羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝優化及其抗氧化、免疫活性

韋毅銘，何 舟*，田海芬，王 警，吳妮妮，黃 靜，楊艷芳，李雪華,*，農真真，魏 梅，潘 欣，李 果

（1.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2.廣西壯族自治區人民醫院，廣西 南寧 530021；3.百色市人民醫院，廣西 百色 533000）

羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝優化及其抗氧化、免疫活性

韋毅銘1，何 舟2,*，田海芬3，王 警1，吳妮妮1，黃 靜1，楊艷芳1，李雪華1,*，農真真1，魏 梅1，潘 欣1，李 果1

（1.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2.廣西壯族自治區人民醫院，廣西 南寧 530021；3.百色市人民醫院，廣西 百色 533000）

利用響應面法優化羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝，并測定其體外抗氧化活性，同時建立小鼠免疫低下模型，對所得多糖進行體內免疫調節活性研究。以羧甲基取代度為指標，通過單因素試驗對一氯乙酸（monochloroacetic acid，MCA）濃度、反應溫度、反應時間進行分析，得到羧甲基化龍眼肉多糖最佳制備條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應溫度73 ℃、反應時間3.2 h，取代度可達1.053。抗氧化活性研究表明，在質量濃度為200～3 200 μg/m L范圍內，龍眼肉多糖（polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，LYP）、羧甲基化龍眼肉多糖（crboxymethylated polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，CM-LYP）的抗氧化能力與質量濃度呈劑量依賴關系，當劑量質量濃度達3 200 μg/m L時，LYP、CM-LYP對羥自由基清除率分別為（42.35±5.67）%、（84.39±4.47）%，對超氧陰離子自由基的清除率分別為（51.91±5.34）%、（87.91±7.32）%，對脂質過氧化的抑制率分別為（67.91±5.72）%、（79.85±2.92）%、對H2O2誘導的紅細胞溶血的抑制率分別為（47.23±3.5）%、（54.66±2.83）%，表明羧甲基的引入增強了龍眼肉多糖的抗氧化活性；體內免疫活性實驗表明，羧甲基化龍眼肉多糖可提高免疫抑制小鼠的脾臟指數、促進血清溶血素形成、提高血清和脾臟中溶菌酶含量及調節Th1/Th2平衡，與修飾前龍眼肉多糖相比，羧甲基化龍眼肉多糖具有更好的免疫調節作用。

龍眼肉多糖；羧甲基化；響應面法；抗氧化活性；體內免疫活性

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）亦稱“桂圓”，屬無患子科龍眼屬植物，最早被記載于《神農本草經》，盛產于我國華南地區。據文獻報道，龍眼具有壯陽益氣，補心益脾，潤膚美容，延年益壽等功效，可以治療或改善貧血，心悸，神經衰弱等癥狀[1]。龍眼肉多糖（polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，LYP）是龍眼肉中主要的活性成分之一，課題組前期研究顯示，其毒副作用低，具有良好的生物活性、免疫調節功能及抗腫瘤活性[2-5]。

多糖的生物活性與其結構息息相關，對多糖進行修飾，可得到新的具有不同活性的多糖衍生物。化學、生物和物理方法是常見的修飾方法，其中化學修飾是開發多糖類藥物的一種重要方法，如針對多糖的構效關系，對其空間結構、分子質量、活性基團種類等進行修飾，可改善其生物活性，甚至賦予新的生物活性[6-8]。多糖修飾的方法有很多，如硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、磺酰化、羧甲基化等[9-15]。其中羧甲基化由于其反應過程具有易于控制，成本低廉，反應產物無毒性等優點，在多糖的結構修飾研究中得到了廣大研究者的關注[16]。

羧甲基化修飾主要是在多糖的支鏈上引入羧甲基基團，據相關文獻報道，羧甲基的引入可改善多糖的生物活性[17-19]。基于此，本實驗對龍眼肉多糖進行了羧甲基化修飾，并優化其制備工藝，并對龍眼肉多糖修飾產物的分子質量、抗氧化活性、體內免疫活性等進行測定，以期對羧甲基化龍眼肉多糖（crboxymethylated polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，CM-LYP）理化性質和活性的影響有初步的了解，為龍眼肉多糖的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼干果購自廣西南寧交易市場，經廣西中醫藥研究所嚴克儉檢驗員鑒定為石硤龍眼（Dimocarpus longan Lour.）。

注射用環磷酰胺（cyclophospham ide，CY） 山西普德藥業股份有限公司；紅細胞保存液、培養基、豚鼠血清、溶菌酶試劑盒、IFN-γ試劑盒、IL-4試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、VC、一氯乙酸（monochloroacetic acid，MCA）、鹽酸羥胺、三氯化鐵、氫氧化鈉、無水乙醇、30%過氧化氫溶液、木瓜蛋白酶、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鹽酸、羥基乙酸（乙醇酸）、變色酸等均為分析純。

