響應面優化酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖的工藝及抗氧化活性測定

孫玉林，文 菁，趙 娟，田 麗，李 銳，陳道海,*

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048；2.嶺南師范學院環北部灣海洋藥用動物保護與利用研究所，廣東 湛江 524048）

響應面優化酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖的工藝及抗氧化活性測定

孫玉林1,2，文 菁1,2，趙 娟1,2，田 麗1，李 銳1，陳道海1,2,*

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048；2.嶺南師范學院環北部灣海洋藥用動物保護與利用研究所，廣東 湛江 524048）

研究胰蛋白酶提取虎斑烏賊肌肉多糖的工藝及體外抗氧化活性，并與水提法和堿提法的多糖進行比較。在單因素試驗基礎上以響應面法優化酶法提取多糖的工藝，結果顯示最佳工藝條件為：酶解溫度55 ℃、料液比1∶40（g/m L）、酶解時間4 h、加酶量2.5%，此時虎斑烏賊肌肉多糖得率為4.15%，優于水提法和堿提法的多糖得率。體外抗氧化活性研究表明酶法提取的多糖比堿提和水提的多糖具有更好的抗氧化活性，當多糖質量濃度為4 mg/m L時，水提、堿提和酶提虎斑烏賊肌肉多糖對·OH的清除率分別為50.15%、55.14%和89.47%，其IC50值分別為4.51、3.56 mg/m L和0.82 mg/m L；對DPPH自由基的清除率分別為28.89%、31.48%和40.80%，其IC50值分別為16.66、15.43 mg/m L和11.50 mg/m L；對O2-·的清除率分別為75.43%、81.63%和97.00%，其IC50值分別為1.15、0.69 mg/m L和0.29 mg/m L；還原力大小分別為0.134、0.156和0.193。綜合分析表明，酶提法得到的多糖得率較高且具有較好的體外抗氧化活性。

虎斑烏賊；多糖；酶法提取；響應面；抗氧化活性

虎斑烏賊（Sepia pharaonis）隸屬軟體動物門（M o llusca），頭足綱（Cephalopoda），十腕目（Decapoda），烏賊科（Sepiidae），烏賊屬（Sepia）[1]，分布在菲律賓群島、馬來群島、大洋洲北部、東部和西部、印度近海、紅海以及我國的南海海域[2]。據《本草綱目》記載，烏賊肉具有活血化淤、補氣、補血、滋陰之功效，經常食用能益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能[3]；烏賊骨（海螵蛸）具有除濕、斂瘡、治療胃病等作用；烏賊墨有抗癌、抗輻射、止血等作用。因此，虎斑烏賊是一種營養價值和經濟價值均較高的優良海產品品種。

多糖又稱多聚糖，是一種由醛糖和（或）酮糖通過脫水形成糖苷鍵連接而成的鏈狀聚合物，具有廣泛的生物活性[4]，如抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎等[5-11]。天然多糖類化合物由于其來源廣泛、安全低毒、提取效率高、對自由基具有清除作用等優點，有望作為無危害、綠色、新型抗氧化劑。近年來，除對擬目烏賊墨多糖[12]和性腺多糖[13-14]以及虎斑肌肉糖蛋白[15]的抗氧化活性有個別報道外，對虎斑烏賊肌肉多糖抗氧化活性研究鮮見報道。

本實驗采用酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖，在對酶解溫度、料液比、酶解時間和加酶量進行單因素試驗基礎上，采用響應面法優化提取工藝。同時與水提法和堿提法進行比較，以清除羥自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）能力和還原力大小作為評價指標，分析酶法提取對虎斑烏賊肌肉多糖體外抗氧化性的影響，同時利用傅里葉紅外光譜對其結構進行初步探討，以期為虎斑烏賊肌肉多糖在功能性食品上的綜合開發與利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎斑烏賊購于湛江市霞山水產批發市場，隨機選購成體5 頭，每頭體質量（1.5±0.5）kg，胴體長（26±4）cm，胴寬（12±4）cm。

胰蛋白酶（＞250 NFU/mg） 美國Am resco公司；DPPH 美國Sigma公司；牛血清蛋白、干酪素、酪蛋白、鐵氰化鉀、三氯乙酸、30%過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、考馬斯亮藍、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-3000紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；LGJ-18A冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；DFY-200手提式高速中藥粉碎機 青州市三寶中藥機械廠；H/T18MM臺式離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；BCD-348WA/H電冰箱 科龍電器股份有限公司；90-1定時恒溫磁力攪拌器 金壇市富華儀器有限公司；PHS-3C pH（酸度）計 上海天達儀器有限公司；SHZ-95B循環水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；DLSB-5/20低溫冷卻液循環泵 鄭州長城科工貿有限公司；N-1100旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理

