水產(chǎn)品中恩諾沙星膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)及其前處理

張?chǎng)卫冢褰ㄐ拢?靜，王笑笑，林 洪，曹立民*

（中國海洋大學(xué) 食品安全實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003）

水產(chǎn)品中恩諾沙星膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)及其前處理

張?chǎng)卫冢褰ㄐ拢?靜，王笑笑，林 洪，曹立民*

（中國海洋大學(xué) 食品安全實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003）

目的：結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)建立膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)，用于水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。方法：以間接競(jìng)爭的實(shí)驗(yàn)原理，通過優(yōu)化檢測(cè)區(qū)抗原、質(zhì)控區(qū)二抗、金標(biāo)一抗檢測(cè)濃度初步建立膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法，并進(jìn)一步確定其檢測(cè)靈敏度、特異性、重復(fù)性等及前處理的優(yōu)化操作。結(jié)果：該方法檢測(cè)恩諾沙星的視覺檢測(cè)限為5 ng/m L，半定量檢測(cè)限為1.29 ng/m L。在大菱鲆、鲅魚、舌鰨、南美白對(duì)蝦陰性樣品中的平均添加回收率在78.3%～129%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。特異性實(shí)驗(yàn)表明，除對(duì)環(huán)丙沙星外，對(duì)其他相似物的特異性較好；環(huán)丙沙星的視覺檢測(cè)限為10 ng/m L，半定量檢測(cè)限為4.37 ng/m L，滿足國標(biāo)檢測(cè)的限量要求。同時(shí)，針對(duì)免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)的前處理方法進(jìn)行初步探究，最終確定采用常溫條件下磺基水楊酸提取的前處理方法。結(jié)論：恩諾沙星膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)具有簡單、快速、易操作、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，為食品藥物殘留檢測(cè)領(lǐng)域提供了檢測(cè)新方法。同時(shí)，選擇新型試劑作為膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)的前處理方法，該方法可以為多種快檢技術(shù)的前處理提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

恩諾沙星；免疫層析技術(shù)；毛細(xì)管；膠體金

恩諾沙星（enrofloxacin，EF）是人工合成的第3代氟喹諾酮類藥物，由于它具有抑菌范圍廣、吸收快、藥物在體內(nèi)存留時(shí)間長、藥效好的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和獸醫(yī)臨診中。近年來，隨著食物鏈富集現(xiàn)象，EF影響人體健康而受到廣泛重視與約束[1-3]。目前針對(duì)EF藥物殘留的檢測(cè)方法有很多，包括以高效液相色譜、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳分析法等為代表的大型儀器檢測(cè)法[4]，其靈敏度高，但需要使用大型儀器，檢測(cè)用時(shí)較長，前處理復(fù)雜；以酶聯(lián)免疫吸附法[5]、膠體金試紙條[6]為代表的傳統(tǒng)快速檢測(cè)方法，操作簡便、用時(shí)較短，但具有抗基質(zhì)干擾能力低、材料易受損等局限性；以熒光微球免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法[7-8]為代表的新型檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果易觀察，但過程較復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。因此，為了維護(hù)水產(chǎn)品市場(chǎng)的安全性和檢測(cè)需求，開發(fā)一種簡單、準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)即時(shí)即效的檢測(cè)方法，逐漸受到廣泛的重視。膠體金免疫層析毛細(xì)管技術(shù)[9]是本課題組研發(fā)的一種集合膠體金標(biāo)記和免疫層析的新型檢測(cè)技術(shù)，該方法以玻璃毛細(xì)管為基底，背景值低，檢測(cè)結(jié)果易觀察；且過程簡單，易操作，對(duì)檢測(cè)人員的操作要求較低；對(duì)食品中硝基呋喃類代謝物[10]和“瘦肉精”[9]的初步檢測(cè)應(yīng)用表明，具有較高的靈敏度和重復(fù)性，可初步滿足快檢要求。本研究選用膠體金免疫層析毛細(xì)管技術(shù)，建立EF膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法，并對(duì)于基質(zhì)干擾及前處理方法進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高其簡便性，最終利用不同水產(chǎn)品進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用效果驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)陰性樣品：大菱鲆、舌鰨、南美白對(duì)蝦 青島家樂福超市；鲅魚 青島佳世客超市。

氯金酸、檸檬酸三鈉、三乙胺 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum album in，BSA）、γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（3-glycidylo xypropyltrimethoxysilane，GPTMS） 美國Sigma公司；EF、鹽酸環(huán)丙沙星等標(biāo)準(zhǔn)品 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鼠抗EF抗體 寶安康公司；聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

毛細(xì)管 華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器；高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；HH.Bll.500-5電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；G4050掃描儀 中國惠普公司。

2017年河北省非油氣持證礦山企業(yè)從業(yè)人員18.81萬人，較上年減少2.14萬人。其中能源礦產(chǎn)11.71萬人(煤炭10.75萬人)；黑色金屬礦產(chǎn)4.35萬人(鐵礦2.23萬人)，較上年減少3 760人；有色金屬礦產(chǎn)0.13萬人，較上年減少545人；貴重金屬礦產(chǎn)0.84萬人，較上年減少937人；冶金輔助原料非金屬礦產(chǎn)0.32萬人，較上年增加506人；化工原料非金屬礦產(chǎn)0.21萬人，較上年減少7人；建材和其它非金屬礦產(chǎn)1.17萬人，較上年減少0.2萬人；礦泉水0.08萬人，較上年減少12人。

[12] GIOVANNOLI C, ANFOSSIA L, BAGGIANI C, et al. A novel approach for a non-competitive capillary electrophoresis immunoassay w ith laser-induced fluorescence detection for the determ ination of human serum album in[J]. Journal of Chromatography A, 2007,1155(2): 187-192. DOI:10.1016/j.chroma.2007.02.056.