SPF級昆明小鼠，體質量（20±2）g，周齡6～8 周，購于廣西醫科大學實驗動物中心。

1.2 儀器與設備

Lambda650型紫外-可見光分光光度計、Spectrum100型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin Elmer儀器有限公司；TDL-5A型低速臺式離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；G1362A型高效液相色譜 美國Agilent公司；A L 20 4型電子天平、X S 20 5DU十萬分之一電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；M ultiskan MK3酶聯免疫檢測儀 美國Thermo公司；BP190S電子分析天平 德國Startorius公司。

1.3 方法

1.3.1 LYP、CM-LYP的制備

LYP的制備按參考文獻[20]方法進行。

CM-LY P的制備：取LY P 0.20 0 0 g，加入10 m L 3.0 mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌溶解后，緩慢加入MCA，60 ℃反應3 h后，冰乙酸或氫氧化鈉調節pH 7，過濾，濾液經透析后冷凍干燥得CM-LYP。

1.3.2 CM-LYP的多糖含量、取代度測定及結構鑒定

LYP、CM-LYP中多糖含量測定：采用苯酚-硫酸法[21]；LYP、CM-LYP結構測定：采用傅里葉變換紅外光譜儀[22]；LYP、CM-LYP的相對分子質量測定：采用高效凝膠滲透色譜法[23]；CM-LYP羧基化取代度[24]測定：采用紫外分光光度法。

1.3.3 CM-LYP制備單因素試驗和正交優化試驗

1.3.3.1 CM-LYP制備單因素試驗

固定反應溫度60 ℃，反應時間3.0 h，測定不同MCA濃度（0.5、1、1.5、2、2.5 mol/L）對羧甲基化取代度的影響得出最佳MCA濃度；其次固定反應時間為3.0 h，MCA濃度為1.5 mol/L，測定不同反應溫度（40、50、60、70、80 ℃）對羧甲基化取代度的影響，得出最佳反應溫度；最后固定溫度為70 ℃，MCA濃度為1.5 mol/L，測定不同反應時間（2、2.5、3、3.5、4 h）對羧甲基化取代度的影響，得出最佳反應時間。

1.3.3.2 CM-LYP制備的響應面優化設計

表1 響應面試驗因素與水平Tab le 1 Code and level of independent variables used in response surface analysis

響應面試驗設計如表1所示，按照Box-Behnken設計原理，在單因素試驗的基礎之上，以羧甲基化取代度為響應值，選取MCA濃度、反應溫度和反應時間3 個單因素為自變量，優化龍眼肉多糖羧甲基化的制備工藝。

1.3.4 LYP、CM-LYP的抗氧化活性測定

1.3.4.1 LYP、CM-LYP對羥自由基的清除

分別配制3 組不同濃度的樣品溶液，陽性對照VC組溶液質量濃度為20、40、80、160、320 μg/m L；LYP實驗組溶液質量濃度為200、400、800、1 600、3 200 μg/m L；CM-LYP實驗組溶液質量濃度為200、400、800、1 600、3 200 μg/m L。分別取1 m L樣品溶液，依次加入1 m L 9 mmol/L FeSO4溶液、1 m L 9 mmol/L水楊酸的乙醇溶液、6 m L蒸餾水，搖勻。以等體積的蒸餾水代替樣品溶液作空白對照組，以蒸餾水代替水楊酸測得吸光度（Ac）。最后加入1 m L 8.82 mmol/L H2O2溶液，37 ℃恒溫水浴反應1 h后，在510 nm波長處測定吸光度（Ax）。實驗結果用清除率（I）表示，見公式（1）。以I為縱坐標，多糖或VC質量濃度對數為橫坐標作圖，建立回歸方程，計算IC50。

式中：Ac為本底組（蒸餾水代替水楊酸）的吸光度； Ax為樣品組的吸光度；A0為對照組（用蒸餾水代替多糖）的吸光度。

1.3.4.2 LYP、CM-LYP對超氧陰離子自由基的清除

樣品溶液的配制同1.3.4.1節。取4.6 m L 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，置于25 ℃水浴中預熱20 m in后，分別加入1 m L各樣品溶液，再加入0.4 m L 10 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻后，置于25℃恒溫水浴中反應4 m in，然后加入0.1 m L 8 mol/L HCl溶液終止反應，在325 nm波長處測定吸光度（Bx），用蒸餾水1 m L代替樣品溶液測定吸光度（B0），用蒸餾水0.4 m L代替10 mmol/L鄰苯三酚溶液測定吸光度（Bc）。清除率（E）的計算見公式（2）。

式中：Bc為本底組（蒸餾水代替鄰苯三酚）的吸光度；Bx為樣品組的吸光度；B0為對照組（蒸餾水代替樣品溶液）的吸光度。

1.3.4.3 LYP、CM-LYP對小鼠肝勻漿脂質過氧化的影響

分別配制3 組不同質量濃度的樣品溶液：陽性對照VC組溶液質量濃度為125、250、500、1 000、2 000 μg/m L；LYP實驗組溶液質量濃度為250、500、1 000、2 000、4 000 μg/m L；CM-LYP實驗組溶液質量濃度為250、500、1 000、2 000、4 000 μg/m L。

