黃腫樹JcFATA基因原核表達載體構建及表達體系優化

劉穎++劉國選++黃川騰++楊亞利++唐家年++周開源++林詩婉++高美芳++吳東霖++陳建平

摘要 植物脂酰-酰基載體蛋白硫酯酶A（fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，FATA）是脂肪酸積累過程中的關鍵酶，直接調控脂肪酸的含量與組成。目前有關黃腫樹脂酰-ACP硫酯酶A基因（JcFATA）（GenBank登陸號：EU267122.2）的功能研究還未見報道。對JcFATA基因進行原核表達是研究JcFATA基因功能的一種重要手段，而開展這項研究的前提是構建原核表達載體。因此，本研究以黃腫樹cDNA為模板克隆出JcFATA基因原核表達片段，將其連接到帶有His標簽的原核表達載體pCold I上，將所構建的重組載體pCold I-JcFATA轉入大腸桿菌Rosseta。為了表達更多的可溶性His-JcFATA融合蛋白，本文還探討了不同IPTG濃度（0.1、0.5、1.0 mmol/L）、不同誘導溫度（15、25、37 ℃）和不同誘導時間（0、15、30 h）對蛋白表達的影響，誘導產物經超聲波裂解破碎后，利用SDS-PAGE比較分析融合蛋白表達量，從而確定最佳的表達體系。結果表明，當添加誘導劑IPTG的濃度為0.5 mmol/L，誘導時間為15 h，培養溫度為25 ℃時，可以獲得較多的可溶性融合蛋白（His-JcFATA）。此外，進行蛋白純化時發現，在鎳柱上進行第5次洗脫時所獲得純化蛋白質量最佳。本研究的結果可為進一步研究JcFATA基因的功能奠定基礎。

關鍵詞 黃腫樹；JcFATA基因；原核表達；蛋白純化

中圖分類號 S72；Q75；Q78 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）19-0136-04

Abstract The fatty acyl carrier protien thioesterase（FATA） is a key enzyme in the accumulation of fatty acids，which directly regulates the content and composition of fatty acids.The function of the acyl-ACP thioesterase A gene（GenBank accession number：EU267122.2） in Jatropha curcas has not been reported before.An important method to analyze the function of JcFATA gene is the prokaryotic expression，and the prerequisite of which is to construct prokaryotic expression vector.The JcFATA gene was cloned from J.curcas cDNA and inserted into the prokaryotic expression vector pCold I with His-tag.The recombinant vector pCold I-JcFATA was transformed into Escherichia coli Rosseta.In order to express more soluble fusion proteins His-JcFATA，different IPTG concentrations（0.1，0.5 and 1.0 mmol/L），different induction temperatures（15，25 and 37 ℃） and different induction times（0，15 and 30 h） were investigated on the protein expression.After the cells were disrupted by ultrasound，the expression of the fusion protein was analyzed by 12% SDS-PAGE to determine the optimal expression condition.The results showed that the soluble fusion protein（His-JcFATA） could be obtained better when the concentration of the inducer IPTG was 0.5 mmol/L，the induction time was 15 h，and the culture temperature was 25 ℃.In addition，the study also showed that the fifth elution for protein purification on the nickel column might obtain the best quality of purified protein.The results of this study can lay a foundation for the further analyzing functions of JcFATA gene.

Key words Jatropha curcas；JcFATA gene；prokaryotic expression；protein purification

黃腫樹（Jatropha curcas）是大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生木本植物，也是世界公認的一種非常具有開發潛能的能源植物，其種子油被認為是生產“生物柴油”的優良原料[1-2]。目前，雖然黃腫樹的種植面積還在不斷擴大，同時基礎研究也在逐漸深入，但還存在一些限制其產業化發展的問題，如種子油的總產量過低和油脂的質量不佳等[3-5]。Qu等[1]的研究結果表明，黃腫樹中脂肪酸的含量和組成比例，可能會直接影響黃腫樹種子油的質量和總含油量。而植物種子油的生成和脂肪酸的積累都是由相關功能基因來調控，如甘油-3-磷酸酰基轉移酶（glycerol phosphate acyltransferase，GPAT）、ω-3脂肪酸去飽和酶（ω-3 fatty acid desaturase，FAD）、磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）等，這些基因都參與油脂的合成，并在脂肪酸合成代謝中起重要的調節作用[6-8]。因此，為了培育高產優質黃腫樹新品種，有必要對其脂肪酸積累相關功能基因進行研究。

