Ag納米立方共振傳感器的熱組裝及應用

盧偉偉，黃青玲，張　軍

(河南科技大學 化工與制藥學院，河南 洛陽 471023)

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Ag納米立方共振傳感器的熱組裝及應用

盧偉偉，黃青玲，張軍

(河南科技大學 化工與制藥學院，河南 洛陽 471023)

采用熱驅動組裝的方法，制備了限域表面等離子體共振傳感膜。首先，以聚乙烯吡咯烷酮為結構導向劑和穩定劑制備了Ag納米立方。然后，利用兩親性分子2-二乙胺基乙硫醇的親疏水性隨溫度變化的性質，通過溫度調控實現了Ag納米立方在玻璃基體上的二維組裝。以Ag納米立方表面的聚乙烯吡咯烷酮為偶聯劑，采用經典Stober法在二維組裝膜表面包覆了SiO2，從而提高了傳感膜的穩定性以及后續功能化的可行性。最后，將Ni2+/次氮基三乙酸體系引入表面等離子體共振傳感器表面，實現了生物素的固載和溶液中鏈霉親和素的高靈敏度傳感檢測。

Ag納米立方；自組裝；表面等離子體共振；傳感

0　引言

近年來，由于限域表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)傳感器具有高選擇性、高靈敏度和低檢測限，并可以在普通的紫外-可見分光光度計上進行檢測等特點，可以發展成為低成本、便攜式的實時監測設備[1]，從而得到了廣泛的關注并進行了深入的研究。

要制備LSPR傳感器，首先要解決的問題是如何將金屬納米粒子組裝或固定到透明基體上，形成穩定的二維膜。目前，二維膜的制備方法分為物理方法和化學方法兩大類。物理方法通常采用不同的刻蝕技術，如電子束刻蝕技術[2]、聚焦離子束刻蝕技術[3]和激光干涉光刻技術[4]等，但這些技術所需設備復雜，制備過程繁瑣，且可以形成的二維膜面積非常有限，導致物理方法效率低并且成本過高。近年來，化學組裝方法如Langmuir-Blodgett技術[5]、分子調控組裝技術[6]和界面自組裝技術[7]等逐漸發展起來。雖然化學方法相比于物理方法，其對二維組裝膜上納米粒子的尺寸、形貌、晶型、粒子間距和膜面積的大小等方面的控制要好，但同樣存在所需設備復雜(如Langmuir-Blodgett技術)、表面改性繁瑣(如分子調控組裝技術)和難以調控粒子間距(如界面自組裝技術)等問題，很難成為一種普遍有效的組裝方法。因此，發展LSPR組裝技術仍然是一項具有挑戰性的工作。

由于生物素與親和素間存在強親和作用，且兩者的結合穩定性好、專一性強，不受試劑濃度、pH值以及蛋白變性試劑等影響。生物素與親和素既可以偶聯抗體等大分子生物活性物質，又可被酶等多種材料所標記，因此，可以構建一個多層次信號放大系統，用于微量抗原、抗體和受體的定量檢測、定性檢測及定位觀察研究，也可制成親和介質用于上述反應體系中反應物的分離和純化。因此，找到一種簡便方法研究生物素與親和素間的相互識別和檢測變得非常重要。

本文提出了一種簡單的熱組裝方法，利用兩親性分子2-二乙胺基乙硫醇(2-diethylaminoethanethiol，DEAET)的親疏水性隨溫度變化的性質，通過改變溫度實現了Ag納米立方在玻璃基體上的二維組裝，并通過掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)、透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)、紫外-可見(ultraviolet-visible,UV-vis)分光光度等方法對納米粒子和二維膜的結構進行了表征。最后，以生物素與鏈霉親和素為傳感體系，研究了所制備的LSPR傳感器在生物檢測識別中的應用。

1　試驗

1.1Ag納米立方的制備及其熱驅動組裝

Ag納米立方的制備采用多元醇方法[8]。具體的熱驅動組裝試驗過程如下：將10 mL Ag納米立方水溶液放入帶旋塞的玻璃樣品瓶(φ20 mm×70 mm)中，加入4 mL的甲苯，形成甲苯-水兩相體系；加入一定量的DEAET，充分攪拌。將羥基化處理過的玻璃片置于此反應容器中，通過循環水浴調節反應溫度至60 ℃，1 h后取出玻璃片，用二甲苯和乙醇多次沖洗，再用氮氣吹干，備用。此組裝膜樣品標記為Ag/Glass。