將昆明小鼠斷頸處死后，快速取出肝臟，用冰冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分后稱質量，在冰水浴中將其研磨制成10 g/100 m L組織勻漿，高速離心后吸取上清液備用。分別移取上清液1.0 m L置于數支試管中，精密加入1.0 m L不同質量濃度的預先配制的樣品溶液，充分搖勻，37 ℃恒溫溫孵1.5 h后，依次加入2 m L體積分數10%三氯乙酸溶液，2 m L體積分數0.67% 2-硫代巴比妥酸溶液，充分混勻后置于98 ℃水浴中反應15 m in，離心，取上清液，在532 nm波長處測定其吸光度（Hx）。以1m L生理鹽水代替樣品溶液測定吸光度（H0）。以1 m L生理鹽水代替質量分數10%肝勻漿測定吸光度（Hc）。每個濃度組平行測定5 份。測定結果以脂質過氧化抑制率（F）表示，抑制率的計算見公式（3）。

式中：Hc為本底組（生理鹽水代替肝勻漿）的吸光度；Hx為樣品組的吸光度；H0為對照組（生理鹽水代替樣品溶液）的吸光度。

1.3.4.4 LYP、CM-LYP對H2O2誘導紅細胞溶血的影響

分別配制3 組不同質量濃度的樣品溶液：陽性對照VC組溶液質量濃度為28.6、57.1、114.3、228.6、457.1 μg/m L；LYP實驗組溶液質量濃度為28.6、57.1、114.3、228.6、457.1 μg/m L；CM-LYP實驗組溶液質量濃度為28.6、57.1、114.3、228.6、457.1 μg/m L。

昆明小鼠摘除眼球后收集全血，離心，棄上清液得紅細胞，采用生理鹽水清洗，離心，用生理鹽水制成體積分數0.5%的紅細胞懸液。取1 m L紅細胞懸液，加入1 m L不同質量濃度的樣品溶液，再加入0.2 m L 50 mmol/L H2O2溶液，37 ℃水浴溫孵1 h后，加5 m L生理鹽水稀釋，離心，取上清液，以生理鹽水為空白，在415 nm波長處測定吸光度（Kx）。以生理鹽水1 m L代替樣品溶液測定吸光度（K0），用生理鹽水1 m L代替0.5%紅細胞懸浮液測定吸光度（Kc）。每個質量濃度組平行測定5 次。抑制率的計算見公式（4），并計算半數抑制溶血濃度IC50。

式中：Kc為空白對照組測定的吸光度；Kx為實驗組測定的吸光度；K0為陽性對照組測定的吸光度。

1.3.5 LYP、CM-LYP對小鼠體內免疫活性測定

1.3.5.1 實驗分組與實驗方法

將110 只昆明小鼠（（20±2）g，雌雄各半）按體質量隨機分為11 組，每組10 只。正常對照組：每天腹腔注射生理鹽水0.2 m L；環磷酰胺模型組（CY組）：每隔3 d腹腔注射20 mg/kg環磷酰胺一次；陽性對照香菇多糖組：每隔3 d腹腔注射環磷酰胺一次，每天灌胃香菇多糖40 mg/kg；CM-LYP組：每隔3 d腹腔注射環磷酰胺一次，每天灌胃CM-LYP一次，分為160、80、40、20 mg/kg 4 個劑量組；LYP組：每隔3 d腹腔注射環磷酰胺一次，每天灌胃LYP一次，分為160、80、40、20 mg/kg 4 個劑量組。實驗連續進行21 d。最后一天給藥后24 h，眼球采血，將所有小鼠處死，分別測定其脾臟指數、溶菌酶、溶血素、IFN-γ和IL-4含量。

1.3.5.2 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠脾臟指數的影響

將小鼠斷頸處死后摘取脾臟，將脾臟周圍的結締組織剔除干凈，用生理鹽水洗去殘留在脾臟上的血漬，用濾紙吸干脾臟表面的水分后稱質量，并立即置于冰上，待后期處理。脾臟指數計算方法見公式（5）：

式中：m1為小鼠體質量/g；m0為脾臟質量/mg。

1.3.5.3 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠血清中溶血素的影響

小鼠連續飼養至第15天后，對小鼠腹腔注射體積分數2%綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）溶液0.2 m L使致敏，1 h后眼球取血，2 000 r/m in離心10 m in，取血清0.2 m L，用生理鹽水稀釋50倍，置于管中，再加入3.75 m L 的體積分數3% SRBC溶液和體積分數10%的豚鼠血清稀釋液0.2 m L，空白組以生理鹽水作對照，然后置于25 ℃溫箱保溫1 h后，取出放入冰浴中終止反應，1 000 r/m in離心2 m in，取上清液，在540 nm波長處測定OD值。精密吸取體積分數2% SRBC溶液0.5 m L溶于1.5 m L蒸餾水中為100%溶血管，用生理鹽水等體積稀釋后作為50%溶血管，用酶標儀測定540 nm波長處的吸光度，即得SRBC半數溶血時的OD值。樣品的半數溶血值（HC50）計算見公式（6）[25]：