植物脂酰-酰基載體蛋白硫酯酶A（Fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，FATA）是一類由細胞核基因編碼的，主要是以二聚體的形式存在質體球蛋白，其主要功能可能是在脂肪酸合成代謝過程中催化酰基-ACP水解，對游離脂肪酸的釋放起重要調控作用，直接影響脂肪酸的含量與組成[9-10]。目前，有關黃腫樹JcFATA基因的功能研究還未見報道。對JcFATA基因進行原核表達是研究JcFATA基因功能的一種重要手段，為進一步分析黃腫樹 JcFATA蛋白結構和功能的關系提供了試驗基礎，而開展這些研究的前提是構建原核表達載體并獲取純化的目的蛋白。因此，本研究擬從黃腫樹中克隆JcFATA蛋白的編碼基因，并構建JcFATA基因的原核表達載體，將其導入大腸桿菌中進行表達；為能誘導表達出較大量的可溶性蛋白，還將對表達和純化體系進行優化，為進一步開展該基因的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與載體

大腸桿菌菌株（Escherichia coli）DH5α和Rosseta以及農桿菌菌株（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由廣東海洋大學農學院植物生物技術與分子生物學實驗室保存。原核表達載體pCold Ⅰ載體（His標簽），由華南農業大學生命科學學院實驗室惠贈。

1.2 主要試劑

RNA抽提試劑盒購自Solar公司（美國），進行目的片段PCR擴增的高保真酶KOD-plus試劑盒購自TOYOBO公司（日本），總DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自TIANGEN公司（北京），普通Taq酶、各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒和Mighty Amp DNA polymarase試劑盒為TaKaRa公司產品（日本），PCR引物由廣州捷瑞公司合成（廣州），低分子量蛋白質Marker（14.4～97.4 kD）購自貝斯特公司（中國），其余常規試劑均為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA的合成。黃腫樹總RNA提取采用Solar公司的RNA抽提試劑盒進行，具體操作步驟依據試劑盒說明書進行。從黃腫樹幼嫩的葉片中提取總RNA，根據TaKaRa反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄為cDNA。

1.3.2 黃腫樹JcFATA基因的克隆及回收。根據美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）所提供的黃腫樹JcFATA基因序列（NCBI Genbank登陸號為EU267122.2，1 110 bp），用Primer 5.0軟件設計特異引物，上游引物序列為F1：5′-AAAAGGATCCATGATGTTGAA GGTACCGTG-3′（劃線處為BamH I酶切位點），下游引物序列為F2：5′-AAAACTGCAGTCATCTGGAGGGCTTCTTTC-3′（劃線處為PstI酶切位點）。以黃腫樹cDNA為模板，采用引物F1和F2進行PCR擴增。25 μL PCR擴增體系：2.5 μL 10×KOD Buffer、1 μL MgSO4（25 mmol/L）、2.5 μL dNTP（2 mmol/L）、引物F1/F2（10 μmol/L）各0.5 μL、0.5 μL KOD-plus酶（5 U/μL）、0.5 μL黃腫樹cDNA和17 μL無菌去離子水。PCR反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1∶20 min，35個循環；最后68 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min。采用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，-20 ℃保存回收產物。