1.3.1 測(cè)定原理

玻璃毛細(xì)管經(jīng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)試劑清洗處理后暴露羥基基團(tuán)，再經(jīng)硅烷試劑的修飾[10]，可通過結(jié)合環(huán)氧基團(tuán)[11]共價(jià)連接目的蛋白質(zhì)，將包被原（EF-BSA）和羊抗鼠二抗分別固定在玻璃毛細(xì)管兩端[12]，作為檢測(cè)區(qū)（TZ）和質(zhì)控區(qū)（CZ）。當(dāng)目標(biāo)藥物EF與金標(biāo)一抗以一定比例混合注入檢測(cè)區(qū)時(shí)，溶液中的EF與毛細(xì)管上的EFBSA同時(shí)競(jìng)爭結(jié)合金標(biāo)一抗，使金標(biāo)一抗結(jié)合在檢測(cè)區(qū)的顏色隨EF含量的增大而逐漸變淺甚至消失，即檢測(cè)結(jié)果判定為陽性；同樣，顏色未變淺表現(xiàn)為酒紅色的混合液，即判定結(jié)果為陰性。而質(zhì)控區(qū)的二抗與金標(biāo)一抗的結(jié)合顯色均為酒紅色，與EF含量無關(guān)，用以證明金標(biāo)一抗的結(jié)合活性，且質(zhì)控區(qū)顯色，結(jié)果判定才有效，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性、假陰性的現(xiàn)象，影響檢測(cè)結(jié)果。

1.3.2 膠體金及金標(biāo)抗體的制備

采用檸檬酸還原法[13]。通過添加不同的還原劑（檸檬酸三鈉）制備不同粒徑的膠體金粒子溶液。本實(shí)驗(yàn)在100 m L HAuCl4（1 mmol/L）在冷凝條件充分沸騰時(shí)，快速加入10 m L 38.8 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，待顏色由淡黃變?yōu)樯罴t色停止加熱，冷卻后過0.22 μm水系膜，制備出13 nm膠體金溶液。

根據(jù)Slot等[14]的方法選擇出最優(yōu)的pH值與蛋白標(biāo)記量，制備金標(biāo)抗體方面略有改動(dòng)。10 m L膠體金溶液中加入0.1 mol/L的K2CO3溶液，并緩慢加入適量的的鼠抗EFIgG抗體，使溶液保持約pH 8.0，緩慢均勻攪拌1 h后，加入5% BSA和1%的聚乙二醇（PEG 20000）溶液至最終體積的1/10，繼續(xù)攪拌1 h后，3 500 r/m in、4 ℃離心15 m in除去暗紅色沉淀，取上清液以10 000 r/m in、4 ℃離心65 m in收集沉淀，將沉淀溶于含有1% BSA、0.02% NaN3、5%蔗糖、0.1% Tween-20的1 m L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），重復(fù)離心收集沉淀，復(fù)溶至1 m L，置于-20 ℃?zhèn)溆茫行? 個(gè)月。

1.3.3 毛細(xì)管的洗滌與修飾

對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行簡單的清洗及處理后[10]，將清洗干凈的毛細(xì)管浸沒于含有10% GPTMS和1%三乙胺的無水甲苯的修飾液中，37 ℃過夜培養(yǎng)后，置于大平皿中，先用無水甲苯振蕩清洗3 次，每次約5 m in，再用丙酮振蕩清洗3 次，每次約5 min。室溫干燥保存?zhèn)溆茫行? 個(gè)月[11,15]。

1.3.4 毛細(xì)管的組裝與檢測(cè)

分別將2 μL的抗原和二抗依次注入到毛細(xì)管兩端，即為檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，37 ℃包被反應(yīng)40 m in，用含0.1%吐溫-20的0.01 mo l/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）（即洗滌液PBST，0.01 mol/L，pH 7.4）抽洗3 次，每次用洗滌液PBST約5 m L。再將毛細(xì)管全部浸入2% BSA溶液中，37 ℃封閉2 h，用PBST洗凈并室溫吹干，浸沒于0.01 mol/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中、4℃保存并于3個(gè)月之內(nèi)使用[10]。

取3 μL金標(biāo)抗體先注入檢測(cè)區(qū)，待反應(yīng)15 m in后，將金標(biāo)抗體溶液推入質(zhì)控區(qū)，常溫反應(yīng)15 m in后，用PBST洗凈吹干，用掃描儀進(jìn)行灰度掃描。