1.3.5.4 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠脾臟和血清中溶菌酶含量的影響

按1.3.5.2節取脾臟，與生理鹽水按料液比為1∶9（g/m L），在冰水浴中制備10%組織勻漿，5 000 r/m in離心10 m in，取沉淀，分裝后置于-20 ℃冰箱備用。用溶菌酶試劑盒測定脾臟組織和血清中溶菌酶（lysozyme，LZM）含量。

1.3.5.5 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量的影響

小鼠連續飼養至第21天后，摘除眼球收集全血，離心，取上清液得血清。分別采用IFN-γ、IL-4試劑盒測定小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量，操作方法按照說明書進行。

2 結果與分析

2.1 多糖結構鑒定

圖1 龍眼肉多糖羧甲基化修飾前后紅外光譜分析Fig. 1 FTIR spectra of LYP and CM-LYP

由圖1可以看出，CM-LYP在1 603.43、1 420.15、1 326.22 cm-1波數處出現了—CH2COOH的特征吸收峰，其中，1 603.43 cm-1波數處吸收峰為強峰，屬C—O鍵非對稱伸縮振動；在1 420.15、1 326.22 cm-1波數處2 個峰為中強峰，屬羰基C＝O的對稱伸縮振動和—CH—的變角振動峰。說明了羧甲基已成功引入到龍眼肉多糖的分子結構中。

圖2 LYP、CM-LYP的高效凝膠色譜圖Fig. 2 HPGPC profi les of LYP and CM-LYP

如圖2所示，經測定，龍眼肉多糖羧甲基化修飾前后的多糖質量分數分別為95.8%和95.2%，分子質量分別為1.51×105D和1.29×105D。

2.2 CM-LYP制備工藝優化

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 MCA濃度對羧甲基化取代度的影響

圖3 MCA濃度對取代度的影響Fig. 3 Effect of MCA concentration on degree of substitution

如圖3所示，隨著MCA濃度的逐漸升高，取代度逐漸增大，當MCA濃度超過1.5 mol/L后，取代度下降。因此確定最優的MCA濃度為1.5 mol/L。

2.2.1.2 反應溫度對羧甲基化取代度的影響

圖4 反應溫度對取代度的影響Fig. 4 Effect of reaction tem perature on degree of substitution

如圖4所示，在40～70 ℃范圍內，伴隨反應溫度的升高，取代度逐漸增大，隨著溫度的進一步提高，取代度開始下降，因此最佳反應溫度應為70 ℃。

2.2.1.3 反應時間對羧甲基化取代度的影響

圖5 反應時間對取代度的影響Fig. 5 Effect of reaction time on degree of substitution

如圖5所示，當反應時間為2.0～3.0 h時，取代度隨著時間的延長而增大，3.0 h時取代度最高，超過3.0 h時，取代度出現下降，因此確定最優的反應時間為3.0 h。

2.2.2 羧甲基化龍眼肉多糖工藝優化

選取反應時間、反應溫度和MCA濃度為研究因素，以羧甲基化取代度為指標，使用統計分析軟件Design-Expert 8.05建立三因素三水平共17 個試驗點的響應面試驗，以優化羧甲基化龍眼肉多糖合成條件，響應面試驗及方差分析結果如表2和表3所示。

表2 響應面試驗優化及結果Table 2 Experimental design and results for RSM

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

響應面優化試驗的結果見表2，采用Design-Expert 8.06軟件對試驗結果進行二次方程擬合，得到以下方程：Y=1.02-0.014X1+0.10X2+0.057X3-0.10X1X2-0.042X1X3-9.750×10-3X2X3-0.052X12-0.25X22-0.11X32。

從表3可以看出，模型的顯著水平P＜0.000 1，因變量和全體自變量之間的線性關系顯著（r=0.52/0.53=0.981）。失擬項不顯著（P=0.708 2），說明其他因素對取代度干擾很小，回歸模型與實際情況相符合。影響取代度大小的因素主次順序依次為反應溫度、反應時間和MCA濃度。相互影響因素中，MCA濃度與反應溫度相互影響最為顯著。

圖6 各因素交互作用對羧甲基化取代度的影響Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of reaction conditions on degree of substitution

如圖6所示，對響應面圖進行分析，得出最佳工藝條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應溫度73 ℃、反應時間3.2 h，此時CM-LYP的羧甲基取代度達到1.057。

2.2.3 模型驗證

為了驗證模型的穩定性、可行性，本實驗固定合成工藝條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應溫度73℃、反應時間3.2 h。在該工藝條件下，平行3 次對龍眼肉多糖進行羧甲基化修飾，結果如表4所示，實際獲得的羧甲基的取代度與理論值相近，表明所建立的回歸曲線數學模型預測性較好，也證實響應面法優選龍眼肉多糖羧甲基化工藝結果穩定、可行。