虎斑烏賊解剖，除去表皮、內臟，得烏賊肌肉，切碎，加適量蒸餾水用組織搗碎機打成勻漿狀，采用丙酮脫脂3 次，冷凍干燥、粉碎后得到虎斑烏賊肌肉凍干粉。

1.3.2 酶提取法

1.3.2.1 單因素試驗設計

在保持其他因素相同條件下，以胰蛋白酶為酶制劑，分別考察酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/m L），酶解時間分別為1、2、3、4、5 h，加酶量分別為質量分數1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，考察各因素對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，每個因素平行試驗3 次，取平均值。

1.3.2.2 提取工藝響應面法優化試驗設計

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，以酶解溫度（A）、料液比（B）、酶解時間（C）和加酶量（D）這4 個因素為自變量進行組合優化，多糖得率（Y）為響應值，平行試驗3 次，進行響應面分析。利用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據處理和回歸分析。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.3 水提取法

參照文獻[13]，按料液比1∶30（g/m L），90 ℃水浴提取1 h后，離心（4 000 r/m in，15 m in），取上清液旋轉濃縮至原體積的1/5，向濃縮液中加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心（4 000 r/m in，15 m in）取沉淀，4 ℃透析48 h（每8 h換1 次水），冷凍干燥制備得水提多糖。

1.3.4 堿提取法

參照文獻[14]，按料液比1∶40（g/m L），于燒杯中加入相應體積的0.3 mol/L NaOH溶液，80 ℃水浴提取3 h，離心（4 000 r/m in，15 m in），取上清液并使用鹽酸溶液調pH值至6.8～7.2，旋轉濃縮至原體積的1/5，向濃縮液中加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心（4 000 r/m in，15 m in）取沉淀，4 ℃透析48 h（每8 h換1 次水），冷凍干燥制備得堿提多糖。

1.3.5 虎斑烏賊肌肉多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[16]。精密稱取105 ℃干燥至恒質量的葡萄糖配制成100 μg/m L葡萄糖標準溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 m L葡萄糖標準溶液于試管中，補水至2 m L，加入5.0%苯酚溶液1 m L，混勻后快速加入濃硫酸5.0 m L迅速搖勻，靜置30 m in冷卻至室溫，冷卻后于波長490 nm處測定各管中溶液的吸光度，以蒸餾水作為空白對照，根據標準曲線按公式（1）計算虎斑烏賊肌肉多糖得率：

式中：R為多糖得率/%；C為待測液中多糖質量濃度/（mg/m L）；V為待測液體積/m L；N為稀釋倍數；m為虎斑烏賊肌肉干粉質量/g。

1.3.6 虎斑烏賊肌肉多糖體外抗氧化活性測定

1.3.6.1 對·OH清除能力的測定

[17]，取1 m L不同質量濃度的多糖溶液，加入9 mmol/L FeSO4溶液1 m L，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 m L，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1m L，混勻后37 ℃水浴條件下反應30 m in，3 000 r/m in離心10 m in，取上清液測定其在波長510 nm處的吸光度。以VC為陽性對照，空白對照組以雙蒸水代替多糖溶液，按公式（2）計算?OH清除率：

式中：A0為空白對照的吸光度；Ax為加入多糖溶液的吸光度；A1為以雙蒸水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.6.2 對DPPH自由基清除能力的測定

按照文獻[18]，取2 m L不同質量濃度的多糖溶液，加入含0.2 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液2 m L后混勻，在黑暗環境中常溫反應30 m in，在波長517 nm處測定吸光度。以VC為陽性對照，按公式（3）計算DPPH自由基清除率：

式中：A1為2 m L多糖溶液加2 m L DPPH無水乙醇溶液的吸光度；A2為2 m L多糖溶液加2 m L無水乙醇的吸光度；A0為2 m L雙蒸水加2 mL DPPH無水乙醇溶液的吸光度。

