離線SPE-LVI-GC-FID法分析嬰兒配方奶粉中的飽和烴類礦物油

劉玲玲，張貞霞，李冰寧，武彥文,*

（1.北京市理化分析測試中心，北京市食品安全測試工程技術研究中心，北京市科學技術研究院分析測試技術重點實驗室，北京 100089；2.國防科技大學西安通信學院，陜西 西安 710106）

離線SPE-LVI-GC-FID法分析嬰兒配方奶粉中的飽和烴類礦物油

劉玲玲1，張貞霞2，李冰寧1，武彥文1,*

（1.北京市理化分析測試中心，北京市食品安全測試工程技術研究中心，北京市科學技術研究院分析測試技術重點實驗室，北京 100089；2.國防科技大學西安通信學院，陜西 西安 710106）

建立嬰兒配方奶粉中飽和烴類礦物油（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）的離線固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）結合大體積進樣-氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（large volume injection-gas chromatographyflame ionization detection，LVI-GC-FID）的分析方法。該方法以正己烷為提取溶劑，提取液經硝酸銀漬硅膠SPE柱凈化；通過比較不同長徑比SPE柱的凈化效果，確定以5 m L玻璃注射器作為分離MOSH的SPE柱，收集洗脫液5 m L，濃縮后注入LVI-GC-FID測定。GC的進樣口升溫程序為：初始溫度45 ℃，保持1 m in（分流比200∶1），以250 ℃/m in升溫至360 ℃（分流閥關閉2 m in），并保持27 m in（分流比為100∶1）；柱溫箱升溫程序為：35 ℃保持3 m in，以25 ℃/m in升溫至350 ℃，再以5 ℃/m in升溫至370 ℃，保持10 m in；FID溫度380 ℃；進樣量40 μL。結果表明：MOSH的標準品液體石蠟在2～500 mg/kg范圍內呈良好線性關系，相關系數為0.999，方法的定量限為0.05 mg/kg，加標回收率在92.62%～102.86%之間，相對標準偏差在0.85%～2.57%之間，適用于嬰兒配方奶粉中MOSH的定量分析。應用該方法檢測市售10 種嬰兒配方奶粉中的MOSH含量，其結果在0.24～1.30 mg/kg之間，其中MOSH（C16～C35）含量在0.12～0.85 mg/kg之間，表明有必要對嬰兒配方奶粉中的礦物油污染進行監管。

嬰兒配方奶粉；飽和烴類礦物油（MOSH）；固相萃?。⊿PE）；大體積進樣-氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（LVI-GC-FID）

礦物油是從石油原油分離得到的碳數為C10～C50的復雜烴類化合物，主要包括直鏈、支鏈烷烴和烷基取代的環烷烴（m ineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）以及烷基取代的芳香烴（m ineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH）兩大類[1]。食品中礦物油污染由來已久[2]，主要來源于包裝遷移、環境污染、食品加工過程等[1,3-4]。礦物油毒理學研究發現，人體皮下脂肪、淋巴結、脾臟、肝臟、肺、腎臟等器官中均含有相當數量的MOSH，其中以淋巴結和脾臟中MOSH含量最高，卻未檢測到MOAH[5]。歐洲食品安全局的研究顯示，MOSH（C16～C35）經膳食攝入后在體內積聚，會導致淋巴結、脾臟和肝臟等器官產生肉芽腫和慢性炎癥[1]。有研究發現，MOSH是人體內累積量最大的污染物[6]，其主要來源于食物攝入。因此，食品中MOSH的污染物值得關注[7]。在各類食品中，嬰兒食品最受重視，原因是嬰兒各臟器發育尚不成熟，如果長期食用受MOSH污染的食品，很可能產生健康危害。隨著社會發展，越來越多的嬰兒配方奶粉幫助嬰兒成長。因此，加強嬰兒配方奶粉中MOSH的監測非常必要。