1.3.5 包被液及金標(biāo)一抗工作濃度的優(yōu)化

將包被原EF-BSA、羊抗鼠二抗配制成一定質(zhì)量濃度梯度的稀釋液，分別包被在毛細(xì)管的一端，3 組平行，檢測(cè)方法同1.3.4節(jié)。以檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)顯色較深的最小包被量為包被原與二抗最適的包被質(zhì)量濃度。

2.4.1 膠體金免疫層析毛細(xì)管的靈敏度測(cè)試

二是金融監(jiān)管制度的設(shè)立缺乏市場(chǎng)化導(dǎo)向。目前政府制定的監(jiān)管制度體現(xiàn)的政府行為多，指導(dǎo)性強(qiáng)，缺乏以市場(chǎng)為導(dǎo)向。比如，經(jīng)濟(jì)發(fā)展形成著不同的波段與周期，在經(jīng)濟(jì)衰退時(shí),金融機(jī)構(gòu)的信貸損失高于經(jīng)濟(jì)上漲時(shí)的信貸損失，金融機(jī)構(gòu)的放貸能力必然受到很大的影響。在經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展和上漲時(shí),金融機(jī)構(gòu)必然會(huì)計(jì)量出經(jīng)濟(jì)運(yùn)行中的信貸損失低于經(jīng)濟(jì)放慢和下行時(shí)的信貸損失。此時(shí)，金融機(jī)構(gòu)的放貸意愿必然大大增強(qiáng)。同時(shí)，在這種上漲與下行的波動(dòng)與周期性的振蕩中，企業(yè)對(duì)資本的需求和金融機(jī)構(gòu)的信貸也隨時(shí)進(jìn)行調(diào)整。而我們的監(jiān)管制度在監(jiān)管中往往缺乏這種靈活的監(jiān)管方式，市場(chǎng)中順周期性在所難免。

1.3.6 膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法的性能實(shí)驗(yàn)

1）重理論，輕實(shí)踐。在職業(yè)院校發(fā)展初期，這個(gè)特點(diǎn)是職業(yè)院校的通病，其產(chǎn)生有著很重的歷史背景。原因一是原有的職業(yè)院校教學(xué)體系是繼承本科院校的，很多院校只是單純地調(diào)整課程體系或降低課本的難度，沒有摸索出職業(yè)院校人才培養(yǎng)模式；原因二是師資隊(duì)伍缺失，原有的職業(yè)教育社會(huì)地位低，無法吸引好的專業(yè)人才加入，特別是一些雙師型教師的缺乏，直接導(dǎo)致教學(xué)質(zhì)量不理想。

1.3.6.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將系列質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)EF溶液與金標(biāo)一抗混合后，注入毛細(xì)管檢測(cè)區(qū)，按照上述方法檢測(cè)。運(yùn)用相對(duì)灰度比值與EF質(zhì)量濃度可形成四元擬合確定其半定量檢測(cè)限，并以視覺能分析的前提下確定視覺檢測(cè)限。

1.3.6.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

式中:H為單位質(zhì)量反應(yīng)熱;Cp為樣品平均比熱容。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的初始反應(yīng)溫度T0、反應(yīng)最高溫度Tf替代H/Cp及α,并聯(lián)立上述兩式可得絕熱溫升速率方程:

[6] 潘明飛, 王俊平, 方國臻, 等. 食品中農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)新技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(15): 277-282. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201415056.

1.3.6.3 特異性實(shí)驗(yàn)

把誠信企業(yè)建設(shè)作為守法經(jīng)營、誠信經(jīng)營、自律經(jīng)營的重要抓手，努力塑造上海化工良好的社會(huì)形象。截至2017年，上海在冊(cè)登記誠信企業(yè)建設(shè)單位達(dá)80家，獲得一星級(jí)誠信企業(yè)稱號(hào)9家，二星級(jí)4家，三星級(jí)16家，四星級(jí)11家，五星級(jí)1家。這些誠信企業(yè)成為本市化工行業(yè)誠信標(biāo)桿，獲得了良好的社會(huì)公信度。

有沒有人懷疑過索緒爾上面所舉的例子呢？答案是肯定的，我們現(xiàn)在能知道的、最早懷疑索緒爾所舉例子的是法國語言學(xué)家本維尼斯特[14]，他認(rèn)為索氏的例子不僅不能說明語言符號(hào)是任意的，反而讓符號(hào)定義陷入矛盾之中，他說：

1.3.6.4 膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)前處理的探究

在崔夢(mèng)琪等[16]方法研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合磺基水楊酸與加熱處理進(jìn)行樣品前處理研究，即取1.0 g空白樣品（南美白對(duì)蝦、大菱鲆、草魚）添加2 m L 2%磺基水楊酸溶液勻漿后，分別置于室溫及水浴60、70、80、90 ℃的條件下處理15 m in，4 500×g、4℃離心15 m in，取上清液用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 8.0～8.5，并過0.45 μm膜制成待測(cè)溶液。通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至1 mg/m L并使用聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒制備凝膠進(jìn)行電泳分析，電泳操作參照陸宗超的方法[17]。進(jìn)行電泳時(shí)，設(shè)置電泳初始電壓為80 V，約30 m in后濃縮膠和分離膠交界處，各泳道樣品保持一條直線時(shí)，將電壓上升至120 V，繼續(xù)1 h左右，溴酚藍(lán)指示劑處于電泳槽底部，停止電泳，將凝膠輕輕取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，水平振蕩染色2 h，再于脫色液中脫色過夜。最后，將凝膠取出并保持濕潤狀態(tài)，置于掃描儀中掃描，分析探究不同溫度對(duì)水產(chǎn)品蛋白降解效果，優(yōu)選出快速、高效的前處理方法。