1.3.6.3 對O2-?清除力測定

采用鄰苯三酚自氧化法，參照文獻[19]略作修改。取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.20）4.5 m L，置于25 ℃水浴中預熱20 m in，分別加入1.0 m L樣品溶液和0.5 m L 25 mol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應5 m in，加入8 mol/L鹽酸溶液1 m L終止反應，于波長320 nm處測定吸光度A樣品，空白組以相同體積的蒸餾水代替樣品，測定吸光度A空白。對照組以相同體積的蒸餾水代替鄰苯三酚，測定吸光度A對照。重復3 次，取平均值，按公式（4）計算O2-?清除率，并與VC對照比較。

1.3.7 多糖還原力的測定

參照文獻[19-20]，取1.0 m L樣液，然后加入2.5 m L 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.5 m L 1%鐵氰化鉀溶液于試管中混勻。混合物在50 ℃水浴中反應20 m in，迅速冷卻并加入2.5 m L 10%三氯乙酸溶液，混勻后以4 000 r/m in離心10 m in。取2.5 m L上清液加入0.5 m L 0.1%三氯化鐵溶液混勻，再加1 m L蒸餾水搖勻，以蒸餾水調零，室溫反應10 m in后于波長700 nm處測定吸光度。以去離子水代替樣品作為空白對照，每個樣品做3 次平行，取平均值。并與VC對照比較。

1.3.8 紅外光譜分析

取2 mg干燥虎斑烏賊肌肉多糖，KBr壓片，Nicolet 6700傅里葉紅外光譜分析儀于4 000～400 cm-1區間掃描。

1.4 數據處理

所有數據均重復測定3 次，采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

采用苯酚-硫酸法測定得到的葡萄糖標準曲線回歸方程為Y=174.96X+0.657 9，R2=0.998 9。其中Y為吸光度，X為葡萄糖質量濃度/（mg/m L）。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解溫度對多糖得率的影響

圖1 酶解溫度對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 1 Effect of hydrolysis tem perature on the yield of polysaccharides

固定料液比1∶40，酶解時間4 h，加酶量2.5%，設置酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，考察酶解溫度對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結果見圖1。隨著酶解溫度的升高，多糖得率緩慢增加。當酶解溫度超過55 ℃時，多糖得率反而快速下降，原因是酶為一類具有最適反應溫度范圍的物質，酶解溫度過低會抑制酶的催化活力，溫度過高會導致酶失活，所以在本實驗設定的條件下，確定最適酶解溫度為55 ℃。

2.2.2 料液比對多糖得率的影響

圖2 料液比對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 2 Effect of solid-to-water ratio on the yield of polysaccharides

固定酶解溫度5 5 ℃，酶解時間4 h，加酶量2.5%，設置料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/m L），考察料液比對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結果見圖2。料液比對多糖得率的影響較為明顯。隨著料液比的增加，多糖得率逐漸升高，當料液比在1∶10～1∶40時，多糖得率增加明顯，當料液比高于1∶40時，多糖得率開始下降。可能的原因是料液比影響多糖的溶出，料液比較低時，溶液黏度較高不利于多糖的擴散；料液比過高時，對酶濃度造成一定的稀釋，不利于多糖的提取。綜合節約資源以及后續離心、濃縮、醇沉等因素考慮，選擇1∶40為最適料液比。

2.2.3 酶解時間對多糖得率的影響

圖3 酶解時間對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides

固定酶解溫度55 ℃，料液比1∶40，加酶量2.5%，設置酶解時間分別為1、2、3、4、5 h，考察酶解時間對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結果見圖3。隨著酶解時間的延長，虎斑烏賊肌肉多糖得率也隨之增加，當酶解時間為4 h時多糖得率達到最大，超過4 h后多糖得率反而下降。可能原因是反應達4 h的時候，胰蛋白酶酶解作用已經比較充分，使多糖最大限度的溶出，隨著時間的延長，胰蛋白酶的催化活性開始降低，為減少能耗，節約時間，選取4 h作為最適酶解時間。

2.2.4 加酶量對多糖得率的影響

圖4 加酶量對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響Fig. 4 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharides

固定酶解溫度55 ℃，料液比1∶40，酶解時間4 h，設置加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，考察加酶量對虎斑烏賊肌肉多糖得率的影響，結果見圖4。當加酶量在1.0%～2.5%時，隨著酶添加量的增加，多糖得率增加明顯，在2.5%～3.0%范圍內多糖得率增長緩慢。可能原因是隨著酶添加量的增加，增加了酶與底物的接觸機會，導致多糖較快的溶解出來，但當溶液中酶濃度達到一定范圍時，多糖的溶出率已趨于最大化。因此，從節約成本的因素考慮，選擇2.5%為最適加酶量。