MOSH化學組成復雜，其定量分析一般采用氣相色譜-氫火焰離子化檢測（gas chrom atography-flame ionization detection，GC-FID）。原因是FID系唯一對所有礦物油組分響應完全一致的檢測器，GC是與FID聯用的理想分離方式[8]。MOSH的GC譜圖是一個類似“駝峰”的寬峰，寬峰上方的尖峰為食品中的天然正構烷烴，定量計算時需要扣除，即MOSH含量通過計算GC譜圖的基線與駝峰之間的“空白”面積得到。然而，FID的靈敏度低、選擇性差，需要高度地凈化與富集目標物[4]。目前，液相色譜（liquid ch rom atog raphy，LC）與氣相色譜聯用（LC-GC）是最為常用的礦物油分析技術，它通過LC與GC的接口技術實現在線凈化、富集，有效提高了礦物油的純度與濃度[9-11]。然而，LC-GC儀器昂貴，無法普及，離線凈化技術成為另外一種解決途徑[12-14]。

目前，已有文獻主要集中在食用油、谷物、餅干、面包和巧克力等食品中MOSH的分析[15-27]，嬰兒配方奶粉中的礦物油調查尚未見報道。由于礦物油組成復雜，不同樣品基質中的干擾成分不同，因此，分析不同食品樣品中礦物油的具體方法不盡相同。本實驗采用配備了大體積進樣系統（large volume injection，LVI）的GC-FID建立嬰兒奶粉中MOSH的檢測方法，其創新之處在于：1）采用了操作簡便的固相萃取（solid phase extraction，SPE）柱凈化方法并優化了分離條件；2）通過優化LVIGC-FID條件將方法的定量限降低至0.05 mg/kg；3）根據奶粉基質的干擾特點，選擇了合適的內標（環己基環己烷（cyclohexyl cyclohexane，Cycy））進行準確定量。該方法操作簡便、實驗條件要求不高，適用于市售奶粉中MOSH含量的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰兒配方奶粉樣品10 個 市購。

硝酸銀（優級純） 天津佳燁貴研科技有限公司；正己烷、丙酮（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；硅膠（0.063～0.200 mm，600 ℃烘烤6 h后置于干燥器中備用） 美國M erck公司；MOSH標準液體石蠟（paraffin oil，PO）、內標Cycy、正十八烷烴（n-octadecane，C18）、MOSH洗脫終止標記物膽甾烷（5-α-cho lestane，Cho）、MOAH洗脫開始標記物1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-tri-tert-butylbenzene，TBB）、C7～C40正構烷烴混合標準溶液（均為色譜純） 美國Sigma-A ldrich公司。

1.2 儀器與設備

GC-2010 p lus氣相色譜儀（配備程序升溫蒸發進樣器和FID） 日本Shimadzu公司；N-EVAP氮氣吹干儀美國Organom ation公司；M illi-Q超純水設備 美國M illipore公司；HY-5A型回旋式振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；5 m L玻璃注射器（內徑13 mm） 上海玻利鴿工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別配制10 mg/m L的C18、Cho、TBB、Cycy貯備液。各取0.5 m L C18、Cho、TBB貯備液置于50 m L容量瓶，用正己烷定容得到100 m g/L混合標準溶液；取Cycy貯備液1 m L置于50 m L容量瓶，用正己烷定容得到200 mg/L內標溶液。

配制50 g/L液體石蠟貯備液，然后分別取2、5、10、20、50、100、500 μL于50 m L容量瓶中，正己烷定容得到質量濃度為2、5、10、20、50、100、500 mg/L的標準工作溶液。

1.3.2 樣品提取

分別稱取嬰兒配方奶粉樣品10.0 g于50 m L具塞錐形瓶中，加入60 μL 200 mg/L Cycy內標溶液，20 m L正己烷溶劑，振蕩2 h后靜置過夜。取10 m L上清液氮吹濃縮，并定容至1 m L備用。

