按經選穴針刺對失眠大鼠下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸相關激素的影響

吳雪芬 岳增輝 鄭雪娜 郭鑫 謝志強 謝莉娜

摘要：目的 觀察按經選穴針刺對失眠大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質（HPA）軸相關激素含量及腧穴配伍效應的影響，探討針刺治療失眠癥的作用機制。方法 腹腔注射對氯苯丙氨酸混懸液建立失眠模型大鼠。將60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、百會+神門組、百會+三陰交組、百會+非經非穴組，每組12只。各治療組針刺相應腧穴，每次30 min，連續7 d。ELISA檢測下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）及血清促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質酮（CORT）的含量。結果 與模型組比較，各針刺組大鼠下丘腦CRH及血清ACTH、CORT的含量均有一定程度降低；各針刺組間比較，百會+神門組的療效優于百會+三陰交組及百會+非經非穴組。結論 針刺可能通過調節HPA軸相關激素水平起到鎮靜安神的作用，按經選穴針刺可能是影響腧穴配伍效應的影響因素之一。

關鍵詞：針刺；失眠；下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸；按經選穴；腧穴配伍；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.013

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）11-0053-05

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture treatment on the levels of HPA axis related hormones and acupoint compatibility in insomnia rats； To discuss the mechanism of action for acupuncture treatment. Methods Chlorophenylalanine suspension was under intraperitoneal injection to establish insomnia model rats. Sixty SD rats were randomly divided into blank group， model group， Baihui+Shenmen group， Baihui+Sanyinjiao group， Baihui+non-acupoint group， with 12 rats in each group. Each treatment group received acupuncture in relevant acupoints， 30 min each time， for 7 d. ELISA was used to measure the levels of CRH， ACTH and CORT. Results Compared with the model group， the levels of CRH， ACTH and CORT of the acupuncture groups decreased to some extent. In the three acupuncture groups， the efficacy of Baihui+Shenmen group was better than that of Baihui+Sanyinjiao group and Baihui+non-non-acupoint group. Conclusion Acupuncture treatment may calm and soothe the nerves to release the insomnia through regulating HPA axis related hormones. Acupuncture acupoints at different meridians may be one of the factors that cause the difference of acupoints compatibility effect.

Key words： acupuncture； insomnia； HPA axis； acupoints at different meridians； acupoints compatibility； rats

失眠可導致人或動物思維紊亂，常伴有疲勞及不良的情緒變化等癥狀。自1969年國外學者提出5-羥色胺（5-HT）致眠學說后，有研究發現，下丘腦-垂體-腎上腺皮質（HPA）軸的興奮-抑制狀態是反應睡眠質量的重要指標，正常情況下，睡眠早期非快眼動

睡眠（NREM）占優勢，此時HPA軸分泌活動受抑制，而睡眠后期快動眼睡眠（REM）占優勢，HPA軸分泌活動則活躍[1]。氯苯基丙氨酸（PCPA）失眠模型大鼠在下丘腦5-HT含量降低的同時伴有HPA軸的功能紊亂，分布于下丘腦的室旁核和藍斑核的促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF），以及血漿促腎上腺皮質激素（ACTH）是直接反映HPA軸興奮-抑制狀態的相關激素[2]，CRF既可以調控藍斑核NE系統與背縫核5-HT系統活性，又作用于下丘腦的CRF受體，調控HPA軸的功能。因此，HPA軸功能紊亂與失眠癥關系密切[3-4]。有研究表明，針刺治療改善失眠患者睡眠癥狀的療效顯著[5]。臨床上針刺治療失眠癥的選穴方法多樣，正確的腧穴配伍是提高針刺療效的關鍵因素之一。不同的腧穴配伍方式對針刺治療失眠的療效有顯著的影響[6]。本研究通過觀察按經選穴對失眠大鼠HPA軸相關激素含量及腧穴配伍效應的影響，探討針刺治療失眠癥的療效機制，為臨床針灸治療該病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級SD雄性大鼠60只，8～9周齡，體質量220～250 g，湖南中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。正式實驗開始前，大鼠適應性分籠飼養1周，每籠5只。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心實驗室，溫度23～26 ℃，濕度45%～65%。飼養1周后將大鼠隨機分為空白組、模型組、百會+神門組、百會+三陰交組、百會+非經非穴組，每組12只。