表4 驗證實驗Table 4 Validation of the optim ized conditions

2.3 LYP、CM-LYP體外抗氧化活性測定結果

2.3.1 LYP、CM-LYP清除羥自由基能力

如表5所示，LYP、CM-LYP均具有清除羥自由基的能力，且呈現劑量依賴關系。從物質的量濃度考慮，LYP、CM-LYP、VC的IC50分別為4.67×10-5、3.44×10-6、4.80×10-4mol/L，說明羧甲基的引入可以提高LYP對羥自由基的清除能力，且優于VC，這可能與修飾后的多糖的結構以及羥基基團的含量有關。

表5 LYP和CM-LYP對羥自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 5 Percentage scavenging of hydroxyl radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

表5 LYP和CM-LYP對羥自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 5 Percentage scavenging of hydroxyl radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

樣品 質量濃度/（μg/m L） I/% IC50/（mol/L）200 10.42±2.64 LYP 400 21.77±5.29 800 28.63±3.76 1 600 36.90±3.97 3 200 42.35±5.67 4.67×10-5 200 31.14±5.54 CM-LYP 400 42.67±3.27 800 58.44±7.02 1 600 77.36±5.29 3 200 84.39±4.47 3.44×10-6 20 12.78±2.78 VC 40 26.65±3.02 80 48.85±3.94 160 72.23±5.66 320 82.18±3.13 4.80×10-4

2.3.2 LYP、CM-LYP清除超氧陰離子自由基能力

表6 LYP和CM-LYP對超氧陰離子自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 6 Percentage scavenging of superoxide anion radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

表6 LYP和CM-LYP對超氧陰離子自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 6 Percentage scavenging of superoxide anion radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

樣品 質量濃度/（μg/m L） E/% IC50/（mol/L）200 23.76±4.14 LYP 400 34.57±3.59 800 41.78±2.77 1 600 47.23±2.87 3 200 51.91±5.34 1.88×10-5 200 33.98±6.10 CM-LYP 400 45.40±4.73 800 55.68±3.87 1 600 76.09± 5.17 3 200 87.91±7.32 3.24×10-6 20 16.44±1.85 VC 40 29.56±4.72 80 45.68±2.69 160 66.09±4.30 320 73.91±5.45 5.37×10-4

如表6所示，LYP、CM-LYP對超氧陰離子自由基的清除率與質量濃度呈劑量相關。從物質的量濃度考慮，LYP、CM-LYP、VC的IC50分別為1.88×10-5、3.24×10-6、5.37×10-4m o l/L，說明羧甲基的引入可以增強LYP對超氧陰離子自由基的清除能力，且優于VC。

2.3.3 LYP、CM-LYP對小鼠肝勻漿脂質過氧化的影響

表7 LYP和CM-LYP對脂質過氧化的影響（x ±s，n=5）Tab le 7 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP on lipid peroxidation(x s, n= 5)

表7 LYP和CM-LYP對脂質過氧化的影響（x ±s，n=5）Tab le 7 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP on lipid peroxidation(x s, n= 5)

樣品 質量濃度/（μg/m L） F/% IC50/（mol/L）250 28.98±2.91 500 44.27±3.34 LYP 1 000 51.46±4.08 7.78×10-6 2 000 63.37±3.97 4 000 67.91±5.72 250 35.81±1.86 500 50.38±3.64 CM-LYP 1 000 60.62±2.13 3.60×10-6 2 000 71.09±4.18 4 000 79.85±2.92 125 35.40±3.99 250 52.44±2.86 VC 500 67.57±6.03 1.34×10-3 1 000 76.53±5.59 2 000 88.72±5.38

如表7所示，在一定范圍內，LYP、CM-LYP、VC均可有效抑制小鼠肝勻漿自發性脂質過氧化反應，且與質量濃度呈現一定的劑量依賴關系。從物質的量濃度考慮，LYP、CM-LYP、VC的半數抑制濃度分別為7.78×10-6、3.60×10-6、1.34×10-3mol/L，表明羧甲基的引入，可增強LYP抑制脂質過氧化能力，且優于VC。2.3.4 LYP、CM-LYP對H2O2誘導的紅細胞溶血的影響

表8 LYP和CM-LYP對H2O2誘導的紅細胞溶血的影響（x±s，n=5）Table 8 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP) on red cell hemolysis induced by H 2O2 (x s, n= 5)

表8 LYP和CM-LYP對H2O2誘導的紅細胞溶血的影響（x±s，n=5）Table 8 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP) on red cell hemolysis induced by H 2O2 (x s, n= 5)

樣品 質量濃度/（μg/m L） H/% IC50/（mol/L）28.6 17.74±1.46 57.1 21.62±4.19 LYP 114.3 31.37±3.05 228.6 38.9±4.37 5.26×10-6 457.1 47.23±3.59 28.6 28.38±2.21 57.1 33.81±4.73 CM-LYP 114.3 44.35±5.17 1.74×10-6 228.6 48.45±3.55 457.1 54.66±2.83 28.6 26.05±3.83 57.1 34.15±4.05 VC 114.3 41.69±5.87 9.61×10-4 228.6 52.44±3.29 457.1 67.18±5.02