2.3 響應面法優化試驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

在單因素試驗基礎上，對酶解溫度（A）、料液比（B）、酶解時間（C）和加酶量（D）4 個因素，采用Box-Behnken試驗設計方法設計響應面，優化虎斑烏賊肌肉多糖提取工藝，試驗設計與結果見表2。利用Design Expert 8.0.6軟件，對表2試驗數據建立二次回歸模型，擬合的二次多元回歸方程為：Y=-91.953 45+2.759 10A+0.325 80B+3.223 41C+5.830 59D-4.234 50×10-4AB-3.147 50×10-3AC+3.326 00×10-3AD+0.011 082BC-0.029 484BD-0.132 61CD-0.024 981A2-3.364 03×10-3B2-0.378 16C2-0.878 40D2。

表2 響應面法優化試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface methodology

對上述模型進行方差分析，結果見表3。此模型的P值小于0.000 1，響應面回歸模型達到高度顯著水平；失擬項P值為0.546 3大于0.05，不顯著，說明該模型對本實驗擬合程度較好。R2為0.985 0表明該模型對實驗點的適配度達到98.50%，具有較高的擬合度，實驗誤差較小，可以利用該模型預測上述提取條件對多糖得率的影響。分析模型回歸方程系數的P值，C、BC、BD、A2、B2、C2、D2項的影響高度顯著（P＜0.001），A、B、D、CD項影響顯著（P＜0.05），AB、AC、AD項影響不顯著。根據方差分析結果，消去不顯著項，擬合方程簡化為：Y=-91.953 45+2.759 10A+0.325 80B+3.223 41C+5.830 59D+0.011 082BC-0.029 484BD-0.132 61CD-0.024 981A2-3.364 03×10-3B2-0.378 16C2-0.878 40D2。

表3 響應面模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface model

2.3.2 響應面和等高線圖分析

圖5 各因素的響應面和等高線圖Fig. 5 Responsive surface and contour p lots show ing the interactive effects of variab les on the yield of polysaccharides

如圖5所示，等高線的形狀，反映了兩被測變量間交互作用顯著與否，橢圓形等高線表明兩被測變量間交互作用顯著，圓形等高線則意味著兩被測變量間交互作用不顯著[21]。料液比和酶解時間、料液比和加酶量以及酶解時間和加酶量的交互作用均為顯著。

2.3.3 驗證與優化

響應面分析后的最優提取條件為料液比1∶41.37、酶解溫度54.77 ℃、加酶量2.41%、酶解時間4.22 h，最高多糖得率為4.16%。采用響應面優化后的條件對提取條件驗證，平行3 組實驗，如表4所示，與理論預測值相對誤差為0.24%，說明該模型能很好地預測酶提虎斑烏賊肌肉多糖提取工藝。

表4 優化工藝驗證結果Table 4 Verification of the optim ized conditions

2.4 3 種提取方法獲得多糖得率比較

圖6 3 種提取方法獲得多糖得率比較Fig. 6 Comparison in the yields obtained with three extraction methods

由圖6可知，經水提法、堿提法和酶提法獲得的虎斑烏賊肌肉多糖的得率分別為1.82%、2.89%和4.15%。酶提法獲得的多糖得率最高，分別是堿提法和水提法的1.44 倍和2.28 倍。對比這3 種提取方法，酶提法要優于堿提法和水提法，可能的原因是胰蛋白酶專一性好，能夠水解由賴氨酸、精氨酸的羧基所構成的肽鍵，在提取過程中能除去大部分蛋白質，水解產物純凈，多糖純度較高；堿提法雖然提取率較高，但容易將多糖斷裂成小分子單糖，使多糖結構遭到破壞，另外，還容易將一些雜質一并提取出來，導致多糖純度不高；水提法雖然提取工藝簡單，成本較低，但提取率不高，多糖含量較低。此外，水提、堿提和酶提這3 種方法所獲得多糖中的總糖含量分別為73.12%、68.05%和86.54%。