1.2 主要試劑和儀器

PCPA，美國Sigma公司；戊巴比妥鈉，Merck公司；碳酸氫鈉片，成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉片，成都市科龍化工試劑廠生產；阿拉伯膠，天津市光復精細化工研究所。動物型超純水機，摩爾公司；PHSJ-3F型pH筆，上海精密科學儀器有限公司；pH精密試紙（pH值5.5～9.0），墊中墊公司；電熱水恒溫杯，Promega公司；臺式高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；自動平衡離心機，湘儀離心機儀器有限公司；全自動酶標洗板機，匯松科技發展有限公司；多功能酶標分析儀，匯松科技發展有限公司；恒溫培養箱，Promega公司；0.25 mm×25 mm華佗牌一次性使用無菌針灸針，蘇州醫療用品廠。

1.3 造模

實驗開始前，先將大鼠適應性喂養7 d，自由攝食飲水，保持墊料干燥，7 d后稱重。參照文獻[7]方法造模，除空白組外，其余各組于第8日腹腔注射PCPA混懸液，每日1次，連續2 d，制造失眠模型大鼠。空白組腹腔注射等體積弱堿性生理鹽水。成模標準：失眠大鼠出現晝夜節律缺失、日間與夜晚皆活動不斷、對外界刺激異常敏感、煩躁不安等相關癥狀。首次注射PCPA 36 h后，觀察模型組大鼠生理狀態，結合采用經典的戊巴比妥鈉翻正實驗，預實驗測得戊巴比妥鈉按體質量35 mg/kg為引起100%大鼠睡眠的最小閾劑量，以50 mg/mL濃度溶于生理鹽水后進行腹腔注射，提起大鼠尾巴，腹部朝上放在平臺上，記錄大鼠睡眠潛伏期和睡眠時間。以大鼠翻正反射消失為睡眠，以大鼠翻正反射恢復為覺醒，注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失之間為潛伏期，翻正反射消失到覺醒為睡眠持續時間。觀察空白組和與模型組大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的差異，進行失眠模型評價。

1.4 干預

造模完成后，于第2次注射PCPA的第1日后，開始對實驗大鼠進行干預。空白組大鼠常規飼養，不做任何處理。模型組大鼠予仰臥位束縛于鼠板上，只捆綁，不進行針刺，每日1次，每次30 min，連續7 d，每日捆綁結束后正常進食。各針刺組大鼠選穴參考《實驗針灸學》[8]穴位定位。百會+神門組選取“百會”、雙側“神門”，百會+三陰交組選取“百會”、雙側“三陰交”，百會+非經非穴組選取“百會”“非經非穴點”，非經非穴點參照成都中醫藥大學制定的選穴方法，此點在非經脈循行路線上及非穴位所在部位（位于肘內側，肘尖與腋窩連線中點）。將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，定穴后局部剪毛，絡合碘消毒，采用0.25 mm×25 mm針灸針進行針刺。針刺方法：百會從后向前平刺20 mm，神門直刺1 mm，三陰交直刺5 mm，非經非穴點直刺5 mm。留針30 min，每10 min行針1次，行針時間1 min，行平補平瀉手法，捻轉幅度和頻率均采用均等手法，30 min后行針結束后出針，每日1次。治療后正常進食，連續7 d。