將不同質(zhì)量濃度梯度包被抗原EF-BSA與羊抗鼠二抗包被在毛細(xì)管上，通過與抗體顯色反應(yīng)，選取保持穩(wěn)定紅色的最小抗原與二抗量為最優(yōu)包被量。由圖2可知，包被抗原EF-BSA質(zhì)量濃度為0.075 mg/m L，羊抗鼠二抗質(zhì)量濃度為0.69 mg/m L。

選取大菱鲆、鲅魚、舌鰨、南美白對(duì)蝦為實(shí)際樣品，經(jīng)黃海水產(chǎn)研究所采用農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告—1—2008《水產(chǎn)品中17 種磺胺類及15 種喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的檢測(cè)方法驗(yàn)證均為EF與環(huán)丙沙星陰性樣品。樣品處理參照崔夢(mèng)琪[16]的方法并稍作改動(dòng)：取（1.0±0.1）g空白樣品添加EF標(biāo)準(zhǔn)溶液使其相對(duì)于水產(chǎn)樣品的含量分別為6、30、100 μg/kg（樣品），室溫振蕩2 h使混合物充分混勻，添加2 m L 2%磺基水楊酸溶液勻漿1～2 m in后，4 500×g、4 ℃離心15 m in，取上清液用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 8.0～8.5，并過0.45 μm膜制成待測(cè)溶液，置于4 ℃避光保存，檢測(cè)時(shí)與金標(biāo)抗體按一定比例混合，測(cè)定其回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。鹽酸環(huán)丙沙星樣品前處理時(shí)藥物加標(biāo)量為16、60、160 μg/kg（樣品），其他操作同EF。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠抗EF抗體親和常數(shù)的計(jì)算

親和常數(shù)主要用于描述抗體的活性，表示抗原與抗體之間特異性結(jié)合的緊密程度[18]。本實(shí)驗(yàn)采用常用的非競(jìng)爭結(jié)合法，以抗原與抗體結(jié)合程度達(dá)到飽和程度一半即最大吸光度一半時(shí)的抗體濃度的倒數(shù)為抗體的親和常數(shù)。通過四參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，并結(jié)合Beatty推導(dǎo)的親和常數(shù)公式[19]，計(jì)算鼠抗EF抗體的親和常數(shù)為1.35×107L/mol，滿足檢測(cè)方法建立的要求。

2.2 膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物的制備

膠體金顆粒容易受到電解質(zhì)、pH值、溫度等因素的影響而發(fā)生聚沉[20]，本實(shí)驗(yàn)通過控制膠體金溶液的K2CO3與抗體質(zhì)量濃度優(yōu)化制備金標(biāo)抗體的pH值與抗體用量，以保持紅色的最低質(zhì)量濃度K2CO3與抗體質(zhì)量濃度為最優(yōu)[21]，因此，確定了在pH 8.0、蛋白質(zhì)量濃度為24 μg/m L的條件下，制備出穩(wěn)定的膠體金-抗體蛋白復(fù)合物[22]。為了使膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物維持較為穩(wěn)定的溶液體系，在實(shí)際制備中選取（100+20）%的抗體標(biāo)記量比例[23]即28.8 μg/m L進(jìn)行標(biāo)記。

2.3 膠體金免疫層析毛細(xì)管的組裝

2.3.1 包被液組裝濃度的優(yōu)化

1.3.6.5 在實(shí)際樣品中的性能驗(yàn)證

圖2 檢測(cè)區(qū)（A）與質(zhì)控區(qū)（B）組裝質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig. 2 Optim ization of EF-BSA concentration in the test zone and secondary antibody concentration in the control zone

2.3.2 膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)比例的優(yōu)化

按照已經(jīng)確定好的抗原和二抗的包被量進(jìn)行毛細(xì)管的組裝，進(jìn)一步確定一抗的檢測(cè)比例。本實(shí)驗(yàn)通過1∶1～1∶6的一抗稀釋比例如圖3所示，選取使檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)顏色相近且肉眼易區(qū)分的稀釋比例為最優(yōu)，且通常情況下相對(duì)灰度值在27以上均易觀察。由于膠體金免疫層析毛細(xì)管的檢測(cè)靈敏度與稀釋比例呈正相關(guān)，因此確定膠體金標(biāo)記抗體與樣品稀釋液體積比為1∶3，以保證在靈敏度與肉眼易區(qū)分中都達(dá)到較好的效果。