1.2LSPR傳感界面的形成

為了提高Ag納米立方組裝膜的穩定性，采用經典的Stober法[9]對Ag/Glass進行硅化包覆。具體步驟如下：將制備的Ag/Glass樣品置于15 mL含有5 mL氨水(體積分數為4.2%)和20 μL 正硅酸乙酯的乙醇混合溶液中，25 ℃攪拌反應8 h后取出，并用大量乙醇沖洗，氮氣吹干，備用。SiO2包覆后的樣品標記為SiO2/Ag/Glass。

引入螯合劑次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid，NTA)，具體步驟如下：首先，將SiO2/Ag/ Glass置于15 mL、體積分數為3%的3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-glycidyloxypropyl trimethoxysilane，GPTES)的乙醇溶液中，反應8 h。然后，將樣品置于含有0.01 mol/L的Nα,Nα-二羧甲基-L-賴氨酸(Nα,Nα-bis(carboxymethyl)-L-lysine)的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH=8.0)中，反應4 h后，用大量的高純水沖洗，并用氮氣吹干。最后，將樣品置于濃度為100 mmol/L的NiCl2溶液中，反應 2 h 后，用高純水淋洗除去未反應的Ni2+離子。引入NTA和Ni2+后的樣品標記為Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass。

將所制備的Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass樣品置于his6標記的生物素濃度為500 μg/mL的PBS緩沖溶液(pH=7.4)，2 h后，用PBS緩沖溶液淋洗，4 ℃保存于PBS緩沖液中備用。his6標記生物素的樣品標記為his6-biotin/Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass。

1.3傳感檢測

為了測定SiO2/Ag/Glass的折射率靈敏度，所用的純試劑及其相應折射率n分別為：n水= 1.333，n丁醇=1.397，n乙二醇=1.432，n二甲基亞砜=1.478。

以生物素和鏈霉親和素相互作用為模型，表征所制備的LSPR傳感器的性能。將his6-biotin/Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass分別置于一定濃度(0.01～1 000 nmol/L)的鏈霉親和素待分析溶液中2 h，并用PBS緩沖液沖洗以除去未被鍵合的鏈霉親和素，接著用氮氣將樣品干燥，最后將樣品放置于UV-vis樣品臺上測定其LSPR光譜。

2　結果與討論

2.1Ag納米立方的制備及組裝膜的結構表征

采用多元醇方法所制備的Ag納米立方的SEM和TEM表征結果如圖1所示。由圖1可以看出:所制備的Ag納米粒子具有立方形貌，且其邊長為45 nm左右。本文利用DEAET的親水性和疏水性隨溫度變化性質，采用熱驅動組裝方法成功地將所制備的Ag納米立方粒子組裝到了透明玻璃基體上以構建LSPR傳感膜。

為了考察DEAET在二維Ag納米立方膜組裝過程中的重要作用，在其他條件不變的情況下，本文選用同樣含有巰基(-SH)官能團的巰基乙酸、氨基乙硫醇和苯硫酚代替DEAET做了Ag納米立方粒子的組裝試驗。試驗結果表明：在相同的試驗條件下，這些分子的加入不能驅動Ag納米立方組裝膜的形成。這些對照試驗說明在形成二維Ag納米立方膜的過程中，DEAET分子的獨特結構起著重要作用。為了更進一步考察DEAET的作用，對在不同量的DEAET作用下形成的薄膜進行了UV-vis表征，結果如圖2所示。從圖2中可以看出：隨著DEAET量的增加，位于400～500 nm的LSPR吸收峰的吸光度逐漸增大。因為納米粒子LSPR吸收峰的吸光度和Ag納米立方的數密度緊密相關，因此，LSPR吸收峰吸光度的增大說明隨著DEAET量的增多，更多的Ag納米立方被擔載到玻璃基體上。