2.5 虎斑烏賊肌肉多糖體外抗氧化活性

2.5.1 虎斑烏賊肌肉多糖對·OH清除能力的比較

?OH是一種對人體危害極大的活潑自由基，在Fe2+作催化劑的條件下，H2O2容易產生?OH，多糖具有螯合Fe2+的能力，從而可以間接地抑制·OH的生成。如圖7所示，在所選質量濃度范圍內，3 種提取方法得到的多糖對·OH均有一定清除能力，隨著多糖質量濃度的增加，其清除·OH能力也相應增加，呈現良好的劑量關系。在質量濃度為0.5～4.0 mg/m L范圍內，酶提多糖具有較高的清除能力，遠高于水提和堿提多糖。當質量濃度為4 mg/m L時，水提、堿提和酶提多糖以及VC對·OH的清除率分別為50.15%、55.14%、89.47%和94.33%。不同提取方法獲得的多糖對·OH的清除能力有差異，清除能力大小順序為：酶提法＞堿提法＞水提法。

圖7 虎斑烏賊肌肉多糖和VC對·OH的清除作用Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

2.5.2 虎斑烏賊肌肉多糖對DPPH自由基清除能力的比較

圖8 虎斑烏賊肌肉多糖和VC對DPPH自由基的清除作用Fig. 8 DPPH radical scavenging capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

自由基清除劑對DPPH自由基的清除程度與其所接受的電子數成定量關系，即與抗氧化劑的供氫能力有關。如圖8所示，在實驗設置質量濃度范圍內，水提、堿提和酶提多糖對DPPH自由基的清除率隨其質量濃度的升高而增加緩慢，當多糖質量濃度為4 mg/m L時，水提、堿提和酶提多糖對DPPH自由基的清除率分別為28.89%、31.48%和40.80%，與VC（98.69%）相比，其清除率均較弱。

2.5.3 虎斑烏賊肌肉多糖對O2-?清除能力的比較

O2-?是生物體內第1個氧自由基，是其他活性氧的前體，對生物體內細胞、酶、DNA及不飽和脂肪酸等物質均能產生影響。如圖9所示，隨著多糖質量濃度的增加，其清除O2-?能力也相應增加，說明多糖質量濃度與清除能力呈正相關。在質量濃度為2～4 mg/m L范圍內，酶提多糖對O2-?具有更好的清除活性，遠高于水提和堿提多糖。當質量濃度為4 mg/m L時，水提、堿提和酶提多糖以及VC對O2-?的清除率分別為75.43%、81.63%、97.00%和87.10%。3 種提取方法獲得的多糖對O2-?的清除能力大小順序為：酶提法＞堿提法＞水提法。

圖9 虎斑烏賊肌肉多糖和VC對O－2?的清除作用Fig. 9 Superoxide anion radical scavenging capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

2.5.4 虎斑烏賊肌肉多糖還原力的比較

圖10 虎斑烏賊肌肉多糖和VC的還原力測定Fig. 10 Reducing capacity of polysaccharides from cuttlefish muscle and VC

如圖10所示，虎斑烏賊肌肉多糖的還原力大小與多糖質量濃度的增加呈正相關。不同提取方法獲得的多糖樣品還原力有差異，酶提多糖還原力高于堿提多糖和水提多糖。與VC相比，在0.5～4.0 mg/m L質量濃度范圍內，3 種提取方法得到的多糖還原力遠低于VC，當質量濃度為4.0 mg/m L時，水提、堿提和酶提多糖還原能力分別為0.134、0.156和0.193。而在相同質量濃度范圍內，VC的還原力均在0.97以上。

2.6 3 種方法提取的多糖對3 種自由基半清除率濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）比較

表5 3 種方法提取的多糖對3 種自由基IC50比較Table 5 Com paring results of IC50 values of the three polysaccharides extracted by different methods for free radical scavenging

由表5可以看出，水提多糖對·OH、DPPH自由基和O2-?的IC50值分別為4.51、16.66 mg/m L和1.15 mg/m L；堿提多糖分別為3.56、15.43 mg/m L和0.69 mg/m L；酶提多糖分別為0.82、11.50 mg/m L和0.29 mg/m L。3 種提取方法對DPPH自由基和O2-?的IC50值均高于VC的IC50值（0.01 mg/m L和0.08 mg/m L），但對·OH而言，酶提多糖的IC50值（0.82 mg/m L）要低于VC（1.03 mg/m L）。3 種提取方法得到的多糖對3 種自由基的IC50值有差異，酶提多糖對·OH、DPPH自由基和O2-?的IC50值最低，清除效果最好。

