α-生育酚殼聚糖納米粒的制備、表征及體外緩釋抗氧化性能

陳文彬，嚴文靜，徐幸蓮，章建浩*

（國家肉品質量與安全控制工程技術研究中心，農業部畜產品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，南京農業大學食品科技學院，南京 210095）

α-生育酚殼聚糖納米粒的制備、表征及體外緩釋抗氧化性能

陳文彬，嚴文靜，徐幸蓮，章建浩*

（國家肉品質量與安全控制工程技術研究中心，農業部畜產品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，南京農業大學食品科技學院，南京 210095）

α-生育酚作為天然抗氧化劑和營養強化劑被廣泛應用于食品領域，但由于其對氧氣、光照、金屬離子等環境敏感，易快速失活，且不溶于水，極大地限制了其應用范圍。本研究采用乳化-離子凝膠兩步法制備α-生育酚殼聚糖納米粒，將α-生育酚進行包埋。以顆粒平均粒徑、多分散系數、表面電位為參考指標，通過單因素及正交試驗考察殼聚糖（chitosan，CS）質量濃度、α-生育酚質量濃度、CS與三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）質量比、pH值、攪拌速率等因素對納米顆粒平均粒徑和包封率的影響，確定最優制備工藝。采用動態光散射儀、掃描電鏡、傅里葉紅外光譜對納米顆粒進一步表征，并考察其體外釋放性能和抗氧化效果，以期為α-生育酚在腌臘肉制品后期貯藏過中的脂質抗氧化應用提供理論基礎。結果表明，α-生育酚殼聚糖納米粒最優制備工藝條件為CS質量濃度1 mg/m L、α-生育酚質量濃度1 mg/m L、CS與TPP質量比7∶1、CS初始pH值為4.5、攪拌速率900 r/m in。所得納米顆粒平均粒徑214 nm，包封率51.65%。紅外光譜表明CS與三聚磷酸鈉靜電吸附，生育酚被包封。掃描電鏡下形態學結構大小均勻，呈規則球形。體外釋放實驗和抗氧化實驗表明α-生育酚殼聚糖納米粒具有緩釋抗氧化作用。

α-生育酚；殼聚糖納米粒；表征；緩釋；抗氧化

納米技術是近年來極具發展潛力的新興技術，目前已被廣泛應用于化工、電子、醫藥、食品等領域[1]。納米粒是納米技術中較為常用的載體之一，在微粒給藥系統以及活性包裝領域的應用研究日趨普遍。基于不同方法制備的納米顆粒具有較好的生物相容性、靶向性和緩釋性，能有效提高諸多生物活性物質的穩定性及生物利用率[2-3]。在食品領域，納米粒已作為氨基酸、蛋白質、維生素等功能性營養助劑的新型輸送載體，具有提高活性成分物理靶向性，增加其穩定性，控制其緩慢釋放等優勢[4]。尤其對難溶性活性成分具有良好的增溶作用，可提高其生物利用度，增強作用效果[1,5]。此外，在食品活性包裝領域，納米粒也常作為防腐劑、抗氧化劑、抑菌劑的載體制備具有抗氧化抑菌活性的緩釋包裝膜[6]。通過包裝材料向食品中緩慢釋放活性物質，具有消耗活性成分少，卻能起到長效作用的優勢[7]。

殼聚糖（chitosan，CS）是甲殼素脫乙酰得到的天然多糖中唯一的陽離子堿性氨基多糖，安全無毒，具有良好的生物相容性和生物降解性，可包封帶負電荷高聚物藥物，是一種優良的藥物載體[8]。相比于蛋白、多肽、磷脂等較難大量獲取的壁材，CS來源廣泛，成本低廉，將其作為壁材包埋藥物，其制備工藝簡單，且陽離子堿性氨基可受環境pH值的影響實現所包埋藥物的控制釋放[9]。此外，CS本身具有較好的成膜性和廣譜抗菌性，適用于可食性涂膜緩釋材料的大批量制備[10]。近年來CS逐漸成為生物醫學工程以及藥物、基因載體等領域研究較多的材料之一，尤其是在藥物的控釋、緩釋、靶向以及智能釋藥系統中的應用受到了廣泛的關注[11-12]。王舒舒[13]利用離子凝膠法制備了苦丁茶多酚-殼聚糖納米粒，增加了苦丁茶多酚的穩定性，提高了生物利用度，同時還具有緩釋作用。武陶[10]通過離子凝膠法制備的山梨酸納米防腐顆粒具有較好的穩定性和緩釋性，擴大了山梨酸在肉品保鮮上的應用。Seyed等[14]用兩步法制備殼聚糖納米粒，將牛至精油包埋成納米顆粒，起到了緩釋精油活性成分的效果。殼聚糖納米粒的主要制備方法包括乳化交聯法、乳化液滴法、沉淀析出法、反相膠束法、化學修飾殼聚糖法和離子凝膠法等[15]。與其他方法相比，離子凝膠法能在溫和條件下生成平均粒徑幾十至數百納米的殼聚糖納米粒，不使用有機溶劑和醛類交聯固化劑，反應過程簡便迅速，極具實用價值[8,16]。

