均保持在550 bp左右，與目標片段相一致。

2.2 樣本序列及微生物多樣性分析

表1 樣品多樣性指數Table 1 Alpha-diversity indexes of m icrobial communities from fermented grain samp les

如表1所示，所有樣本的Coverage指數均達到0.99，證明本次測序覆蓋了樣本中絕大部分真核微生物，數據結果準確可靠。結果表明：底糟的Shannon指數最高，達到2.23（Shannon指數越高，多樣性越高），說明底糟樣品中的微生物多樣性要遠高于發酵期酒醅，可能是由于底糟不參與規律性的蒸餾出酒，經過多輪、長時間發酵，其微生物種類豐富、數量龐大[24]。從真核微生物多樣性上來看，發酵周期的前10 d，窖池內下層酒醅與表層酒醅樣品的微生物多樣性沒有明顯差異，從發酵10 d到發酵周期結束，窖池表層酒醅的微生物多樣性要明顯高于下層樣品。這可能是由于發酵前期窖池內整體變化保持一致，使得表層與下層酒醅真核微生物沒有較大的差異；到發酵中后期窖池處于低pH值、低氧含量、高酒精度等“不利”環境中，且隨窖池深度增加，酸和酒精含量逐漸增高、氧含量逐漸降低[25]，對微生物的抑制作用增強，以至于真核微生物多樣性越來越低。

圖2 不同發酵時期真核微生物在屬水平上的數目變化情況Fig. 2 Changes in eukaryotic m icroorganism s during different fermentation periods at genus level

圖2表明，剛入池發酵的酒醅樣品（0 d）中真核微生物多樣性最為復雜，OTU數達到28 種，隨著發酵的進行，酒醅中真核微生物種類呈逐漸遞減趨勢。這是由于剛入窖的酒醅中不僅含有大曲，還包含大米，稻殼，酒糟等釀酒原料，這些原料中富含大量的微生物，因此發酵0 d的酒醅中的微生物種類最高[18,26]。

發酵啟動階段（0、3 d），真核微生物多樣性出現大幅度下降，可能原因是微生物開始發酵后，由于采用隔絕空氣的厭氧發酵，氧氣含量均大幅度減少，大量好氧菌生長受到抑制，真核微生物多樣性顯著降低。隨后進入釀酒開始階段（3、6、10 d），真核微生物趨于穩定，沒有產生明顯的下降。這是由于能夠進行厭氧發酵而存活的酵母菌等真核微生物經過數天適應，開始大量生長，并開始發酵產生酒精等各種代謝產物，但積累量不大，不足以對酒醅理化性質進行大幅度改變，對微生物的抑制作用不強，所以該階段真核微生物菌群多樣性相對復雜且保持穩定[26]。

隨著發酵的進行，進入發酵中后期（15、20、25、30 d），菌群多樣性開始逐步降低，直到發酵周期結束后，真核微生物只有10 種存在。這是由于發酵進入了中后期，酒醅中的營養物質與氧氣消耗殆盡，同時積累了大量代謝產物，例如釀酒酵母生成大量的酒精、絲狀霉菌產生檸檬酸，醋酸菌和乳酸菌分別分泌產生醋酸、乳酸[26-27]等。這些代謝產物造成酒醅中微生物處于低pH值和高酒精環境中，生長受到抑制，使酒醅中真核微生物菌群變得更加單一。

2.3 發酵過程中酒醅優勢真核微生物變化情況分析

圖3 門水平（a）、目水平（b）、屬水平（c）上各樣品真核微生物菌群結構Fig. 3 Fungal communities of fermented grain samp les at phylum level (a),order level (b) and genus level (c)

對整個發酵周期的酒醅進行鑒定分析，門水平真核微生物菌群結構如圖3a所示，在酒醅入窖（0 d），主要真核微生物是由Ascomycota（子囊菌門，72.6%）、Zygomycota（接合菌門，24.6%）和Basidiomycota（擔子菌門，2.3%）構成；隨著發酵時間的延長，從發酵3 d起，Ascomycota成為酒醅中的唯一的優勢真核菌門。結果表明整個發酵周期內酒醅真核微生物菌群結構在門水平上較穩定。