1.3.3 JcFATA基因原核表達載體的構建。對pCold Ⅰ質粒和JcFATA基因分別用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ進行雙酶切，回收雙酶切后的質粒和目的片段，用T4 DNA連接酶連接。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，涂板培養后進行搖菌、雙酶切鑒定（BamH Ⅰ和Pst Ⅰ）和菌液PCR鑒定。進行菌液PCR鑒定時以pCold Ⅰ質粒為陽性對照，水為陰性對照。PCR檢測反應體系：采用15 μL反應體系，其中7.5 μL 2×Mighty Amp Buffer Ver.2、引物F1/F2（10 μmol/L）各0.2 μL、一點菌液為檢測對象、0.2 μL Mighty Amp DNApolymarase和6.9 μL無菌去離子水。PCR檢測反應程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1：20 min，30個循環；最后68 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。將雙酶切和菌液PCR檢測均為陽性的克隆命名為pCold Ⅰ-JcFATA，最后對重組質粒進行測序，將測序正確的重組質粒轉入大腸桿菌菌株Rosseta感受態細胞中，形成表達菌株pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta。

1.3.4 JcFATA基因原核表達。進行JcFATA基因原核表達主要參考Cheng等[11]報道的方法。將上述測序正確的重組質粒（pCold Ⅰ-JcFATA）轉化大腸桿菌菌株Rosseta，在陽性克隆中挑取單菌落至3 mL含100 mg/L氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的Lysogeny Broth（LB）液體培養基[12]中，恒溫搖床上（37 ℃，200 r/min）振蕩培養過夜；將200 μL過夜菌接種至20 mL含100 mg/L Amp的LB液體培養基中，恒溫搖床上（37 ℃，200 r/min）振蕩培至OD600=0.4～0.6，用含100 mg/L Amp的LB液體培養基調節菌液OD600=0.4，將菌液在冰上放置10～15 min，再分別對異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）濃度、誘導溫度及誘導時間3種條件進行探討，IPTG終濃度分別設定為0、0.1、0.5、1.0 mmol/L，誘導溫度設定為15、25、37 ℃，誘導時間分別為0、15、30 h，最后取樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳（具體方法見1.3.5），通過分析蛋白表達量確定最佳表達體系。

1.3.5 SDS-PAGE檢測JcFATA蛋白的表達情況。利用SDS-PAGE檢測JcFATA蛋白的表達情況主要參照Bi等[13]報道的方法。先將10% SDS-PAGE分離膠緩慢倒入膠板中，直至距離梳子約0.5 cm，凝膠約3 h后再將4% SDS-PAGE積層膠緩慢倒入膠板中，插入梳子，凝膠約1 h，即制成目的蛋白電泳檢測所需的SDS-PAGE。將菌液轉移到1.5 mL離心管，12 000 r/min離心2 min收集菌體，向其加入0.5 mL Lysis Buffer懸浮細胞，冰水浴中采用240 W超聲波破碎3次，每次5 min，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE電泳。電泳完成后將凝膠取出，用雙蒸水沖洗2～3次，然后在考馬斯亮藍R-250染色液中振蕩染色2～3 h，用脫色液脫色2～3次，檢測目的蛋白的表達情況。

1.3.6 可溶性蛋白的純化。進行可溶性蛋白的純化主要參照Zhu等[14]報道的方法。分別接種表達菌株和空白對照菌株于5 mL含100 mg/L Amp的LB液體培養基（種子液）中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養過夜，再將其接種至添加了0.5 mmol/L IPTG的100 mL上述液體培養基中，在培養溫度為25 ℃的條件下，振蕩培養15 h進行蛋白誘導，8 000 r/min離心5 min收集菌體，置于-20 ℃冷凍過夜，加入5 mL Lysis Buffer懸浮細胞，240 W超聲波冰水浴破碎3次，每次5 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液備用；取帶有6×His標簽的鎳（Ni）純化柱（康為世紀，北京）（30%乙醇保存），將其活化后置于4 ℃ 冰箱中進行預冷處理，向其加入上述上清液，4 ℃ 條件下緩慢搖動1 h，收集排出液F，再向Ni柱分2次分別加4 mL Wash Buffer，依次收集排出液W1和W2；再向Ni柱分7次分別加0.5 mL Elution Buffer，依次收集洗脫液E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7。將上述收集液進行SDS-PAGE電泳分析，將經過電泳檢測的純化目的蛋白置于15 mL超濾離心管（截留分子量為30 KD），4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，最后向濃縮后的目的蛋白中加入等體積30%甘油，混勻后，置于 -70 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 JcFATA基因原核表達片段擴增