學(xué)生在進(jìn)行時(shí)事新聞評(píng)論活動(dòng)時(shí)，從選題分析到團(tuán)隊(duì)分工協(xié)作，從素材的選擇到PPT制作，從資料收集到理論探討，從語言表達(dá)到交流互動(dòng)，都是對(duì)自身能力的訓(xùn)練，每一個(gè)細(xì)節(jié)都體現(xiàn)了學(xué)生的自主性和創(chuàng)造性。不同學(xué)生的審美風(fēng)格以及不同觀點(diǎn)，會(huì)使課堂成為一個(gè)五彩繽紛的萬花筒。通過找、選、做、講、評(píng)等活動(dòng)鍛煉了學(xué)生的綜合能力，是實(shí)現(xiàn)了學(xué)生間的共享，促進(jìn)了師生的良性互動(dòng)。

圖3 膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)濃度的優(yōu)化Fig. 3 Optim ization of the concentration of colloidal gold-labeled antibody

2.4 膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法的性能

隨著護(hù)理事業(yè)的發(fā)展，男護(hù)已經(jīng)成為護(hù)理隊(duì)伍中不可缺少的重要組成部分。護(hù)理工作不同于一般服務(wù)行業(yè)的從業(yè)人員，工作要求專業(yè)性、技術(shù)性、知識(shí)性較強(qiáng)，因而男護(hù)在就業(yè)方面有著較高的優(yōu)越性。所以男護(hù)生進(jìn)軍護(hù)理行業(yè)勢(shì)在必得，通過此次調(diào)查，可以看出我院男護(hù)生對(duì)護(hù)理行業(yè)就業(yè)意向率較高，對(duì)護(hù)理行業(yè)認(rèn)可度也較高。男護(hù)生希望大一就接受就業(yè)指導(dǎo)，所以作為教師在日常教學(xué)中就應(yīng)該給學(xué)生多提供相關(guān)的就業(yè)指導(dǎo)知識(shí)，其次要幫助學(xué)生提高求職技能。

將優(yōu)化好的包被原和二抗分別固定于毛細(xì)管兩端，取3 μL不同稀釋比例的金標(biāo)一抗分別注入檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，方法同上。以檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)顯色較深且不再增加的最大稀釋比例為最適的金標(biāo)抗體工作比例。

根據(jù)添加不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行毛細(xì)管的檢測(cè)，并確定視覺檢測(cè)靈敏度與半定量檢測(cè)限。如圖4所示，隨EF標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的遞增，檢測(cè)區(qū)顏色由明顯的紅色逐漸變淺，甚至消失。根據(jù)M artina的視覺檢測(cè)限定義，視覺檢測(cè)限[24]是以肉眼可區(qū)分檢測(cè)區(qū)顏色明顯淺于陰性對(duì)照組的檢測(cè)區(qū)顏色的最低EF含量表示，因此可確定膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)EF的視覺檢測(cè)限為5 ng/m L。

圖4 EF視覺檢測(cè)限顯色結(jié)果Fig. 4 Visual detection lim it for enrofloxacin

半定量檢測(cè)限的確定是結(jié)合圖像掃描處理技術(shù)，通過掃描儀進(jìn)行灰度掃描，此時(shí)得到3 組灰度值為檢測(cè)區(qū)灰度Bt、質(zhì)控區(qū)灰度值Bc、背景灰度值Bb，按公式計(jì)算相對(duì)灰度值[9]：實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)區(qū)相對(duì)灰度值BT（BT=Bb-Bt），實(shí)驗(yàn)組質(zhì)控區(qū)相對(duì)灰度值BC（BC=Bc-Bt），空白組的檢測(cè)采用PBS緩沖液代替EF標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，其空白相對(duì)灰度值B0（B0=Bb-Bt0）。通過相對(duì)灰度比值BT/B0對(duì)EF標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度形成四參數(shù)擬合曲線如圖5所示，根據(jù)得到的擬合方程計(jì)算，以3 倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差定義為EF膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)的半定量檢測(cè)限[25]。所以根據(jù)方程計(jì)算所得的半定量檢測(cè)限為1.29 ng/m L。

圖5 膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)相對(duì)灰度比對(duì)EF質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線Fig. 5 Calibration curve constructed by p lotting B T/B0 ratio against EF concentration

2.4.2 膠體金免疫層析毛細(xì)管重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于5 個(gè)批次組裝的膠體金免疫層析毛細(xì)管，檢測(cè)3、12 ng/m L的EF樣品，得出5 批次的批間差異相對(duì)偏差為2.04%、1.72%（n=5）；對(duì)于同一批次組裝的20 根膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)3、12 ng/m L的樣品，其批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.72%、1.43%。說明膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)樣品時(shí)顯色重復(fù)性好，且高濃度使檢測(cè)區(qū)顏色消失的視覺檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性也穩(wěn)定，因此，膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)可穩(wěn)定的檢測(cè)EF藥物殘留。

2.4.3 膠體金免疫層析毛細(xì)管特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

術(shù)后惡心嘔吐(post operative nausea and vomiting，PONV)在手術(shù)患者中的發(fā)生率約為25%～35%，是住院患者不適及導(dǎo)致延遲出院的主要因素之一。PONV的病因是多因素的：主要包括患者自身因素、鎮(zhèn)痛方案和手術(shù)因素。非吸煙者、女性患者、既往有暈動(dòng)病病史以及使用阿片類鎮(zhèn)痛藥等都是PONV的高危人群。除此之外，揮發(fā)性吸入麻醉藥、笑氣和阿片類藥物都對(duì)PONV有影響。在這些患者，應(yīng)預(yù)防性應(yīng)用多聯(lián)止吐藥物。