如圖3b所示，在整個發酵過程中，Saccharomycetales（酵母目）與Eurotiales（散囊菌目）構成了主要的酒醅真核微生物菌群。Saccharomycetales從發酵0 d的52.9%，3 d內迅速升高至97.1%且維持到發酵結束；與此同時Eurotiales由發酵開始的19.2%迅速下降到2.1%，并隨著發酵時間的延伸繼續下降。由此可見，Saccharomycetales是整個釀酒過程中的絕對優勢菌，可能是由于酒醅發酵過程處于密封環境，進行厭氧固態發酵，且發酵后期酒醅環境惡劣，氧氣含量嚴重不足，酵母菌相比其他真核微生物具有更高的耐受性[20]。

如圖3c所示，在屬水平上Saccharomyces（酵母屬）、Galactomyces（耐堿酵母）和Pichia（畢赤酵母）是釀造過程中的優勢菌群；Saccharomyces具有發酵能力強，高產酒精能力，是釀酒過程中最主要的功能菌株；Pichia是釀酒過程中重要的產酯微生物[27]；Galactomyces（耐堿酵母）、Aspergillus（曲霉屬）和Thermoascus（熱子囊菌）隨發酵時間的延長呈現明顯下降趨勢，到發酵結束后豐度僅存2.9%、0.3%和0.1%左右；部分真核微生物在發酵中后期才被檢測出，例如Brettanomyces（生香酵母），發酵前期（0～10 d）未檢出，于發酵增香階段（15～25 d）才被檢測到；生香酵母是一類產酯酵母，是中國白酒風味中酯香的主要產生菌之一；有研究表明于特香型白酒酒醅中加入一定量的生香酵母可以有效提高所釀白酒香味成分的含量，且不會對原白酒風味產生任何不利影響，更有助于香味物質的積累[28]。

2.4 底糟真核微生物分析

對窖池底糟進行高通量測序分析，發現兩個底糟樣品微生物菌群結構、多樣性上沒有明顯的差異，僅在某些微生物的豐度上略有變化。結果表明Ascomycota（子囊菌門）、Zygom ycota（接合菌門）和Basidiom ycota（擔子菌門）是主要的優勢菌門（圖3a）；Ascomycota序列數高達90%以上，其次是Basidiomycota。共有25 個目的真核微生物被檢測到（圖3b），其中Saccharomycetales（酵母目）、Eurotiales（散囊菌目）、Capnodiales（煤炱目）和Tremellales（銀耳目）是優勢菌目。經過一輪釀酒發酵，Capnodiales豐度上稍有提高，而Saccharomycetales略有下降，其余菌群均未發生明顯改變。

圖3a表明，無論是酒醅還是底糟，Ascomycota均是其中真核微生物的主導門類，但是相較酒醅而言，底糟中含有更高豐度的Basidiomycota，主要原因是底糟長期處于窖池底層，進行厭氧發酵，水分含量高，更利于擔子菌的生長[29]。如圖3b所示，Saccharom ycetales雖在底糟樣品中也有最高的豐度，但要遠低于其在酒醅樣品中所占比例；Eurotiales和Capnodiales在底糟樣品中分別達到21.2%和6.2%，遠超其在酒醅中所占比例；且諸多真核微生物在僅在底糟中被檢測，例如Capnodiales、Cystofilobasidiales、Leucosporidiales、Liliopsida、Malasseziales。

在屬水平上（圖3c），Aspergillus（曲霉屬）、Brettanomyces（生香酵母屬）、Cladosporium（芽枝霉屬）、Galactomyces（耐堿酵母屬）、Thermoascus（熱子囊菌屬）等菌群在底糟中占到較高的比例。由于底糟微生物菌群構成豐富，富含大量風味成分，其蒸餾物作為特香型白酒產品的調味酒體，可以有效的增強產品酒的風味，使其后味爽凈，諸香協調，更具特色。

2.5 PCoA結果

圖4 所有樣品真核微生物菌群的PCoAFig. 4 PCoA of fungal communities in all sam p les obtained by using high throughput sequencing

PCoA可通過降維找出影響樣本群落組成差異的潛在主成分，用來研究樣本群落組成的相似性或差異性[23]。本研究通過PCoA對整個特香型白酒發酵過程中表層酒醅、下層酒醅和底糟的真核微生物菌群結構的相似性進行評估，如圖4所示，所有樣品在PCoA圖上分為3 個集群；酒醅（0 d）、酒醅（3～30 d）與底糟三者各集中于一簇，表現出明顯的差異；在整個固態發酵過程中，3～30 d表層與下層酒醅的真核微生物菌群結構沒有明顯的差異，表明特香型白酒酒醅真核微生物菌群構成不隨窖池深度的改變而發生明顯變化，具有整體性。