以黃腫樹cDNA為模板，設計特異性的引物F1和F2進行PCR擴增，獲得了JcFATA基因原核表達片段，經過凝膠電泳檢測后發現擴增片段大小與預期符合（1 110 bp）（圖1）。

2.2 JcFATA基因原核表達載體構建和轉化

用BamHⅠ和PstⅠ將pCold Ⅰ質粒和JcFATA基因原核表達片段進行雙酶切，接著將酶切后的目的片段和載體進行連接，然后轉化大腸桿菌，經過平板篩選后，對陽性克隆進行培養并提取質粒，最后進行酶切檢測（BamHⅠ和PstⅠ）（圖2）和菌液PCR檢測（圖3），結果均顯示片段大小與預期符合（1 110 bp）。將陽性克隆進一步測序檢測，結果顯示pCold Ⅰ-JcFATA載體已經構建成功。將測序完全準確地克隆轉入大腸桿菌Rosseta感受態細胞，產生重組菌株pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta。

2.3 JcFATA基因原核表達體系優化體系優化

2.3.1 誘導時間和IPTG濃度對融合蛋白His-JcFATA誘導的影響。由于在預試驗中重組pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta菌液在通常的表達體系中難以大量表達出可溶性蛋白，不利于后續蛋白分離和純化，因而有必要對其原核表達體系進行優化。本研究在誘導溫度都為25 ℃的條件下，分別對誘導時間和IPTG濃度進行了探討，優化His-Tag融合蛋白His-JcFATA誘導表達體系。不同誘導體系的超聲破碎產物上清液經SDS-PAGE電泳分析，從而確定最佳條件，試驗結果如圖4所示。

由圖4可知，3種對照組CK0（未添加IPTG的pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta菌液）、CK1（添加0.5 mmol/L IPTG的pCold I-Rosseta菌液）和CK2（pCold Ⅰ-Rosseta菌液），經過誘導都不能表達目的蛋白，說明IPTG是誘導目的蛋白His-JcFATA表達所必需的，同時不含目的基因JcFATA的菌液即使添加IPTG也不能產生目的蛋白。

由圖4還可知，在IPTG濃度相同條件下，誘導時間的不同，誘導產生的His-Tag融合蛋白His-JcFATA（約48 KD）的表達量也不同，當誘導時間為15 h時，可以獲得最佳的誘導效果。在誘導時間相同的條件下，隨著IPTG濃度的增加，誘導產生的融合蛋白的表達量也會改變，當IPTG濃度為0.5 mmol/L時，可以獲得最佳的融合蛋白表達量。

2.3.2 誘導溫度對His融合蛋白His-JcFATA誘導的影響。為了進一步優化His-Tag融合蛋白His-JcFATA誘導表達體系，本研究在誘導時間為15 h和添加0.5 mmol/L IPTG的條件下，對誘導溫度進行了探討，進一步優化His-Tag融合蛋白His-JcFATA誘導表達體系。不同誘導體系的超聲破碎產物上清液經SDS-PAGE電泳分析，從而確定最佳條件。由圖5可知，隨著誘導溫度的提高，目的蛋白的表達量也隨之增加，當誘導溫度為25 ℃時，可以獲得最佳的誘導效果，而當誘導溫度超過25 ℃時，誘導產生的His-Tag融合蛋白His-JcFATA表達量會有所減少。

2.4 His-Tag融合蛋白His-JcFATA純化

His-Tag融合蛋白是目前最常見、最成熟的表達方式，它的優點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性，無論是表達的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜法（Immobilized Metal-ion affinity chromatography，IMAC）來純化[15-16]。