α-生育酚是自然界廣泛存在的脂溶性維生素，具有明顯的抗氧化能力，能起到清除自由基的作用，同時還具有促進人體新陳代謝、增強機體耐力、提高免疫力、美容護膚以及抗衰老等生理功能，因此常常被作為天然抗氧化劑和營養助劑應用于食品中，美國聯邦法規將其分類為公認安全的食品添加劑[17]。但是由于α-生育酚對光、氧、金屬離子敏感，且不溶于水，極大地限制了其生物利用度。為此，越來越多的研究者采用納米技術將α-生育酚之類的活性物質進行包埋，制備成納米顆粒，達到長效緩釋的作用，以提高其生物利用度[18-19]。

本研究選擇α-生育酚作為被包埋的活性物質，通過乳化-離子凝膠兩步法制備α-生育酚殼聚糖納米粒（α-tocopherol chitosan nanoparticles，α-TOCCSNPs），考察影響其形成的主要因素。通過正交試驗優化制備工藝，測定其包封率及緩釋抗氧化性能，以期將α-TOCCSNPs應用于食品貯藏中長效抗氧化防腐保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS（脫乙酰度≥90%） 上海瑞永生物科技有限公司；三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）Sigma A ldrich試劑（中國）有限公司；α-生育酚 上海阿拉丁試劑有限公司；氫氧化鈉、冰乙酸等均為分析純；所用水為超純水。

1.2 儀器與設備

MS-01加熱型磁力攪拌器 美國精騏有限公司；A lleg ra64R高速冷凍離心機 美國Beckm an公司；UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司；Zetasizer Nano-Zeta電位儀 英國馬爾文公司；tensor27傅里葉紅外光譜儀 德國布魯克公司；evo18掃描電子顯微鏡德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 α-TOCCSNPs的制備

根據Hosseini等[14]和Keaw chaoon等[20]的方法稍作改動，采用乳化-離子凝膠兩步法制備。

稱取一定量的CS粉末，溶于體積分數1%的冰乙酸溶液室溫下攪拌過夜至澄清溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，用1 mol/L的NaOH溶液調pH值為4.8，配制成5 mg/m L的CS溶液。根據實驗設計，用超純水將CS溶液稀釋成不同質量濃度梯度后備用。

稱取一定量的TPP粉末，用超純水溶解得到與CS溶液質量濃度一一對應的濃度梯度的交聯劑溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，2～4 ℃冰箱保存備用。

量取一定量的CS溶液于錐形瓶中，100 W超聲處理10 m in。置于恒溫磁力攪拌器上，加入質量分數2%的Tween 80，60 ℃加熱攪拌30 m in，得到均一溶液。

稱取一定量的α-生育酚，溶于無水乙醇。配制不同質量濃度的α-生育酚溶液，緩慢加入CS溶液中，持續溫和攪拌。

將制得的CS與生育酚的混合溶液置于磁力攪拌器上冰水浴攪拌，用注射器往其中逐滴加入2～4 ℃的TPP溶液，滴加速度1滴/s，溫和攪拌30 m in，得到淡藍色乳光溶液即為α-TOCCSNPs懸液。

按以上相同的步驟，往CS溶液中滴加TPP溶液，但不加入α-生育酚，即得到殼聚糖空白納米粒（CSNPs）溶液。

1.3.2 α-TOCCSNPs理化性能表征

1.3.2.1 平均粒徑、多分散系數及表面電位的測定

將在不同條件下制備得到的納米粒溶液用馬爾文納米粒度基于動態光散射（dynam ic light scattering，DLS）原理測定儀測定其水合平均粒徑、表面電位以及多分散系數。