如表8所示，隨著樣品質量濃度的增加，溶血抑制率逐漸升高，表明LYP、CM-LYP、VC均能抑制H2O2誘導的紅細胞溶血，且其抑制能力與樣品質量濃度呈現一定劑量效應。VC、LYP、CM-LYP的IC50分別為9.61×10-4、5.26×10-6、1.74×10-6mol/L，表明羧甲基的引入增強了LYP的抗溶血能力，且優于VC。

2.4 體外免疫活性

2.4.1 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠脾臟指數的影響脾臟是機體最大的外周免疫器官，含有大量由骨髓干細胞發育而來的B淋巴細胞，另外還有大量T淋巴細胞和巨噬細胞，因此脾臟參與細胞免疫、體液免疫及非特異性免疫[25]。脾臟指數能反映免疫器官的發育和免疫細胞的功能狀況，脾臟指數的高低能夠較為客觀地反映機體非特異性免疫能力[26]。

表9 LYP和CM-LYP對免疫抑制小鼠脾臟指數的影響（x ±s，n=10）Tab le 9 Effects of LYP and CM-LYP on sp leen index in immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

表9 LYP和CM-LYP對免疫抑制小鼠脾臟指數的影響（x ±s，n=10）Tab le 9 Effects of LYP and CM-LYP on sp leen index in immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

注：*. P＜0.05，實驗組與CY組具有顯著差異；#. P＜0.05，實驗組與正常對照組具有顯著差異。下表同。

組別 給藥量/（mg/kg） 脾臟指數/（mg/g）CY組 0 1.17±0.33對照組 0 2.32±0.42*香菇多糖組 40 3.19±0.37#LYP組20 1.22±0.16 40 1.48±0.25 80 2.07±0.44*160 2.46±0.21*20 1.42±0.17 40 1.85±0.23*80 2.57±0.38*160 3.10±0.42#CM-LYP組

從表9可以看出，與正常對照組相比，環磷酰胺模型組脾臟指數顯著降低（P＜0.05），說明本研究成功建立了環磷酰胺免疫抑制小鼠模型。與環磷酰胺模型組比較，陽性對照香菇多糖和不同劑量的LYP、CM-LYP均能顯著的提高免疫抑制小鼠的脾臟指數且呈現劑量依賴效應（P＜0.05）。說明LYP、CM-LYP均能夠降低環磷酰胺誘導產生的脾臟指數，在一定程度上可提高機體免疫力。

2.4.2 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響

以SRBC作為抗原，刺激機體產生特異性抗體（溶血素，即SRBC抗體），并釋放至外周血。抗原抗體相互結合形成抗原抗體復合物，暴露出補體（豚鼠血清）結合點，激活補體，導致SRBC產生溶血現象，因此，可通過測定致敏動物血清中溶血素含量得知藥物對體液免疫的影響。

由表10可以看出，與正常對照組相比，環磷酰胺組小鼠血清的半數溶血值（HC50）顯著降低（P＜0.05），說明本研究成功建立了環磷酰胺免疫抑制小鼠模型。陽性對照香菇多糖組、LYP組和CM-LYP組均能提高免疫抑制小鼠血清中的溶血素含量（P＜0.05），且這種變化呈現劑量依賴關系。以上結果說明LYP在80～160 mg/kg范圍內、CM-LYP在40～160 mg/kg范圍內能改善免疫抑制小鼠的體液免疫功能。

表10 LYP和CM-LYP對免疫抑制小鼠溶血素的影響（x ±s，n=10）Table 10 Effects of LYP and CM-LYP on hemolysin in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

表10 LYP和CM-LYP對免疫抑制小鼠溶血素的影響（x ±s，n=10）Table 10 Effects of LYP and CM-LYP on hemolysin in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

組別 給藥量/（mg/kg） HC50 CY組 0 1.17±0.33正常對照組 0 2.32±0.42*香菇多糖組 40 3.19±0.37#20 1.22±0.16 LYP組40 1.48±0.25 80 2.07±0.44*160 2.46±0.21*20 1.42±0.17 CM-LYP組40 1.85±0.23*80 2.57±0.38*160 3.10±0.42#

2.4.3 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠脾臟和血清中溶菌酶的影響

LZM又稱胞壁質酶，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒和增強免疫力等作用，其水平或活性是先天性免疫力的一個重要指標[27]。

表11 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠血清和脾臟中LZM的影響（x ±s，n=10）Table 11 Effects of CM-LYP on LZM on lysozyme activity in serum and sp leen of immunosupp ressed m ice (x s, n= 10)

表11 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠血清和脾臟中LZM的影響（x ±s，n=10）Table 11 Effects of CM-LYP on LZM on lysozyme activity in serum and sp leen of immunosupp ressed m ice (x s, n= 10)