本研究對純化體系進行優化，試驗結果如圖6所示。由圖6可知，在進行蛋白純化前，表達產物中有一些其他的蛋白成分（圖6中的15 h和上清條帶）；發現第3次洗脫（圖6中的E3條帶）時，可以獲得最多的His-Tag融合蛋白His-JcFATA，而從第5次（圖6中的E5條帶）洗脫開始，可以獲得較為純凈的目的蛋白。綜上所述，收獲目的蛋白最好是在第5次洗脫時開始收集。

3 討論與結論

3.1 討論

FATA是植物脂肪酸合成代謝中的關鍵酶，在游離脂肪酸的釋放過程中起核心調控的作用，可能直接影響脂肪酸的含量與組成[1，9-10]。本研究通過基因重組技術獲得了黃腫樹JcFATA基因的原核表達載體，并在大腸桿菌中成功表達了帶His標簽的JcFATA融合蛋白；此外，還建立了較好的蛋白純化方法，獲得了較高純度的融合蛋白His-JcFATA。

誘導外源基因的原核表達受IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度等因素的影響[17]。首先，誘導溫度的高低直接影響到蛋白表達成功與否，以及影響所表達蛋白的溶解性。前人的研究表明一般在37 ℃的溫度下最有利于大腸桿菌的快速增長，蛋白表達速度最快，獲得的蛋白量最大[18-20]。然而，本研究的結果顯示25 ℃為最佳誘導溫度，這可能是由于本次研究所使用的原核表達載體為pCold Ⅰ，該載體具有冷休克蛋白基因（Cold shock protein A，CSPA）啟動子，該啟動子功能強大，能在較低溫度下高效的誘導目的基因表達；同時使用這種低溫高效表達載體還可以有效減少由于高溫條件下蛋白的快速合成從而導致形成較多的蛋白包涵體（包涵體不具有可溶性且蛋白的活性低）的現象發生。另外，IPTG濃度也會嚴重影響對蛋白的表達，IPTG濃度過高不利于大量目的蛋白的獲得，這可能是由于IPTG本身對菌株有一定的毒性，因而過高的IPTG誘導濃度反而會抑制目的蛋白的表達。

pCold Ⅰ載體含有的His標簽可作為純化的標記，經誘導表達的重組蛋白經過帶有His標簽的鎳柱時會被選擇性吸附，再經過洗脫后就可以獲得純化的目的蛋白。由于His標簽很小、不帶電荷且沒有免疫原性，因而它不會影響融合蛋白在細胞內的分泌和折疊，也不會對所純化蛋白的結構與功能產生干擾作用[15-16]。

在蛋白純化過程中，可能由于一些非特性蛋白與目的融合蛋白His-JcFATA競爭性的與His親和介質結合，導致純化的目的蛋白純度不高。為了獲得高純度的His-JcFATA融合蛋白，本研究對蛋白的純化條件進行了優化，結果表明，洗脫次數非常關鍵，洗脫次數太少，所獲得的目的蛋白純度不夠，當洗脫次數達到5次時可獲得較高純度的融合蛋白His-JcFATA。本研究的結果為進一步分析JcFATA蛋白的結構與功能奠定研究基礎。

3.2 結論

本研究將克隆的JcFATA基因表達片段插入到原核表達載體pCold Ⅰ中，將其轉化大腸桿菌DH5α，經過氨芐青霉素抗性篩選、酶切檢測和菌液PCR鑒定，確認成功構建了JcFATA基因原核表達載體（pCold Ⅰ-JcFATA），將pCold Ⅰ-JcFATA轉入大腸桿菌Rosseta，形成pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta原核表達菌株，對其進行原核表達誘導并優化了表達體系（最佳誘導條件：IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導時間為15 h，培養溫度為25 ℃）和純化條件（洗脫次數達到5次），為進一步深入研究JcFATA基因和蛋白的功能奠定基礎。

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