表1 膠體金免疫層析毛細(xì)管特異性鑒定Table 1 Specificity of CICA for detection of enrofloxacin analogues

針對(duì)EF的膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)的特異性如表1所示，對(duì)于EF在魚類等動(dòng)物體內(nèi)的代謝物環(huán)丙沙星，具有顯著的交叉反應(yīng)率，以同樣的方法測(cè)定環(huán)丙沙星顯色的檢測(cè)限，并形成四參數(shù)擬合曲線如圖6所示，確定環(huán)丙沙星的半定量檢測(cè)限和視覺檢測(cè)限分別為4.37、10 ng/m L；諾氟沙星和洛美沙星同屬于氟喹諾酮類藥物，結(jié)構(gòu)上與EF較為類似，因此在較高質(zhì)量濃度下也存在不同程度的交叉反應(yīng)率[26]；對(duì)于氯霉素和土霉素等族外抗生素，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到105ng/m L時(shí)，仍然沒有出現(xiàn)陽性結(jié)果，說明本方法對(duì)于這些藥物具有很高的特異性。

圖6 膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)相對(duì)灰度比對(duì)環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Calibration curve constructed by plotting B T/B0 ratio against CIP concentration

據(jù)了解，各國及組織對(duì)EF的殘留檢測(cè)要求不同，但針對(duì)EF的檢測(cè)指標(biāo)，均是對(duì)EF及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的共同檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行限定，其中日本“肯定列表”規(guī)定EF在日本魚貝類的限量[27]為10 μg/kg，歐盟規(guī)定其在畜禽肌肉內(nèi)臟中的限量[27]為30 μg/kg，而中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定EF檢測(cè)限量[28]明確規(guī)定為EF與環(huán)丙沙星的檢測(cè)總量不得超過100 μg/kg。本實(shí)驗(yàn)建立的EF膠體金免疫層析毛細(xì)管方法能夠同時(shí)識(shí)別EF和環(huán)丙沙星兩種藥物殘留，其視覺檢測(cè)限分別為5 ng/m L和10 ng/m L。由此推算，本方法的檢測(cè)限量是充分滿足農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中規(guī)定的限量要求，可作為EF現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的半定量篩檢方法。

導(dǎo)軌架由多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)節(jié)通過螺栓聯(lián)結(jié)而成，用來支撐和引導(dǎo)吊籠沿著導(dǎo)軌升降，完成施工任務(wù)，在施工升降機(jī)工作過程中，起著至關(guān)重要的作用。

2.4.4 膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)前處理的探究

[29-31]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)效果影響很大，因此選擇崔夢(mèng)琪建立的磺基水楊酸前處理方法[16]應(yīng)用到膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法上，對(duì)南美白對(duì)蝦、大菱鲆、草魚樣品采用磺基水楊酸前處理方法結(jié)合不同溫度熱處理，將處理后的溶液過膜測(cè)定其蛋白含量變化，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定，如圖7、8所示。

圖7 基于磺基水楊酸的不同前處理方法對(duì)蛋白含量的影響Fig. 7 Effect of different p retreatment methods w ith sulfosalicyclic acid on protein content

磺基水楊酸在室溫條件下，會(huì)使3 種水產(chǎn)品的蛋白質(zhì)量濃度明顯降低；隨溫度升高，蛋白質(zhì)量濃度的降解趨勢(shì)變緩。在70 ℃水浴加熱處理時(shí)，3 種水產(chǎn)品的蛋白質(zhì)量濃度降至最低，而隨溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)波動(dòng)現(xiàn)象。進(jìn)一步結(jié)合電泳結(jié)果如圖8所示，蝦樣品在磺基水楊酸與不同溫度的處理方法上，呈現(xiàn)出比較穩(wěn)定的規(guī)律，即隨溫度升高，對(duì)雜蛋白的降解效果越好；在大菱鲆、草魚的樣品處理上，溫度的影響卻不明顯，在80、90 ℃的高溫狀態(tài)下，可以明顯看出雜蛋白聚集、拖帶、甚至重新聚合成一個(gè)新的蛋白條帶。

圖8 基于磺基水楊酸的不同前處理方法的比較Fig. 8 Com parison of different p retreatment methods based on sulfosalicyclic acid

結(jié)合蛋白質(zhì)量濃度與種類變化規(guī)律分析原因，可能是高溫與磺基水楊酸結(jié)合處理使蛋白質(zhì)破壞，形成交聯(lián)；隨溫度升高使交聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)一步破壞、重組，進(jìn)而形成蛋白條帶的彌散現(xiàn)象。這與Petruccelli等[32]發(fā)現(xiàn)高溫使蛋白變性進(jìn)一步亞基聚合的結(jié)論相同，而且郭鳳仙等[33]表示蛋白質(zhì)熱變性中產(chǎn)生的穩(wěn)定聚集體，其主要原因是二硫鍵的形成。因此，高溫結(jié)合磺基水楊酸的前處理方法，使水產(chǎn)品產(chǎn)生的新的交聯(lián)蛋白質(zhì)，可能對(duì)膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)造成二次干擾；同時(shí)考慮到前處理的簡便程度，本實(shí)驗(yàn)的前處理方法采用室溫條件下磺基水楊酸處理水產(chǎn)品，進(jìn)行藥物殘留的檢測(cè)。