2.7 虎斑烏賊肌肉多糖紅外光譜分析

圖11 3 種方法提取的虎斑烏賊肌肉多糖的紅外譜圖Fig. 11 Infrared spectra of the polysaccharides extracted by different methods

如圖11所示，在3 600～3 200 cm-1處，3 種提取物各出現一個吸收較強的寬峰：3 420.16、3 389.46 cm-1和3 421.23 cm-1，為—OH伸縮振動峰。在3 000～2 800 cm-1范圍出現弱的吸收：2 959.35、2 933.57 cm-1和2 960.70 cm-1，為C—H伸縮振動峰。在1 400～1 200 cm-1處存在C—H變角振動，分別為1 399.81、1 397.55 cm-1和1 399.16 cm-1吸收峰。在1 200～1 000 cm-1處的吸收峰是由吡喃糖環的醚鍵（C—O—C）和—OH伸縮振動引起的，其吸收峰分別是1 168.68、1 076.97 cm-1和1 021.35 cm-1，此4 組吸收峰均是糖類物質的特征吸收峰[22]，說明本實驗3 種方法獲得的提取物均為多糖類物質。另外，1 654.66、1 653.41 cm-1和1 653.85 cm-1處分別有一強的吸收峰，為酰胺Ⅰ帶的吸收峰；1 558.26、1 545.27 cm-1和1 555.84 cm-1是N—H的變角振動，為酰胺Ⅱ帶的吸收峰，證明這3 種提取物中有少量與糖結合的蛋白（如糖蛋白）存在[23]。592.95、622.54 cm-1和590.99 cm-1是O—H面外彎曲振動吸收峰[24]。

3 討論與結論

本實驗采用酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖，并在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化提取工藝，并與水提法和堿提法進行比較，結果表明：虎斑烏賊肌肉多糖酶提法的最佳工藝條件為酶解溫度55 ℃、料液比1∶40、酶解時間4 h、加酶量2.5%，在此條件下，虎斑烏賊肌肉多糖得率為4.15%，優于水提法（1.82%）和堿提法（2.89%），并且也顯著高于其他海洋動物中多糖提取的得率，如擬目烏賊[13]、蛤蜊[25]、牡蠣[26]等。

水提、堿提和酶提虎斑烏賊肌肉多糖在質量濃度為4 mg/m L條件下，對·OH的清除率分別為50.15%、55.14%和89.47%，其IC50值分別為4.51、3.56 mg/m L和0.82 mg/m L；對DPPH自由基的清除率分別為28.89%、31.48%和40.80%，其IC50值分別為16.66、15.43 mg/m L和11.50 m g/m L；對O2-?的清除率分別為75.43%、81.63%和97.00%，其IC50值分別為1.15、0.69 mg/m L和0.29 mg/m L。還原力大小分別為0.134、0.156和0.193。戴宏杰等[13]研究擬目烏賊生殖腺多糖在質量濃度為10 mg/m L條件下，對·OH清除率為39.77%；對O2-?清除率約為70%。殷紅玲等[27]采用酶液提取的蝦夷扇貝內臟多糖，在質量濃度為6.5 mg/m L條件下，對·OH清除率才達到84.75%，其IC50值為1.3 mg/m L。羅曉航等[28]研究結果表明酶法提取鮑魚臟器粗多糖對·OH的IC50值為20 mg/m L，對O2-?的清除能力非常低，當質量濃度為20 mg/mL時，清除率也僅為25.40%，其IC50值為41.5 mg/mL。本實驗酶法提取多糖的抗氧化活性略高于上述報道結果。陳煉紅等[29]采用復合酶法提取松茸多糖，該糖對O2-?和DPPH自由基具有較強的清除作用，其IC50值分別為0.565 mg/m L和0.454 mg/m L。宋海燕等[30]采用纖維素酶提取五味子多糖，并對其體外抗氧化活性進行探討，當多糖質量濃度為1.2 mg/m L時，對DPPH自由基的清除率達71.8%。宋紅志等[31]研究表明采用超聲波輔助復合酶法提取的6 種桑黃粗多糖樣品對DPPH自由基均具有較強的清除活性，其IC50值均小于2 mg/m L。王雪等[32]研究發現，蛹蟲草基質多糖在質量濃度為2 mg/m L時，對DPPH自由基的清除率高達90%，這些實驗結果略高于本實驗的抗氧化活性結果。程知慶等[33]研究干燥方法對瘤背石磺多糖還原力的影響，結果表明凍干多糖和烘干多糖均沒有表現出較強的還原能力，當質量濃度為4 mg/m L時，還原能力約0.15，本實驗結果與之相近。