1.3.2.2 形態學觀察

通過掃描電子顯微鏡觀察納米粒的外觀形態：取一滴懸浮液，滴于光面鋁架上，自然干燥后噴金處理，置于掃描電鏡樣品臺上，加速電壓為5 kV，觀察其形態。

1.3.2.3 紅外光譜分析

通過傅里葉紅外光譜檢測分析CS、CSNPs、α-TOCCSNPs的結構變化。取CS、CSNPs和α-TOCCSNPs樣品置于液體樣品池中，放入樣品室，使用紅外目標自動識別附件掃描64 次，測定紅外光譜。

1.3.3 α-生育酚包封率的測定

1.3.3.1 α-生育酚溶液標準曲線的繪制

精確稱取α-生育酚50 mg，用無水乙醇溶解，定容至100 m L，配制成0.5 mg/m L的儲備液。精確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L儲備液至10 m L棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，作為待測液。以無水乙醇為空白在292 nm波長處分別測定吸光度，得到α-生育酚吸光度與質量濃度標準曲線方程為：Y=7.594 3X-0.045 8（R2=0.999 4）。

1.3.3.2 α-TOCCSNPs包封率測定

根據Keaw chaoon等[20]所述方法，采用紫外分光光度法測定α-生育酚的含量。取100 μL α-TOCCSNPs懸液于10 m L離心管中，加入5 m L 2 mol/L HCl溶液，95 ℃煮沸30m in，冷卻，加入1 m L無水乙醇混合均勻，用高速離心機在25 ℃、9 000 r/m in條件下離心5 m in。取上清液用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內進行光譜掃描測定，可通過α-生育酚溶液標準曲線和292 nm波長處的吸光度計算得到α-生育酚的含量。用等體積空白納米粒懸液作為空白樣以同樣的方法測定。通過公式（1）計算其包封率（encapsulation efficiency，EE）：

式中：m總為體系中α-生育酚的總質量/mg；m游為體系中游離的α-生育酚質量/mg。

1.3.4 納米粒體外緩釋性能分析

參照文獻[20-22]所述方法，略微改動。在不同pH值的緩沖液：醋酸鹽緩沖液（pH 3.5）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、硼酸鹽緩沖液（pH 9.18）中分別進行α-TOCCSNPs的體外緩釋性能測定。取500 μL α-TOCCSNPs分散溶液于1.5 m L離心管中25 ℃、9 000 r/m in離心5 m in，取上清液，加入800 μL緩沖液重懸，室溫下孵化。每隔一定時間將樣品在25 ℃、9 000 r/m in離心5 m in，取800 μL上清液于10 m L離心管中，加入5 m L緩沖液，用紫外分光光度計在200～400 nm波長處掃描測定，根據α-生育酚標準曲線計算其釋放量，根據公式（2）計算其累計釋放率。每次取樣分析后往原離心管中補充等量新鮮的緩沖液，重懸后繼續孵化。

式中：Mt為每個時間點測得的α-生育酚累計釋放量；t為體外釋放時間；M0為初始載α-生育酚含量。

1.3.5 α-TOCCSNPs體外抗氧化性能分析

參照Esmaeili等[23]的方法進行DPPH自由基清除率測定，略微改動。將9 m L質量濃度為1 mg/m L的α-生育酚溶液與含等量α-生育酚的殼聚糖納米粒溶液各自加入3 m L濃度為10-4m o l/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d ipheny l-2-p ic ry lhyd razy l，DPPH）甲醇溶液得到混合液。將混合液放入暗室反應30、60、90、120、150 m in，用紫外分光光度計分別測定517 nm波長處混合液的吸光度。每個樣品做6 次平行實驗，取平均值。DPPH自由基清除率根據公式（3）計算：

式中：A0為空白DPPH在517 nm處的吸光度；A517nm為樣品溶液在517 nm處的吸光度。

1.3.6 單因素試驗和正交試驗設計

1.3.6.1 單因素試驗

選取因素：攪拌速率500 r/min、CS質量濃度1.5 mg/mL、TPP質量濃度1.5 mg/m L、CS與TPP質量比5∶1、α-生育酚質量濃度1.0 mg/m L、CS溶液pH 4.8，固定以上條件，考察單一因素對殼聚糖納米粒平均粒徑、表面電位及包封率的影響。各因素取值分別為CS質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/m L）、攪拌速率（300、500、700、900、1 100 r/m in）、pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、CS與TPP質量比（1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1）、α-生育酚質量濃度（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/m L）。