溶菌酶含量/（U/m L)血清 脾臟CY組 0 314.9±53.7 126.4±12.1正常對照組 0 443.4±66.1* 223.8±26.5*香菇多糖組 40 628.7±68.5# 256.9±33.9#組別 給藥量/（mg/kg)LYP組20 328.5±49.8 136.7±16.4 40 386.1±55.4* 154.0±15.3 80 457.6±47.9* 180.4±28.5*160 487.7±39.7* 197.8±24.2*CM-LYP組20 384.1±55.2* 177.9±18.7*40 433.6±67.8* 202.3±27.5*80 532.5±44.1* 242.7±22.5*160 566.2±67.4* 252.9±30.6*

由表11可以看出，與正常對照組比較，環磷酰胺組小鼠血清中的LZM含量顯著降低（P＜0.05），說明免疫抑制小鼠模型建立成功。與模型組相比，陽性對照香菇多糖組（40 mg/kg）、龍眼肉多糖組（40～160 mg/kg）、羧甲基化龍眼肉多糖組（20～160 mg/kg）均顯著地提高免疫抑制小鼠血清中L ZM水平（P＜0.05），且這種變化呈現劑量依賴關系。

由表11可知，與正常對照組相比較，環磷酰胺組小鼠脾臟中的LZM含量顯著降低（P＜0.05），說明免疫抑制小鼠模型建立成功。與模型組相比，陽性對照香菇多糖組（40 mg/kg）、龍眼肉多糖組（80～160 mg/kg）、羧甲基化龍眼肉多糖組（20～160 mg/kg）均明顯提高免疫抑制小鼠脾臟中LZM水平（P＜0.05），且這種變化呈現劑量依賴關系。以上結果說明龍眼肉多糖羧甲基化衍生物對免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能恢復有促進作用。

2.4.4 LYP、CM-LYP對小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量的影響

Th1細胞亞群與人類多種疾病的關系非常復雜且非常重要，Th1/Th2平衡失調與許多疾病的發生、發展、治療等有密切的關系[28]。IFN-γ主要來自于Th1細胞的分泌，能夠激活T淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞以增強免疫功能，主要介導細胞免疫。IL-4主要由Th2細胞分泌，介導體液免疫應答，能夠促進B淋巴細胞的增殖和活化，促進免疫球蛋白的生成和類型轉換，從而正向調控機體的體液免疫。因此，可通過測定小鼠血清中IFN-γ、IL-4含量，得出Th1/Th2平衡情況，從而反映出LYP、CM-LYP的免疫調節活性。

LYP、CM-LYP對小鼠血清中IFN-γ含量的影響如表12所示。與空白對照組比較，CY組小鼠血清中的IFN-γ含量提升了3 倍以上（P＜0.05），主要偏向細胞免疫。隨著LYP、CM-LYP給藥劑量的增加，血清中的IFN-γ含量逐漸降低，表明Th1免疫應答模式減弱。當給藥劑量超過80 mg/kg時血清中的IFN-γ含量穩定并處于正常水平（P＞0.05）。

表12 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠血清中INF-γ和IL-4含量的影響（x±s，n=10）Table 12 Effects of LYP and CM-LYP on INF-γand IL-4 levels in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

表12 LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠血清中INF-γ和IL-4含量的影響（x±s，n=10）Table 12 Effects of LYP and CM-LYP on INF-γand IL-4 levels in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

IL-4質量濃度/（pg/m L）CY組 0 178.63±13.44# 42.54±5.98#正常對照組 0 51.07±4.15* 83.87±6.75*香菇多糖組 40 51.67±4.89* 102.59±7.43*#組別 給藥量/（mg/kg)INF-γ質量濃度/（pg/m L）LYP組20 153.83±12.37*# 43.22±5.22#40 126.47±7.81*# 57.84±5.33*#80 50.19±7.91* 70.19±7.91*#160 46.96±6.12* 97.95±8.07*#CM-LYP組20 82.19±4.73*# 62.09±5.61*#40 59.45±5.36*# 85.59±6.54*80 51.08±3.38* 93.30±5.62*#160 41.74±2.77* 115.3±7.09*#

LYP、CM-LYP對小鼠血清中IL-4含量的影響如表12所示。與空白對照組比較，CY組小鼠血清中的IL-4含量下降顯著（P＜0.05），主要偏向細胞免疫。隨著LYP、CM-LYP給藥劑量的增加，血清中的IL-4含量逐漸升高，表明Th2免疫應答模式增強。當CM-LYP給藥劑量為80 mg/kg時血清中的IL-4含量接近正常水平（P＞0.05）。綜上所述，隨著LYP、CM-LYP的給藥濃度逐漸增大，免疫抑制小鼠血清中IFN-γ、IL-4含量逐漸恢復至正常水平，即Th1/Th2趨于平衡，表明，LYP、CM-LYP對免疫抑制小鼠具有免疫調節作用，且同等劑量濃度下，CM-LYP的免疫調節能力優于LYP。