2.4.5 膠體金免疫層析毛細(xì)管對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)

在驗(yàn)證為陰性樣品的大菱鲆、鲅魚、舌鰨、南美白對(duì)蝦中分別添加EF和鹽酸環(huán)丙沙星，每個(gè)添加水平的樣品分別檢測(cè)3 次，隨著EF添加量的增加，毛細(xì)管檢測(cè)區(qū)的視覺顏色逐漸變淺，當(dāng)EF和環(huán)丙沙星添加量分別達(dá)到100 μg/kg和160 μg/kg時(shí)，顏色幾乎消失。通過在四參數(shù)擬合得到的EF與環(huán)丙沙星添加回收率如表2所示，平均回收率在76.84%～129%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，符合檢測(cè)技術(shù)的要求。通過多種復(fù)雜樣品的檢測(cè)驗(yàn)證，說明EF膠體金免疫層析毛細(xì)管有很強(qiáng)的適用性與實(shí)用性，為膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)的推廣提供了方向。

表2 實(shí)際樣品添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recoveries of the method for different spiked real samples

2.4.6 膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法與常用快速檢測(cè)方法的比較

近年來，快速檢測(cè)方法越來越受到廣泛的重視，對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度、操作的簡便性等綜合性能的要求也愈加嚴(yán)格。由于本研究所用的抗體由寶安康公司提供，因此，將膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法與目前寶安康公司的商業(yè)化試紙條進(jìn)行了主要性能的對(duì)比，同時(shí)也與部分水產(chǎn)品快檢相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，，結(jié)果如表3所示，膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)呈現(xiàn)出相對(duì)較高的優(yōu)越性，如：檢測(cè)全程用時(shí)上從1～2 h明顯減少到25 m in；與市場(chǎng)用檢測(cè)試紙條檢測(cè)限相同，但本實(shí)驗(yàn)的前處理僅約10 m in即可完成；不使用有機(jī)試劑，不需要大型儀器；檢測(cè)取樣量少；靈敏度也明顯提高等優(yōu)點(diǎn)。因此，基于這些優(yōu)勢(shì)，膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)是符合現(xiàn)代快速檢測(cè)領(lǐng)域的需求，具有快速檢測(cè)領(lǐng)域的相對(duì)競(jìng)爭力。

表3 不同快速檢測(cè)方法的檢測(cè)限比較Table 3 Comparison of detection lim its of different methods

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合膠體金標(biāo)記法與免疫層析法的原理，以玻璃毛細(xì)管為載體，建立了一種新型檢測(cè)EF的膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法。使用該方法檢測(cè)EF的視覺檢測(cè)限為5 ng/m L、半定量檢測(cè)限為1.29 ng/m L，同時(shí)對(duì)其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星也具有較靈敏的視覺檢測(cè)限10 ng/m L，初步實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)。對(duì)新建立的方法進(jìn)行了重復(fù)性等性能與實(shí)際樣品檢測(cè)的驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法在檢測(cè)不同水平的添加回收實(shí)驗(yàn)中，添加回收率均在76.84%～129%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10 %以下，滿足檢測(cè)技術(shù)的基本要求，說明膠體金免疫層析毛細(xì)管技術(shù)能耐受水產(chǎn)品基質(zhì)的復(fù)雜程度而較準(zhǔn)確的檢測(cè)水產(chǎn)品EF殘留。

膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)秉承現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)的目的，在操作簡便性方面?zhèn)涫荜P(guān)注，因此，在課題組關(guān)于前處理方法優(yōu)化探究的前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了簡便的前處理方法，將磺基水楊酸應(yīng)用于膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)方法上，并結(jié)合熱處理方法優(yōu)化其操作簡便性，初步探究磺基水楊酸與熱處理相結(jié)合來沉降蛋白質(zhì)的效果，從而驗(yàn)證并優(yōu)選膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)的前處理方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磺基水楊酸與高溫結(jié)合處理下的蛋白質(zhì)確實(shí)可以被破壞，并隨溫度升高，被破壞的蛋白質(zhì)進(jìn)一步重組、聚合，形成新的干擾蛋白條帶。而在室溫（10～30 ℃）沉降蛋白效果明顯，不易形成新的重組蛋白，可排除重組蛋白對(duì)免疫檢測(cè)的二次干擾，同時(shí)考慮到操作、用時(shí)等方面，選擇室溫條件結(jié)合磺基水楊酸處理待測(cè)樣品。本實(shí)驗(yàn)研究膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)前處理方法的簡便性，采用磺基水楊酸作為前處理的主要試劑，與其他檢測(cè)前處理方法不同，該方法提取液單一、不采用有機(jī)試劑，且操作簡單、用量少，可滿足市場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域中微量樣品的檢測(cè)。在行業(yè)快速簡便的需求驅(qū)使下，前處理方法日趨簡化、有效、準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)探究的前處理方法，不僅可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，也為免疫檢測(cè)尤其是易受蛋白質(zhì)基質(zhì)影響的檢測(cè)，提供了新的前處理方法和研究思路。