1.3.3 樣品純化

1.3.3.1 0.3%硝酸漬硅膠制備

稱取99 g硅膠于1 000 m L鋁箔紙包裹外壁的圓底燒瓶中，用玻璃滴管逐滴加入1%硝酸銀溶液100 m L，然后用旋蒸儀繼續混勻2～3 h，靜置12 h后放入125 ℃烘箱干燥12 h。稱取37 g上述銀漬硅膠與63 g活化硅膠混勻得到0.3%硝酸銀漬硅膠，干燥器內避光保存，2 周內使用。

1.3.3.2 SPE柱制備

取5 m L玻璃注射器（外層包裹鋁箔紙），底部放入圓形玻璃纖維濾紙（經正己烷浸泡過夜），裝填3 g銀漬硅膠，輕輕敲實，上面再放入一層濾紙。用10 m L正己烷預淋洗SPE柱，棄去流出液，待液面近干時，加入1 m L上清液（1.3.2節），待上清液近干時，用10 m L正己烷洗脫，棄去先前流出的2 m L死體積洗脫液，收集后續的5 m L洗脫液，濃縮至0.2 m L，備用。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：A g i len t D B-5H T石英毛細管柱（15 m×0.25 mm，0.1 μm）；載氣為高純氮氣，恒壓模式，壓力60 kPa；進樣量40 μL。

PTV參數：初始溫度45 ℃，保持1 m in（分流閥打開，分流比200∶1），以250 ℃/m in升溫至360 ℃并保持27 m in，分流閥關閉2 m in，使目標組分進入分析柱；隨后打開分流閥，分流比為100∶1，吹走襯管中殘留物質。

GC分析條件：起始溫度35 ℃，保持3 m in，然后以25 ℃/m in升溫至350 ℃，再以5 ℃/m in升溫至370 ℃，保持10 m in；FID溫度380 ℃。

2 結果與分析

2.1 樣品提取

MOSH是非極性有機物，根據相似相溶原理，常用正己烷、異辛烷、正庚烷或者正構烷烴混合物（沸點65～75 ℃）提取食品中的MOSH。異辛烷、正庚烷沸點高于正己烷，樣品提取液濃縮時需要更長的揮發時間，因此選取正己烷作為樣品中MOSH提取溶劑。奶粉中的脂肪被酪蛋白包裹，須用堿性乙醚法或者酸水解法破壞酪蛋白使脂肪游離出來后實現脂肪的完全提取，但本實驗主要關注嬰兒配方奶粉中外部引入（食品包裝、加工等）的MOSH的污染情況，因此，采用正己烷浸泡過夜法對奶粉中MOSH進行提取[8]。

2.2 樣品凈化

SPE柱凈化的關鍵是填料。硅膠能夠有效吸附甘油三酯，是去除樣品中油脂的首選填料。此外，硅膠經過活化（400～600 ℃灼燒4～6 h）不僅可以增大吸附容量，而且能夠消除外來干擾。同時，硝酸銀漬硅膠具有吸附角鯊烯等烯烴干擾物的作用[13]。因此，采用的3 g的銀漬硅膠（0.3%）作為SPE柱填料（1.3.3.1節）用于吸附奶粉提取液中的油脂和烯烴，從而達到凈化礦物油的目的。