1.3.6.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取CS質量濃度、CS與TPP質量比、pH值、α-生育酚質量濃度為主要因素，以平均粒徑和包封率為評價指標進行正交試驗[24-25]。

表1 L9（34）正交試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.4 數據分析

使用統計分析軟件SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析，使用Excel 2013、Origin 2016對實驗數據進行作圖分析，每組實驗樣品測定3 次。

2 結果與分析

2.1 α-TOCCSNPs制備單因素試驗結果

2.1.1 CS對納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖1 CS質量濃度對納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 1 Effect of CS concentration on average particle size and surface potential

由圖1可知，α-TOCCSNPs平均粒徑及表面電位都隨CS質量濃度的增加而增大。主要原因是隨著CS溶液質量濃度增大，CS分子間距減小，分子間氫鍵作用力增強，較多的分子鏈間的交聯增多，隨后與單個TPP分子結合形成顆粒較大的粒子[26]。此外，由于CS分子的氨基質子化作用，使得溶液整體帶正電荷。CS濃度越大，體系中帶正電荷的分子越多，溶液表面電位呈現增大的趨勢[27]。

2.1.2 CS與TPP質量比對納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖2 CS與TPP質量比對納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 2 Effect of mass ratio betwen CS and TPP on average particle size and surface potential

由圖2可知，隨著CS與TPP質量比的減小，即隨著TPP質量的增加，納米粒平均粒徑呈現先下降后顯著上升的趨勢，表面電位呈現顯著減小的趨勢。當CS與TPP質量比為9∶1時，少量帶負電的TPP磷酸基團與過量CS分子鏈上帶正電的質子化氨基基團結合，但是由于交聯密度小，氨基結合位點未被充分結合，形成納米顆粒較為松散。隨著TPP質量的增加，體系中負電基團增多，與CS鏈上的氨基結合位點充分交聯。當CS與TPP質量比為7∶1時，交聯密度增大，同一分子鏈上未被結合的氨基位點被結合，鏈間距進一步縮小靠攏，使得納米粒平均粒徑進一步減小，形成平均粒徑為152 nm單分散性較好的納米粒子，表面電位32.2 mV，體系穩定。當TPP的質量繼續增加時，CS分子鏈上的交聯位點被充分結合，額外的磷酸基團引起更多的CS分子參與到納米粒的交聯當中，使得粒子平均粒徑顯著增加。當TPP多到一定程度時，粒子平均粒徑已經從納米級增加到微米級，粒子表面電荷密度無法維持體系的穩定，粒子間靜電排斥力無法抵抗重力作用從而產生絮狀沉淀[28]。離子表面電荷是維持體系穩定的重要因素，TPP質量的增加使得CS上的氨基被中和，表面電位顯著下降。

2.1.3 pH值對納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖3 CS溶液pH值對納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 3 Effects of initial CS solution pH on average particle size and surface potential

由圖3可知，CS溶液初始pH值從3.5升到5.5，納米粒平均粒徑先下降后急劇上升，表面電位呈現顯著下降趨勢。CS溶液的初始pH值對于殼聚糖納米粒的形成至關重要[28-29]。在酸性環境下，H+與CS分子鏈上的—NH2結合，氨基質子化形成聚電解質溶液，使得—NH3+與TPP中帶負電的磷酸基團得以交聯形成pH值可控的納米顆粒。當pH值小于4.5時，強質子化作用使得CS分子鏈上氨基被充分質子化，溶液正電荷密度較大，表面電位較高，分子內靜電排斥作用較強，CS分子鏈得以伸展，導致形成平均粒徑稍大的α-TOCCSNPs。當pH值在4.5～5之間時，相對減弱質子化作用使得分子間排斥力減弱，正負離子交聯作用大于排斥作用，納米粒平均粒徑進一步減小。在pH值為5時，平均粒徑達到最小203 nm。而當pH值繼續增大，CS分子中—NH3+減少，CS與TPP間的交聯作用變小，易形成大顆粒絮狀沉淀，溶液表面電位的持續下降導致體系穩定性顯著下降。