1.5 行為學觀察

每日觀察大鼠精神狀態、動作靈敏性、反應敏捷性、晝夜節律、毛發光澤度、體質量變化以及活動度、飲食量、飲水量等與失眠癥相關的伴隨癥狀。

1.6 生化指標檢測

末次行為學檢測后禁食不禁水12 h，斷頭處死大鼠，取材。取3 mL血液，室溫自然凝固10～20 min，2000～3000 r/min離心20 min，收集上清液，置于-20 ℃冰箱備用；取下丘腦，稱重，加一定量的pH 7.4 PBS，置于-80 ℃冰箱保存備用。標本融化后仍保持2～8 ℃的溫度，再加一定量的PBS，將標本勻漿充分，2000～3000 r/min離心20 min，收集上清液，分裝后1份待檢測，其余冷凍備用。ELISA分別檢測血清ACTH、皮質酮（CORT）及下丘腦CRH含量，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。通過試劑盒提供的標準品進行梯度稀釋，獲得不同介質的標準曲線。在微量滴定板上加樣，空白孔不加，標準品孔加標準品50 μL，加酶50 μL，待測樣品孔加樣品40 μL，然后各加二抗和酶標試劑，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37 ℃溫育60 min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。小心接掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。每孔加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL終止反應。以空白調零，450 nm波長處依序測量各孔吸光度（OD）。根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值通過回歸方程計算出對應的樣品濃度。

1.7 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠死亡情況

實驗過程中共有7只大鼠死亡，其中模型組4只，百會+三陰交組1只，百會+非經非穴組2只。

2.2 戊巴比妥鈉睡眠實驗結果

空白組造模前后睡眠潛伏期和睡眠時間差異均無統計學意義（P>0.05）；與造模前比較，造模后睡眠潛伏期顯著延長（P<0.05），睡眠時間顯著減少（P<0.05），提示造模成功。見圖1、圖2。

注；與空白組比較，#P<0.05

2.3 一般狀況

與空白組比較，模型組大鼠出現晝夜節律消失，日間活動不停，對外界的聲，光等刺激異常敏感，煩躁不安，興奮性增高，攻擊性增強，毛硬粗糙，毛豎起無光澤，大便色澤灰白，持續觀察1周，期間體質量增加緩慢、飲食量明顯減少、飲水量明顯增多，以上失眠癥伴隨癥狀提示造模成功。

2.4 按經選穴針刺對失眠大鼠下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠下丘腦CRH含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，百會+神門組、百會+三陰交組大鼠下丘腦CRH含量明顯降低（P<0.01），百會+非經非穴組大鼠下丘腦CRH含量變化不明顯；與百會+神門組比較，百會+三陰交組大鼠下丘腦CRH含量變化不明顯；與百會+三陰交組比較，百會+非經非穴組大鼠下丘腦CRH含量升高（P<0.05）。見圖3。

注：與空白組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，▽▽P<0.01；

與百會+三陰交組比較，■P<0.05

2.5 按經選穴針刺對失眠大鼠血清促腎上腺皮質激素含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清ACTH含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各針刺組大鼠血清ACTH含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與百會+神門組比較，百會+三陰交組、百會+非經非穴組大鼠血清ACTH含量明顯升高（P<0.01）；與百會+三陰交組比較，百會+非經非穴組大鼠血清ACTH含量變化不明顯。結果見圖4。

2.6 按經選穴針刺對失眠大鼠血清皮質酮含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清CORT含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各針刺組大鼠血清CORT含量顯著降低（P<0.01）；與百會+神門組比較，百會+三陰交組、百會+非經非穴組大鼠血清CORT含量明顯升高（P<0.05）；與百會+三陰交組比較，百會+非經非穴組大鼠血清CORT含量明顯升高（P<0.01）。結果見圖5。