人工合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基對甲酚和特丁基對苯二酚等，目前已被廣泛用作食品添加劑，然而這些抗氧化劑可能有誘導癌癥發生的潛在危險[34]。因此，對開發具有無危害、天然、新型抗氧化劑具有重要意義。本實驗中虎斑烏賊肌肉多糖多具有一定的抗氧化能力，尤其是對·OH的清除效果較好，表現出良好的抗氧化活性，可作為一種優良的天然抗氧化劑開發利用。后續研究將會對這3 種提取方法得到的多糖進行分離純化、結構表征和其他生物活性探討。

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Optimization of Enzymatic Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from the Muscle of Sepia pharaonis Using Response Surface Methodology

SUN Yulin1,2, WEN Jing1,2, ZHAO Juan1,2, TIAN Li1, LI Rui1, CHEN Daohai1,2,*
(1. School of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China; 2. Round Beibu Gulf Institute for the Protection and Utilization of Marine Animals in Medicine, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China)

The trypsin-assisted extraction of polysaccharides from the muscle of cuttlefish (Sepia pharaonis) was optim ized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The in vitro antioxidant activity of the obtained polysaccharides was assessed and compared w ith that of those obtained by water extraction and alkali extraction.The optimum extraction conditions were determ ined as follow s: hydrolysis temperature, 55 ℃; solid-to-water ratio,1:40 (g/m L); hydrolysis time, 4 h; and trysin dosage, 2.5%. Under these conditions, the maximum polysaccharide yield of 4.15% was obtained, which was higher than those extracted w ith water and alkali. The antioxidant tests in vitro showed that the enzymatically extracted polysaccharide displayed higher antioxidant activity than the water- and alkali-extracted ones.At a concentration of 4 mg/m L, the percentage scavenging of hydroxyl radical by the polysaccharides extracted w ith water,alkali and trypsin were 50.15%, 55.14% and 89.47%, w ith median inhibition concentration (IC50) values of 4.51, 3.56 and 0.82 mg/m L, respectively; the percentage scavenging of DPPH radical were 28.89%, 31.48% and 40.80% w ith IC50values of 16.66, 15.43 and 11.50 mg/m L, respectively; and the percentage scavenging of superoxide anion radical were 75.43%,81.63% and 97.00% w ith IC50values of 1.15, 0.69 and 0.29 mg/m L, respectively. The reducing capacity values of the three polysaccharides were 0.134, 0.156 and 0.193, respectively. Collectively, it was shown that the yield of enzymaticallyextracted polysaccharides was higher and the polysaccharides had higher antioxidant activity in vitro. The polysaccharides from the muscle of S. pharaonis have the potential to be a new non-hazardous and natural antioxidant.

Sepia pharaonis; polysaccharides; enzymatic extraction; response surface methodology; antioxidant activity

2017-01-19

廣東省科技廳項目（2014B040404071；2015A070708013；2015A030302089）；廣東省省部產學研合作專題項目（2013B090500036）；廣東省自然科學基金項目（2015A030310406；2017A030307029）；廣東省高等教育“創新強校工程”項目（2016KTSCX081）；湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目（2015A06008；2015A03017；2014A03011）；嶺南師范學院博士啟動項目（ZL1313）；嶺南師范學院自然科學研究合作項目（HL1402）

孫玉林（1980—），男，講師，博士，研究方向為海洋生物活性物質。E-mail：sunyulin07002@126.com

*通信作者：陳道海（1963—），男，教授，博士，研究方向為海洋藥用動物開發利用與保護。E-mail：dhchen11@21cn.com

10.7506/spkx1002-6630-201722037

TS201.2

A

1002-6630（2017）22-0246-10

孫玉林, 文菁, 趙娟, 等. 響應面優化酶法提取虎斑烏賊肌肉多糖的工藝及抗氧化活性測定[J]. 食品科學, 2017, 38(22):246-255. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722037. http://www.spkx.net.cn

SUN Yulin, WEN Jing, ZHAO Juan, et al. Optim ization of enzymatic extraction and antioxidant activity of polysaccharides from the muscle of Sepia pharaonis using response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(22): 246-255. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722037. http://www.spkx.net.cn