2.1.4 攪拌速率對納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖4 攪拌速率對納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 4 Effect of stirring speed on average particle size and surface potential

由圖4可知，當攪拌速率不斷增大時，α-TOCCSNPs平均粒徑呈現整體減小后略微增大的趨勢，表面電位呈現增大的趨勢。較低的攪拌速率使得通過逐滴滴加法制備的α-TOCCSNPs在交聯劑TPP剛滴入CS溶液中時，無法完全分散，導致局部TPP濃度過高，易產生凝聚，形成平均粒徑較大的顆粒[25]。隨著攪拌速率的增大，加入的TPP液滴被分散均勻，同時部分長鏈CS分子也會在高攪拌速率下斷裂成短鏈分子。從而使得CS與TPP的帶電基團充分交聯形成平均粒徑更小的納米顆粒。在900 r/m in轉速時，顆粒平均粒徑達到最小172 nm，此時表面電位為33.4 m V。當轉速進一步增大時，其平均粒徑有略微上升，可能是因為高轉速下的高剪切力破壞了粒子間的靜電排斥力及水化層阻隔，造成了粒子間的聚集，使得粒子單分散性下降[26]。此外，隨著轉速的增大，使得CS分子在醋酸溶液中充分溶解，質子化作用使得正電荷密度變大，最終納米顆粒表面電位增大。

2.1.5 α-生育酚對納米粒平均粒徑及表面電位的影響

由圖5可知，隨著α-生育酚質量濃度的增大，納米粒平均粒徑呈整體下降后略有上升的趨勢，表面電位呈下降趨勢。當α-生育酚質量濃度為1.25 mg/m L時，所得納米粒平均粒徑最小，為208 nm。由于α-生育酚分子含酚羥基，其與CS分子間會形成氫鍵，兩者的結合加上TPP的交聯作用，促進了α-TOCCSNPs的形成[30]。α-生育酚質量濃度的增加，使得CS分子中更多的氨基被結合，從而在一定程度上降低了表面電位。但在一定量CS的體系中，所能形成的納米粒數量有限。隨著被包埋的α-生育酚達到飽和，剩余的α-生育酚分子吸附于納米粒表面，一定程度上增大了顆粒水合平均粒徑[31]。

圖5 α-生育酚質量濃度對納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 5 Effect of α-tocopherol concentration on average particle size and surface potential

2.2 正交試驗結果

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design w ith experimental results

根據表2結果，采用極差分析法分析正交試驗數據。各因素對顆粒平均粒徑的影響主次因素為：CS質量濃度＞CS與TPP質量比＞pH值＞α-生育酚質量濃度。各因素對包封率影響主次因素為：CS質量濃度＞pH值＞α-生育酚質量濃度＞CS與TPP質量比。按照平均粒徑越小為優的原則，最優工藝組合為A1B2C2D3，制得的α-TOCCSNPs平均粒徑約為153 nm，包封率為44.51%。按包封率越高為優的原則，最優工藝組合為A1B2C2D2，制得的α-生育酚納米粒平均粒徑約為214 nm，包封率為51.65%。為制備較高包封效果的納米粒，最終確定選用最優工藝為A1B2C2D2，即CS質量濃度1.0 mg/m L，CS與TPP質量比為7∶1，CS初始pH值為4.5，α-生育酚質量濃度為1.0 mg/m L。

2.3 α-TOCCSNPs的表征

2.3.1 最優工藝條件下制得的納米粒平均粒徑分布及表面電位

圖6 最優工藝條件下α-TOCCSNPs粒徑分布圖Fig. 6 Average particle size distribution of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles p repared under the op timal conditions

圖7 最優工藝條件下α-TOCCSNPs表面電位圖Fig. 7 Zeta potential distribution of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles prepared under the optimal conditions

如圖6、7所示，α-TOCCSNPs平均粒徑為215 nm，多分散系數為0.275，小于0.3，表面電位為31.1 m V，大于30 mV，表明在最優工藝制備條件下納米顆粒分散性良好，粒徑分布均勻，體系穩定，適用于后期研究[32-33]。

2.3.2 納米粒掃描電鏡圖

圖8 α-TOCCSNPs掃描電鏡圖Fig. 8 SEM image of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles

從圖8可以看到，制備的納米顆粒接近球形，分散性良好，粒徑分布均勻，與DLS測得結果一致。

2.3.3 紅外光譜分析

圖9 CS、CSNPs、α-TOCCSNPs紅外光譜圖Fig. 9 FTIR spectra of CS, CSNPs and α-TOCCSNPs

由圖9可見，CS溶液、CSNPs、α-TOCCSNPs在特征峰吸收區3 000～3 500、1 500～1 700、1 000～1 500 cm－1有著不同的吸收峰。吸收峰在3 300～3 450 cm－1段與CS分子中羥基、氨基、酰胺基的伸縮振動有關[34]。CS在此處的吸收峰為3 402.15 cm－1，而在CSNPs和α-TOCCSNPs中，該峰轉移到了3 346.31 cm－1和3 313.45 cm－1處，分子內、分子間氫鍵的作用使得伸縮振動頻率向低波數方向移動，峰形變寬，表明了CS與TPP之間的氫鍵作用加強。α-TOCCSNPs比CSNPs多轉移了32.86 cm－1，可能是α-生育酚與CS分子中未被交聯的氨基基團相互作用的結果[34]。在1 500～1 700 cm－1段，CS吸收峰為1 695.52 cm－1，而CSNPs和α-TOCCSNPs的吸收峰轉移到了1 637.49、1 608.75 cm－1處，表示在CSNPs和α-TOCCSNPs中，TPP的磷酸基團與CS的—NH2、—CONH2都發生了交聯。在1 379.67 cm－1處，α-TOCCSNPs出現了一個小峰，是由于在α-生育酚分子的酚羥基發生面內彎曲振動所致，說明α-生育酚的—OH與CS分子間存在相互作用[35]。CS形成CSNPs和α-TOCCSNPs后還出現了1 261.47 cm－1和1 242.67 cm－1的峰，表示了C—N發生伸縮振動，說明了氨基在CSNPs和α-TOCCSNPs形成的過程中發生了交聯作用。另外，在1 053.2、1 012.54 cm－1處，α-TOCCSNPs出現了C—O—C的對稱拉伸，再次說明了CS與α-生育酚之間也存在相互作用，也證明了α-生育酚被成功包埋形成α-TOCCSNPs中[36]。

2.3.4 體外緩釋性能

圖10 不同pH值緩沖液條件下α-TOCCSNPs累計釋放曲線Fig. 10 Cumulative release curve of α-tocopherol chitosan nanoparticles at different buffer pH values

緩釋性能是載藥納米顆粒的重要性能指標，其可以保持活性物質在體系中緩慢釋放，達到長效作用。圖10中，α-TOCCSNPs在不同pH值的緩沖液環境中有著不同的緩釋效果[37]。在0～12 h內，納米粒表現出明顯的突釋效應，由于納米粒表面有部分α-生育酚附著，較易從體系中釋放出來，前期α-生育酚的累計釋放量很高[23]。在

24 h后，納米粒進入緩釋階段且不同pH值環境下的納米粒呈現出不同的緩釋速度。載藥顆粒的藥物釋放分為體系瓦解、表面侵蝕、去吸附作用、擴散等階段。因此，體系中藥物釋放的關鍵在于藥物從顆粒中向外界介質擴散的過程以及聚合物基質的降解。在pH值為7.4的緩沖液中，α-生育酚緩釋量明顯小于在pH值為3.5和9.18緩沖液中的釋放量。這是因為在酸性介質中，高濃度的H+滲透進入納米粒，發生強質子化作用，使得質子化—NH3+之間的排斥力不斷加大，最終導致納米粒膨脹破裂，促進了α-生育酚的較大釋放。而在堿性介質中，由于OH-的作用，殼聚糖鏈上的氨基發生較強的去質子化作用，導致CS與TPP之間的交聯作用被弱化甚至消失，納米顆粒逐步被破壞，α-生育酚得到大量的釋放[23,38]。綜上可得，α-TOCCSNPs是具有較好的緩釋作用，且其釋放量可通過pH值進行調控，達到控制釋放的目的[21]。

2.3.5 體外抗氧化性能

圖11 α-TOCCSNPs DPPH自由基清除率Fig. 11 DPPH free radical scavenging effect of α-tocopherol chitosan nanoparticles