SPE柱的長徑比（即分離塔板數）對于分離效果也會產生影響。由于目前尚沒有凈化食品中礦物油的商品化SPE柱，本實驗參考Fiselier等[14]應用的內徑11 mm玻璃柱，定制了同樣內徑的玻璃分離柱，并同時比較了5 m L玻璃注射器（內徑13 mm）制備的SPE柱對1 m L奶粉基質下混和標準溶液（C18、Cho、TBB）的分離效果。實驗方法為將0.1 m L混和標準溶液（1.3.1節）加入奶粉提取液并定容至1 m L，分別上樣至兩種內徑的SPE柱，采用正己烷洗脫，洗脫液每流出1 m L即注入GC分析。結果表明：兩種內徑SPE柱的死體積均為2 m L，隨后都流出了MOSH的標記物C18和Cho，然后均在第8管開始流出MOAH前端的標記物TBB（圖1）。通常，同等量的柱填料裝入不同內徑的SPE柱中，柱管內徑越小，填料長度越長，相應的塔板數越高，分離效果越好。實驗結果也表明：內徑11 mm的SPE柱在第7管完成了MOSH的全部分離，即C18和Cho全部流出（圖1A）；然而，內徑13 mm凈化柱到7管也收集到了99%以上MOSH，僅有極少量（1%以下）C18和Cho在第8管與TBB共流出（圖1B）。由于實際應用中玻璃注射器方便易得、價格便宜。因此，本實驗采用5 m L玻璃注射器作為凈化礦物油的SPE柱。

圖1 混合標準溶液經過內徑11 mm（A）和內徑13 mm（B）SPE柱的洗脫順序Fig. 1 Selective elution of m ixture standard solution through SPE column w ith 11 mm and 13 mm i.d.

2.3 樣品分析

2.3.1 PTV初始溫度的確定

圖2 PTV優化條件下C10～C40的峰面積Fig. 2 Peak areas of n-alkanes (C10–C40）in GC chromatogram under optimal PTV conditions

MOSH由不同碳數的烷烴組成，碳數越低，沸點越低，如若PTV進樣口的溫度過高則會造成低沸點物質的揮發損失。本實驗采用C7～C40正構烷烴標準溶液（2 mg/L）直接注入GC，考察進樣過程的揮發損失。由圖2可見，正構烷烴中C10～C40的峰面積基本一致，說明C10之后的烷烴幾乎沒有揮發損失。即進樣口初始溫度設為45 ℃時可以有效抑制低沸點物質的分流逸出。因此，本實驗選用該進樣條件用于奶粉中MOSH的定量分析。此外，該實驗結果也表明可以選擇C10或碳數更高的烷烴作為MOSH的定量內標。

2.3.2 GC升溫速率的確定

MOSH的GC譜圖為跨度較長保留時間的一個寬峰（或“駝峰”），為了縮短保留時間，增大寬峰的高度便于定量。通常，程序升溫的速率越快，寬峰越“尖銳”，分析靈敏度越高。文獻中大多采用的升溫速率為20～25℃/m in，有的高達50℃/m in[8]。為了保持譜圖的基線穩定，本實驗優化GC的升溫程序為：起始溫度35 ℃（保持3 m in），選擇25 ℃/m in升溫至350 ℃，再以5 ℃/m in升溫至370 ℃（保持10 m in）。

2.3.3 定量方法的確定

內標法定量可以有效避免進樣量與樣品制備過程對分析準確度的影響[8]。一般內標法要求內標物應不受待測樣品中各組分的干擾，保留時間相近，但又必須可以完全分開。然而，由于MOSH呈寬峰形式，不同樣品MOSH寬峰位置會有偏左或偏右的位移（因為不同來源MOSH的組成不盡相同，其碳數范圍也略有差異），因此，選擇一個與之完全分離的內標物較為困難。

圖3 嬰兒配方奶粉提取液中MOSH的GC譜圖Fig. 3 GC chromatogram of MOSH in supernatant of infant formula

測定食用油中的MOSH的國際標準（ISO 17780）的定量內標采用C18[28]。由圖3可知，奶粉提取液的GC譜圖中存在C18的共流出物，因此，不能采用C18作為奶粉中MOSH的定量內標。而MOSH寬峰右邊的高沸點烷烴（如C40）的溶解性較差[8]。經過反復實驗，本實驗選取Cycy作為奶粉提取液中MOSH的定量內標，其出峰位置在C13附近，樣品的共流出干擾物較少，且不存在揮發損失。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍

將1.3.1節配制的液體石蠟系列工作溶液，在1.3.4節條件下分析。以GC譜圖中的寬峰面積（y）與相應質量濃度（x）繪制曲線，所得標準曲線為y = 47 554x-37 294，相關系數0.999，說明液體石蠟在2～500 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好。

2.4.2 定量限

定量限根據注入GC-FID的MOSH的濃度和體積確定。一般經驗認為注入FID的MOSH為50 ng以上時，其形成的GC寬峰才能滿足定量要求[8]。本實驗將5.0 g奶粉上清液濃縮至1 m L，經SPE柱凈化，將5 m L洗脫液濃縮至0.2 m L，注入GC-FID分析的體積為40 μL，即1.0 g奶粉被注入FID分析，因此對應的奶粉中MOSH的LOQ為0.05 mg/kg。

2.4.3 回收率實驗結果

任意選取一種奶粉作為樣品基質，分別添加液體石蠟標準溶液進行回收率實驗，添加量為0.5、1.0、2.0 mg/kg。提取液經3 g銀漬硅膠SPE柱凈化，每個試樣及空白分別平行測定3 次，計算平均加標回收率和相對標準偏差（表1）。結果表明，加標回收率在92.62%～102.86%之間，相對標準偏差在0.85%～2.57%之間，該方法的回收率和相對標準偏差均符合檢測要求。

表1 液體石蠟的加標回收率和相對標準偏差（n= 3）Table 1 Recoveries and RSD of paraffin oil (n= 3)

2.5 實際樣品的檢測

表2 市售嬰兒配方奶粉中的MOSH含量Table 2 Contents of MOSH in commercial in fant formu la

本實驗采用上述方法，檢測了市售不同廠家與品牌嬰兒配方奶粉中MOSH含量，結果見表2。結果表明，10 個嬰兒配方奶粉中只有樣品4和5未檢出MOSH，其余8 個樣品的MOSH含量在0.24～1.30 mg/kg之間，其中4 個樣品的C16～C35含量在0.12～0.30 mg/kg之間，其余4 個樣品的含量為0.66～0.85 mg/kg。按照聯合國糧農組織和世界衛生組織的食品添加劑聯合專家委員會規定的中低黏度礦物油（Ⅱ類和Ⅲ類）的每日容許攝入量（acceptable daily intake，ADI）0.01 mg/kg bw估算[29-30]，如果液體配方奶中含10%奶粉，嬰兒每日奶量800 m L，那么對于一個5 kg的嬰兒，每日即攝入80 g配方奶粉，對應的礦物油的特定遷移量（specific m igration lim it，SML）為0.625 mg/kg。參照此限量，粗略估計我國市售嬰兒配方奶粉中的40%（4/10）超過了食品添加劑聯合專家委員會的ADI值，因此我國奶粉中的MOSH污染情況不容忽視。

嬰兒配方奶粉中MOSH來源廣泛，主要污染可能來自于使用了含礦物油顏料印刷的回收包裝紙，也可能源于奶粉生產過程中添加的各種組分（如食用油）和生產過程中使用的潤滑油等[1]。本實驗僅選取我國市場上的10 個嬰兒配方奶粉作為樣本，后續將加大樣本量并判斷可能的污染來源，從而為監管嬰兒配方奶粉安全提供技術基礎。

3 結 論

建立一種離線SPE結合LVI-GC-FID法測定嬰兒配方奶粉中MOSH的方法，正己烷作為提取溶劑，凈化采用市售5 m L玻璃注射器裝填3 g銀漬硅膠SPE柱，凈化洗脫液經濃縮后注入LV I-GC-FID分析，其結果滿足方法學考察要求。與在線聯用的HPLC-GC-FID相比，離線SPE-LVI-GC-FID方法操作簡單、成本低，適用于普通實驗室對嬰兒配方奶粉中MOSH的檢測。本實驗測定了10 個市售嬰兒配方奶粉中MOSH的含量，結果表明：僅有2 個樣品未檢出，其中40%的樣品中MOSH（C16～C35）的含量超過了食品添加劑聯合專家委員會規定的ADI值，因此建議相關部門加強嬰兒配方奶粉中礦物油污染物的監管。