圖2　不同DEAET加入量所制備的二維Ag納米立方膜的UV-vis光譜

為了進一步證實DEAET的加入量對組裝膜結構的影響，本文使用硝酸將玻璃基體上的Ag納米粒子溶解后，采用電感耦合等離子體發射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES)測定不同基體上Ag的擔載量，然后計算出其相應的總擔載量、質量密度、數密度和平均擔載層數，結果見表1。需要說明的是，計算出的Ag納米立方的擔載層數并非為整數，這說明Ag納米立方在玻璃片上有一定的不均勻分布和團聚現象。對比圖2和表1的試驗數據可知：吸光度的大小和擔載層數有著直接的對應關系，即擔載層數越大，其吸光度也越大。這也進一步證實了DEAET的加入量對薄膜的形成及其結構具有重要的影響。

表1　DEAET所制備樣品表面Ag納米立方的總擔載量、質量密度、數密度和平均擔載層數

這種熱驅動組裝現象可以從DEAET的兩親分子結構上來進行解釋。DEAET分子式為(CH3CH2)2NCH2CH2SH，此分子不僅含有疏水性的乙基，而且含有親水性的胺基，更為重要的是該物質的親水性和疏水性可由溫度控制[10]。當溫度升高時，其親水性增強而與極性溶劑(如水)的互溶度增大；當溫度降低時，其疏水性增強而與非極性溶劑(如甲苯)的互溶度增大。當加入DEAET后，由于DEAET分子中巰基(-SH)與金屬原子之間強的相互作用，從而取代了部分納米粒子表面起結構導向劑和穩定劑作用的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)分子。當反應系統溫度升高時，在DEAET親水性增強的作用下，將驅使Ag納米粒子從甲苯-水界面處向水相中轉移；當Ag納米粒子在水相中遇到羥基化玻璃基體時，納米粒子表面的PVP分子由于和玻璃表面羥基(-OH)之間較強的氫鍵作用，而驅使納米粒子擔載于玻璃片上。圖3為不同DEAET加入量下，所制備的二維Ag納米立方膜的SEM照片。由圖3可看出：在本試驗的條件下，當DEAET加入量為3 μL時形成的二維Ag納米立方膜的分布最均勻(如圖3c所示)，因此，本試驗采用DEAET加入量為3 μL時形成的二維Ag納米立方膜作為傳感基體。

圖3　不同DEAET加入量所制備的二維Ag納米立方膜的SEM照片

2.2二維傳感膜靈敏度的測定

為了提高Ag納米立方組裝膜的穩定性，本文采用經典的Stober法對Ag/Glass進行硅化包覆。包覆SiO2并不需要加入額外的偶聯劑，這主要是因為本文所制備的Ag/Glass二維膜上Ag納米粒子表面存在PVP，而PVP本身就是被廣泛使用的偶聯劑。SiO2的包覆主要有兩個方面的作用：一方面，可以隔離二維膜中Ag納米粒子和待檢測溶液的直接接觸，從而避免它們之間由于相互作用而導致傳感膜的結構和形貌發生變化；另一方面，由于成熟的硅表面處理技術的存在，SiO2的包覆為在二維膜表面進一步固載功能性物質提供了便利。

為了評價樣品的傳感性能，測定SiO2/Ag/Glass樣品的吸光度隨外界溶劑折射率的變化，結果如圖4所示。從圖4中可以看出：LSPR吸收峰隨著外界溶劑折射率的增大而發生紅移，同時LSPR吸收峰的吸光度也隨之增大。將圖4中波長和吸光度數據列于圖5中，可以分別得到波長和吸光度隨折射率的變化規律。

圖4　SiO2/Ag/Glass樣品在不同溶劑中的吸光度

圖5　SiO2/Ag/Glass樣品波長和吸光度隨折射率的變化規律

經直線擬合后，可以計算出Ag納米立方構建的二維SiO2/Ag/Glass樣品的折射率靈敏度：當以波長表示時，為103 nm/RIU(其中，RIU為單位折射率)；而當以吸光度表示時，為0.834/RIU。從圖5中可以看出：這兩種靈敏度表現形式誤差范圍差別不大，但以波長表示的折射率靈敏度要遠遠大于以吸光度表示的折射率靈敏度，因此，本文在后面的傳感研究中選取LSPR吸收峰波長的變化作為傳感信號。