注：與空白組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，▽P<0.05，

▽▽P<0.01；與百會+神門組比較，◇◇P<0.01

與百會+神門組比較，◇P<0.05；與百會+三陰交組比較，■■P<0.01

3 討論

迄今為止，睡眠發生的確切機制尚未完全闡明。目前針灸治療失眠癥療效顯著，在臨床上運用越來越廣泛，備受研究者關注。百會，系督脈與手足三陽經之會穴，具有溫養諸臟、安神健腦、鎮驚熄風等作用。早在明代醫著《針灸大成》就有“思慮勞傷心脾，灸百會”記載，可見百會對失眠癥作用之大。某一臟腑或經脈發生病變時，遵循“不盛不虛，以經取之”的取穴原則，稱為本經取穴。心主血脈，又主神明，為君主之官，是五臟六腑之大主，精神之所舍。心藏神，神在人體的生命活動中占有重要地位，睡眠作為人體重要的生理功能，也是由心神所主。神門為手少陰經之原穴，具有鎮心安神之效，心神得安，則能入眠。三陰交為足太陰脾經腧穴，也是足三陰經交會穴，可通過調三陰經經氣，使肝、脾、腎功能正常，從而使陰可斂陽，陰陽調和，則人可安然入睡。通過對歷代古籍的研究發現，古代治療失眠的針灸處方有156個，其中神門和三陰交是針灸治療失眠最常用的主穴及配穴，且臨床療效顯著[9]。故本實驗將百會作為固定按部選穴，治療各組再配以不同經脈選穴，分別為心經之神門和脾經之三陰交。神門為失眠癥之本經穴，除本經外的其他正經統稱為他經，本實驗之三陰交則為他經穴。為說明經穴是否具有特異性，故另設一組“百會+非經非穴”作為對照組，使實驗設計更為合理。

HPA軸功能紊亂是導致應激障礙發生的主要因素之一，是反映機體應激狀態的中樞神經系統。下丘腦室旁核神經元分泌出CRH，CRH刺激神經垂體分泌ACTH，ACTH通過體循環到達腎上腺，促進腎上腺皮質釋放CORT。以上3種激素在HPA軸上相互關聯、相互影響，在HPA軸上CRH為上游調控激素，其合成和分泌能明顯影響下游激素的合成和分泌。早在1967年，有學者發現失眠癥患者較正常者CRH的分泌增多[10]。繼而又有研究者發現，CRH水平與覺醒程度密切相關，外源性CRH可增加淺睡眠及覺醒，加快腦電波頻率并減少慢波睡眠[11]。故CRH已成為增加睡眠腦電圖頻率從而促進覺醒公認的因素。單胺類神經遞質ACTH具有提高大腦皮質應激性的作用，是睡眠覺醒調控機制中的重要環節[12]。CORT被稱為“壓力性激素”“應激性激素”，是目前公認的應激反應的經典指標，CORT水平升高影響機體物質吸收及新陳代謝，進而出現多夢易醒、心悸健忘、神疲食少、肢體倦怠、面色少華等失眠癥狀[13]。

PCPA造成的失眠模型是目前公認并廣泛用于研究失眠與相關神經遞質、激素及5-HT之間關系的經典動物模型。本實驗采用PCPA混懸液造模方法并結合戊巴比妥鈉睡眠實驗對模型大鼠進行評價，結果提示造模成功。各針刺組大鼠經針刺后，下丘腦CRH含量及血清ACTH、CORT含量均有一定程度的降低，顯示出一定改善睡眠的療效，起到安神鎮靜的功能，表明針刺不同腧穴治療失眠癥的療效確切，這與相關研究結果一致[14-15]，針刺改善睡眠的機制可通是過降低HPA軸相關激素水平實現的[16-17]。各針刺組間比較，針刺“神門”“三陰交”降低失眠大鼠下丘腦CRH水平的療效相當，且二者作用均優于“非經非穴”，而針刺“神門”降低血清ACTH、CORT含量的作用優于三陰交及非經非穴，表明針刺“神門”治療失眠癥效果最優，針刺“三陰交”療效次之。

綜上所述，不同腧穴配伍方式，療效也不相同，本實驗通過固定取穴“百會”，再分別配以不同經脈腧穴（心經、脾經）及非經非穴，設計3個治療組，對比本經穴、他經穴、非經非穴的療效差異，按經選穴分組明顯。根據本實驗結果，神門可作為臨床治療失眠的必要穴位，三陰交可作為符合辨證的首選穴位。同時本實驗結果表明，HPA軸相關激素水平可能是影響睡眠的機制之一，按經選穴針刺是腧穴配伍效應的影響因素之一。

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