由圖11可得，α-生育酚和α-TOCCSNPs進行的體外DPPH自由基清除實驗中，α-TOCCSNPs的自由基清除率比未包埋的α-生育酚低是因為納米粒中的抗氧化劑釋放需要一定的時間，這也印證了其具有緩釋作用[39]。α-生育酚是一類與自由基能夠發生快速結合的非酶類自由基清除劑。在60 m in后，α-生育酚的DPPH自由基清除率基本保持不變，說明α-生育酚已被反應完畢，失去了繼續抗氧化的作用。而α-TOCCSNPs在30～150 m in內具有持續的抗氧化作用，且DPPH自由基清除率不斷上升[23]。它在延長抗氧化作用時間的同時還有效地保護了抗氧化劑不被破壞，實現了α-生育酚的長效抗氧化作用[21]。

3 結 論

本研究通過乳化-離子凝膠兩步法成功制備了α-TOCCSNPs，并通過正交試驗優化了其制備工藝：CS質量濃度1 m g/m L，α-生育酚質量濃度1 mg/m L，CS與TPP質量比7∶1，CS初始pH值為4.5，攪拌速率900 r/m in。所得納米顆粒平均粒徑為214 nm，包封率為51.65%。此外，通過體外緩釋抗氧化實驗證明，α-TOCCSNPs是可受pH值調控具有緩釋效果的納米材料，可有效延長生育酚的抗氧化效果，提高其利用率，解決其在諸多應用中的環境限制，為將其應用于腌臘肉制品、果蔬等食品長效抗氧化活性包裝提供較好的指導意義[40-42]。

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Preparation, Characterization and in Vitro Sustained Antioxidant Activity of α-Tocopherol-Loaded Chitosan Nanoparticles

CHEN Wenbin, YAN Wenjing, XU Xinglian, ZHANG Jianhao*
(Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control,Key Lab of Meat Processing and Quality Control, M inistry of Agriculture, National Center of Meat Quality and Safety Control,College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

α-tocopherol is a natural antioxidant and nutritional supplement and has been w idely used in the food field.However, its scope of application is greatly limited due to its high susceptibility to environmental factors including oxygen,light and metal ions, ease of inactivation and water insolubility. In this study, α-tocopherol was encapsulated in chitosan nanoparticles (α-TOCCSNPs) by emulsification-ionic gelation method. To optim ize the process, the average particle size(APS) and encapsulation efficiency (EE) were investigated as a function of chitosan (CS) concentration, α-tocopherol concentration, mass ratio of CS to sodium tripolyphosphate (TPP), pH and stirring speed by one-factor-at-a-time and orthogonal array designs. The CS nanoparticles were characterized by dynam ic light scattering (DLS), Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and scanning electron m icroscope (SEM) and evaluated for release profi les and antioxidant properties in vitro in order to provide a theoretical basis for the application of α-tocopherol to inhibit lipid oxidation in cured meat products during storage. The results demonstrated that the optimal conditions for preparing α-tocopherol loaded CS/TPP nanoparticles were as follow s: CS concentration, 1 mg/m L; mass ratio of CS to TPP, 7:1; pH, 4.5, and stirring speed, 900 r/m in. The APS and EE of α-tocopherol loaded nanoparticles were 214 nm and 51.65%, respectively under the optim ized conditions. The FTIR spectrum confi rmed that the encapsulation of α-tocopherol was achieved by electrostatic adsorption, and the SEM observation showed uniform average particle size distribution and regular spherical morphology.The α-tocopherol chitosan nanoparticles had sustained antioxidant activity in vitro.

α-tocopherol; chitosan nanoparticles; characterization; sustained release; antioxidant activity

2016-09-26

國家公益性行業（農業）科研專項（201303082-2）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

陳文彬（1992—），男，碩士研究生，研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail：2014108074@njau.edu.cn

*通信作者：章建浩（1961—），男，教授，博士，研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201722033

TS201.1

A

1002-6630（2017）22-0216-08

陳文彬, 嚴文靜, 徐幸蓮, 等. α-生育酚殼聚糖納米粒的制備、表征及體外緩釋抗氧化性能[J]. 食品科學, 2017, 38(22):216-223. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722033. http://www.spkx.net.cn

CHEN Wenbin, YAN Wenjing, XU Xinglian, et al. Preparation, characterization and in vitro sustained antioxidant activity of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles[J]. Food Science, 2017, 38(22): 216-223. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722033. http://www.spkx.net.cn