本研究所建立的膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)為水產(chǎn)品中EF藥物殘留的檢測(cè)技術(shù)提供了新思路、新方法，并有望將其推廣利用在其他農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)領(lǐng)域。

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分別檢測(cè)質(zhì)量濃度為100、101、102、103、104、105ng/m L的EF、鹽酸環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、土霉素等不同藥物，驗(yàn)證EF膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)法的特異性。

按照優(yōu)化后的最佳條件組裝5 批次的膠體金免疫層析毛細(xì)管，隨機(jī)抽取3 根毛細(xì)管檢測(cè)質(zhì)量濃度3 ng/m L與12 ng/m L EF標(biāo)準(zhǔn)溶液；并隨機(jī)抽取同一批次的30 根毛細(xì)管，同法檢測(cè)3 ng/m L與12 ng/m L EF標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別驗(yàn)證批間與批內(nèi)重復(fù)性。

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吳耕連忙搖頭：“我不會(huì)下圍棋啊，倒是會(huì)下一點(diǎn)雙陸，在村里，我們沒事就用樹枝橫豎三道畫個(gè)棋盤，撿石頭籽下雙陸。”

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綜上所述，隨著信息時(shí)代的到來，為了跟上網(wǎng)絡(luò)發(fā)展的步伐，我們應(yīng)該提高新聞編輯的價(jià)值，根據(jù)實(shí)際情況強(qiáng)化信息的使用質(zhì)量，這對(duì)于新聞發(fā)展有著比較大的作用。而新聞播音主持作為公眾人物，應(yīng)該注意從自身做起，提高自身的語言表達(dá)能力，時(shí)刻記著自身的責(zé)任和義務(wù)，在播報(bào)的過程中將自身的個(gè)性化技巧表現(xiàn)出來，吸引人們的注意力，從而在一定程度上提高電視新聞的收視率，促進(jìn)電視新聞播音主持行業(yè)的發(fā)展。

1.3 方法

綜上各種因素，朝藿定B、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿苷、木犀草素、槲皮素、川陳皮素、山柰酚、寶藿苷Ifs/i的RSD依次為0.30%、0.81%、1.11%、0.79%、2.24%、0.80%、2.96%、0.57%和1.35%，表明該方法各成分fs/i耐用性較好。

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Development of a Nano-Gold Capillary Immunochromatographic Assay and Comparison of Different Sample Pretreatments for Detection of Enrofloxacin in Aquatic Products

ZHANG Xinlei, SUI Jianxin, CHEN Jing, WANG Xiaoxiao, LIN Hong, CAO Lim in*
(Food Safety Laboratory, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To establish a nano-gold capillary immunochromatographic assay (CICA) based on a combination of colloidal-gold labeling and Immunochromatography for the rapid field detection of enrofloxacin (EF) residues in aquatic products. Methods: Based on the principle of indirect competitive immunoreaction, the CICA method was developed by optim izing antigen concentration in the test area, secondary antibody in the control area and gold-labeled antibody standard concentration. Then the sensitivity, specificity and repeatability of this method and several sample pretreatments were evaluated. Results: The visual and sem i-quantitative detection lim its for EF were estimated to be 5 and 1.29 ng/m L,respectively. The recoveries of EF in spiked negative samples of turbot, Spanish mackerel, tonguefishes, and Pacific while shrimp (P. vannamei) were 78.3%–129% and The intra- and inter-assay precision expressed as relative standard deviation(RSD) was less than 10%. Specificity analysis indicated that this method had strong specificity to all analogues except ciprofloxacin (CIP), for which the visual and sem i-quantitative detection lim it were 10 and 4.37 ng/m L, respectively and met the requirement of the national standard of China. Sulfonic acid extraction under normal temperature conditions was chosen as the optimal pretreatment method for CICA. Conclusion: CICA was a simple, rapid, easy-to-operate and reproducible method and could provide a new approach for the detection of antibiotic residues in aquatic products. Meanwhile, the pretreatment method for CICA chosen in this study can provide a theoretical basis and technical support for other rapid detection methods.

enrofloxacin; immunochromatography; capillary; colloidal gold

10.7506/spkx1002-6630-201722048

TS254.7

A

1002-6630（2017）22-0322-08

2016-11-14

張?chǎng)卫冢?990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：zhangxinlei.hao@163.com

*通信作者：曹立民（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：caolim in@ouc.edu.cn

張?chǎng)卫? 隋建新, 陳靜, 等. 水產(chǎn)品中恩諾沙星膠體金免疫層析毛細(xì)管檢測(cè)及其前處理[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):322-329. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722048. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xinlei, SUI Jianxin, CHEN Jing, et al. Development of a nano-gold capillary immunochromatographic assay and comparison of different sample pretreatments for detection of enrofloxacin in aquatic products[J]. Food Science, 2017,38(22): 322-329. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722048. http://www.spkx.net.cn