3 結 論

本研究采用高通量測序方法系統分析了特香型白酒釀造過程中表層酒醅、下層酒醅和底糟中的真核微生物菌群多樣性變化及其優勢菌群演替過程。結果發現在整個發酵過程中，Ascomycota是酒醅真核微生物的優勢菌門，由Saccharomycetales與Eurotiales構成，其中前者作為酒醅微生物的優勢菌目，主要包括Pichia、Galactomyces和Saccharomyces；且整個發酵過程中，表層酒醅與下層酒醅在真核微生物菌群結構上不存在顯著差異。

對底糟樣品進行測序分析，結果表明：相較酒醅而言，底糟中真核微生物菌群更為豐富、復雜，主要包括Ascomycota、Basidiom ycota兩個優勢菌門和Saccharomycetales、Eurotiales、Capnodiales、Tremellales 4 個優勢菌目。底糟所釀白酒作為特香型白酒產品酒的調味劑，更具特香型白酒特色，風味物質含量非常豐富，對其進行進一步分析來提高特香型白酒的風味非常有意義。對特香型白酒釀造過程中真核微生物的菌群結構和優勢菌的動態變化進行研究，對解釋特香型白酒產香機理、指導白酒生產、穩定產品質量具有重要的理論指導和實踐價值。在后續實驗研究中，可對發酵周期內酒醅的理化性質和風味成分做進一步分析，結合酒醅中微生物菌群的演替，為解釋特香型白酒產香機理提供理論支持。

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Dynamics of Eukaryotic M icrobial Community Succession during the Traditional Fermentation of Special-Flavor Liquor

LI Kaimin1, FU Guiming1,*, WU Choufei2, LIU Chengmei1, WAN Yin1, PAN Fei1, ZHENG Fuping3,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Food Sciense and Technology, Nanchang University,Nanchang 330047, China; 2. College of Life Science, Huzhou University, Huzhou 313000, China;3. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

High throughput sequencing (HTS) was used to investigate the dynam ics of eukaryotic m icrobial community succession during the fermentation process of special-flavor liquor. M icrobial samples were collected by washing the surface of fermented grains from the bottom of fermentation cellar (0 and 30 d) and from the top and m iddle (0, 3, 6, 10, 15, 20, 25,and 30 d), and their genetic DNA was then extracted. The 18S rRNA regions of fungal rRNA genes were amplified by PCR.The dom inant m icrobial populations and their succession dynam ics were determ ined by pyrosequencing. The diversity and abundance index of fungal microbial communities showed a decreasing tendency during the fermentation process. Moreover,Saccharomycetales was the predom inant order and Saccharomyces, Pichia and Galactomyces were the predom inant genra on top and middle fermented grains during the whole fermentation process. The eukaryotic m icrobial communities identified from bottom fermented grains were more complicated, w ith the dom inant species being Saccharomycetales, Eurotiales,Capnodiales and Tremellales. Furthermore, principal coordinate analysis (PCoA) results revealed that no obvious difference in fungal communities between the top and m iddle fermented grains was observed during the fermentation process of special-flavor liquor.

special-flavor liquor; fermentation process; eukaryotic m icrobial; diversity

10.7506/spkx1002-6630-201722020

TS26

A

1002-6630（2017）22-0131-06

李凱敏, 付桂明, 吳酬飛, 等. 特香型白酒釀造過程中真核微生物菌群演替[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 131-136.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722020. http://www.spkx.net.cn

LI Kaim in, FU Guim ing, WU Choufei, et al. Dynam ics of eukaryotic m icrobial community succession during the traditional fermentation of special-flavor liquor[J]. Food Science, 2017, 38(22): 131-136. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722020. http://www.spkx.net.cn

2016-12-14

食品科學與技術國家重點實驗室開放課題（SKLF-KF-201612）；江西省教育廳科技重點項目（GJJ150018）

李凱敏（1994—），男，碩士，研究方向為發酵工程。E-mail：13767010782@163.com

*通信作者：付桂明（1972—），男，教授，博士，研究方向為微生物。E-mail：fuguim ing@ncu.edu.cn鄭福平（1969—），男，教授，博士，研究方向為風味化學。E-mail：zhengfp@th.bubu.edu.cn