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Off-Line Solid Phase Extraction-Large Volume Injection-Gas Chromatography-Flame Ionization Detection(SPE-LVI-GC-FID) for the Analysis of M ineral Oil Saturated Hydrocarbons (MOSH) in Infant Formula

LIU Lingling1, ZHANG Zhenxia2, LI Bingning1, WU Yanwen1,*
(1. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing Food Safety Analysis and Testing Engineering Research Center,Key Laboratory of Analysis and Testing, Beijing Academy of Science and Technology, Beijing 100089, China;2. Xi’an Communication Institute, National University of Defense Technology, Xi’an 710106, China)

An alternative method based on an off-line solid phase extraction (SPE) combined w ith large volume injection-gas chromatography-flame ionization detection (LVI-GC-FID) was developed to determ ine mineral oil saturated hydrocarbons(MOSH) in infant formula. The MOSH in samples were extracted w ith n-hexane. The extract was purified by solid phase extraction (SPE) on a column packed w ith silica gel impregnated silver nitrate and the optimal SPE cartridge was 5 m L glass syringe as indicated by comparison of different length to diameter ratios. Five m illiliter of the pooled eluate was concentrated and then injected into the LVI-GC-FID system. The PTV parameters were as follows: the initial temperature was set at 45 ℃and held for 1 min (split ratio was 200:1), then increased to 360 ℃ at a linear gradient of 250 ℃/min and held for 27 min (split valve was closed for 2 m in followed by split ratio of 100:1). The GC column was heated from 35 ℃ (3 m in) to 350 ℃ at 25 ℃/min, and then raised to 370 ℃ (10 min) at 5 ℃/min. FID temperature was set at 380 ℃. The GC injection volume was 40 μL. The calibration curve of paraffin oil was linear in the range of 2–500 mg/kg w ith correlation coefficient of 0.999. The quantification limit (LOQ) of MOSH in infant formula was 0.05 mg/kg. The recoveries from spiked samples were between 92.62% and 102.86%, w ith relative standard deviation (RSD) of 0.85%–2.57%. This procedure was appliedto analyze MOSH in 10 commercial infant formula samples and the contam inant levels ranged from 0.24 to 1.30 mg/kg(0.12-0.85 mg/kg of MOSH between C16and C35). The results suggested that it is necessary to routinely detect m ineral oil contamination in infant formula for infant health.

infant formula; m ineral oil-saturated hydrocarbons (MOSH); SPE; LVI-GC-FID

2016-11-14

北京市科技計劃課題（Z161100000616005）；北京市科學技術研究院財政專項（PXM 2016_178305_000013；PXM 2017_178305_000001）

劉玲玲（1987—），女，碩士，主要從事食品分析方法研究。E-mail：lingling2@163.com

*通信作者：武彥文（1973—），女，研究員，博士，主要從事食品與油脂分析研究。E-mail：wu_yanwen@163.com

10.7506/spkx1002-6630-201722045

TS201.6

A

1002-6630（2017）22-0303-06

劉玲玲, 張貞霞, 李冰寧, 等. 離線SPE-LVI-GC-FID法分析嬰兒配方奶粉中的飽和烴類礦物油[J]. 食品科學, 2017,38(22): 303-308. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722045. http://www.spkx.net.cn

LIU Lingling, WU Yanwen, LI Bingning, et al. Off-line solid phase extraction-large volume injection-gas chromatographyflame ionization detection (SPE-LVI-GC-FID) for the analysis of m ineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) in infant formula[J]. Food Science, 2017, 38(22): 303-308. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722045. http://www.spkx.net.cn