圖6　LSPR傳感器的UV-vis峰波長的鏈霉親和素濃度響應曲線

2.3LSPR傳感器在生物檢測識別中的應用

Ni2+/NTA體系和組氨酸標簽(histidine-tag，簡稱his-tag)之間的相互作用，已經被廣泛地應用在固定蛋白質等生物分子的研究中，本文利用這種方法將his6標記的生物素嫁接到Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass表面，進而利用生物素和鏈霉親和素之間的強相互作用，實現溶液中鏈霉親和素的檢測。檢測過程中，由于生物素和鏈霉親和素的結合，造成二維傳感膜表面處介電常數的變化，這將造成傳感膜LSPR吸光峰的波長隨之發生變化。所制備的二維納米立方Ag傳感器在不同鏈霉親和素濃度下的UV-vis峰波長的變化如圖6所示。檢測限定義為當吸光度變化等于儀器噪聲的3倍時所對應的檢測物的濃度[11]。從圖6中可以求出此傳感膜對鏈霉親和素的檢測限為5.6 nmol/L。雖然和文獻[11]中報道的同類相互作用的檢測中的最低檢測限(10-3nmol/L)相比較，本文所制備的二維傳感膜的檢測限明顯偏高，但和其他檢測器相比，其優勢在于相對簡單的傳感膜組裝制備方法和高穩定性。

3　結論

本文利用熱驅動法實現在玻璃基體上Ag納米立方結構的二維可控構筑，并且以納米粒子自身的結構導向劑和穩定劑PVP作為偶聯劑，利用簡單易行的經典Stober法實現了組裝膜的SiO2包覆。最后，通過Ni2+/ NTA體系將生物素固載到傳感器表面，實現了對鏈霉親和素的檢測，其檢測限達到5.6 nmol/L。由于PVP作為結構導向劑廣泛應用于各種金屬納米材料的制備中，因此，本文提出的熱組裝方法可拓展到這些納米材料二維膜的構建中。

[1]GUO L,JACKMAN J A,YANG H H,et al.Strategies for enhancing the sensitivity of plasmonic nanosensors[J].Nano today,2015,10(2):213-239.

[2]CHEN S,SVEDENDAHL M,ANTOSIEWICZ T J,et al.Plasmon-enhanced enzyme-linked immunosorbent assay on large arrays of individual particles made by electron beam lithography[J].ACS nano,2013,7(10):8824-8832.

[3]NAIK J P,DAS K,PREWETT P D,et al.Liquid-like instabilities in gold nanowires fabricated by focused ion beam lithography[J].Applied physics letters,2012,101(16):3108-3113.

[4]LIU C,ZHANG C,WANG H,et al.An equivalent method of multi-beam laser interference lithography for 2D plasmonic crystals fabrication[J].Journal of optics,2015,17(8):5001-5005.

[5]MAHMOUD M A.Controlling the orientations of gold nanorods inside highly packed 2D arrays[J].Physical chemistry chemical physics,2014,16(47):26153-26162.

[6]LIM S I,ZHONG C J.Molecularly mediated processing and assembly of nanoparticles:exploring the interparticle interactions and structures[J].Accounts of chemical research,2009,42(6):798-808.

[7]WU H,HE H,ZHAI Y,et al.A facile and general preparation of high-performance noble-metal-based free-standing nanomembranes by a reagentless interfacial self-assembly strategy[J].Nanoscale,2012,4(22):6974-6980.

[8]SKRABALAK S E,AU L,LI X,et al.Facile synthesis of Ag nanocubes and Au nanocages[J].Nature protocols,2007,2(9):2182-2190.[9]STOBER W,FINK A,BOHN E.Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range[J].Journal of colloid and interface science,1968,26(1):62-69.

[10]QIN B,ZHAO Z,SONG R,et al.A temperature-driven reversible phase transfer of 2-(diethylamino)ethanethiol-stabilized CdTe nanoparticles[J].Angewandte chemie international edition,2008,47(51):9875-9878.

[11]HAES A J,VAN D P.A nanoscale optical blosensor:sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles[J].Journal of the American chemical society,2002,124(35):10596-10604.

國家自然科學基金項目(21303040,21576073);河南科技大學青年學術帶頭人基金項目(13490001);洛陽市礦產資源化工重點實驗室建設基金項目(1003016A)

盧偉偉(1980-),男,河南洛陽人,副教授,博士,主要從事功能納米材料等方面的研究.

2015-11-30

1672-6871(2017)01-0093-05

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.01.019

TB34

A