3 結 論

采用響應面法優化CM-LYP制備工藝，以羧甲基取代度為衡量指標，通過單因素試驗對MCA濃度、反應溫度、反應時間進行響應面分析，建立羧甲基化取代度與各影響因素之間的回歸模型，得到CM-LYP的最佳工藝條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應溫度73 ℃、反應時間3.2 h時，取代度高達1.053。

自由基是指單獨存在的、具有配對價電子的離子、原子、分子，主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基和H2O2等。自由基性質活潑和反應性強，易造成生物膜系統損傷及細胞內氧化磷酸化障礙，對人體的健康和壽命危害較大[29-31]。實驗結果表明，LYP、CM-LYP均能夠抑制小鼠肝臟脂質過氧化，抑制H2O2引起的紅細胞溶血，清除羥自由基和超氧陰離子自由基，且在同等質量濃度下，CM-LYP的抗氧化活性要強于修飾前的LYP。

體內免疫實驗結果表明，當給藥劑量在20～160 mg/kg范圍內，LYP、CM-LYP均能提高免疫功能抑制小鼠的脾臟指數，促進免疫功能抑制小鼠體內溶血素形成，提高免疫功能抑制小鼠脾臟組織和血清中的溶菌酶含量，調節免疫抑制小鼠血清中Th1/Th2的平衡。綜上所述，CMLYP對免疫功能抑制小鼠的非特異性免疫功能、細胞免疫功能、體液免疫功能均有明顯的改善和促進作用，且在相同劑量濃度下，CM-LYP較修飾前的LYP具有更強的免疫活性，說明羧甲基的引入有利于提高LYP的免疫調節活性。

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Optim ization of Preparation of Carboxymethylated Polysaccharides from Longan (Dimocarpus longan) Pulp by Response Surface Methodology and Their Antioxidant Activity and Immunoregulatory Activity

WEI Yim ing1, HE Zhou2,*, TIAN Haifen3, WANG Jing1, WU Nini1, HUANG Jing1, YANG Yanfang1,LI Xuehua1,*, NONG Zhenzhen1, WEI Mei1, PAN Xin1, LI Guo1
(1. Pharmaceutical College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 2. The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 3. The People’s Hospital of Baise, Baise 533000, China)

In this study, the carboxymethylation of polysaccharides (LYP) extracted from longan (Dimocarpus longan)pulp was investigated using monochloroacetic acid (MCA) w ith polysaccharides-to-MCA ratio, reaction time and reaction temperature as independent variables. The degree of substitution (DS) was taken as response value to optimize the important reaction conditions by response surface methodology. Meanwhile, the antioxidant activity and immunoregulatory of carboxymethlated polysaccharides (CM-LYP) in vivo were measured. The results showed that the optim ized conditions that provided the maximum DS of 1.053 were determ ined as follows: reaction time, 3.2 h; MCA concentration, 1.2 mol/L;and reaction temperature, 73 ℃. The antioxidant activity of CM-LYP was concentration dependent in a certain range of concentration. The percentage inhibition of hydroxyl and superoxide anion radicals, lipid peroxidation, red blood cell hemolysis induced by H2O2were (42.35 ± 5.67)%, (51.91 ± 5.34)%, (67.91 ± 5.72)%, and (47.23 ± 3.5)% by LYP, and(84.39 ± 4.47)%, (87.91 ± 7.32)%, and (79.85 ± 2.92)%, and (54.66 ± 2.83) % by CM-LYP, respectively, implying that the antioxidant activity of LYP was improved as compared to the native polysaccharides. The immunoregulatory activity invivo showed that CM-LYP significantly improved spleen index in immunosuppressed, increased serum hemolysin level and lysozyme activity in serum and spleen, and maintained Th1/Th2 balance, and the effect was better than that of LYP.

longan pulp polysaccharides; carboxymethylation; response surface methodology; immune activity; antioxidant activity

2017-01-06

廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科重12118005-1-2）；廣西教育廳專利資助項目（KY2015ZL020）

韋毅銘（1991—），男，碩士研究生，主要從事天然產物化學研究。E-mail：18260903735@163.com

*通信作者：何舟（1982—），男，主治醫師，碩士，主要從事中草藥有效成分及免疫研究。E-mail：229189314@qq.com李雪華（1963—），女，教授，碩士，主要從事天然產物活性物質提取與活性研究。E-mail：onlythankforyou@163. com

10.7506/spkx1002-6630-201722041

R284.3

A

1002-6630（2017）22-0275-09

韋毅銘, 何舟, 田海芬, 等. 羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝優化及其抗氧化、免疫活性[J]. 食品科學, 2017, 38(22):275-283. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722041. http://www.spkx.net.cn

WEI Yiming, HE Zhou, TIAN Haifen, et al. Optimization of preparation of carboxymethylated polysaccharides from longan (Dimocarpus longan) pulp by response surface methodology and their antioxidant activity and immunoregulatory activity[J]. Food Science,2017, 38(22): 275-283. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722041. http://www.spkx.net.cn