柴胡疏肝散對功能性消化不良大鼠胃排空的促進作用及機制

周洲，凌江紅，徐寬，張麗敏，張鈺琴，王煜姣，謝天一

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

柴胡疏肝散對功能性消化不良大鼠胃排空的促進作用及機制

周洲，凌江紅，徐寬，張麗敏，張鈺琴，王煜姣，謝天一

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

目的觀察柴胡疏肝散對功能性消化不良(FD)大鼠胃排空的促進作用，并探討其作用機制。方法將24只健康成年SD大鼠隨機均分為正常組、模型組、柴胡疏肝散組與多潘力酮組。除正常組外，其余各組均采用夾尾刺激法制備FD模型。各組均于造模第1天給予藥物干預，柴胡疏肝散組、多潘立酮組分別給予0.63 g/mL柴胡疏肝散水煎劑1.5 mL、0.6 mg/mL多潘立酮水溶液1.5 mL灌胃，正常組、模型組均給予生理鹽水1.5 mL灌胃，2次/d，共干預4周。末次給藥后24 h,各組予以營養性半固體糊(1.5 mL/100 g體質量)灌胃，30 min后麻醉開腹，剪取完整胃，根據全胃重、空胃重計算胃排空率。用HE染色法觀察胃竇部黏膜組織病理變化，用免疫組化法檢測胃竇部黏膜組織中蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)和磷酸化真核翻譯起始因子2α(p-eIF2α)蛋白表達。結果與正常組比較，模型組大鼠胃排空率低(P<0.05)；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組胃排空率高(P均<0.05)。模型組、柴胡疏肝散組和多潘立酮組胃竇組織可見少量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠胃竇組織內PERK、p-eIF2α蛋白表達高(P均<0.05)；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組胃竇組織內PERK、p-eIF2α蛋白表達低(P均<0.05)。結論柴胡疏肝散可能通過調控內質網應激信號通路PERK/eIF2α促進FD大鼠胃排空。

功能性消化不良；柴胡疏肝散；中藥；內質網應激；蛋白激酶R樣內質網激酶;磷酸化真核翻譯起始因子2α；大鼠

功能性消化不良(FD)是由胃和十二指腸功能紊亂引起的一系列消化道癥狀[1]。研究表明，胃腸動力障礙是其重要的發病機制，并且精神心理障礙如抑郁焦慮、情志不舒等是其重要的促發因素[2]。柴胡疏肝散為疏肝理氣最具代表性的方劑之一，具有疏肝解郁、理氣止痛的功效，主治肝郁氣滯證。現代臨床及實驗研究均表明，柴胡疏肝散對FD具有良好療效，能明顯緩解癥狀，但具體作用機制尚不清楚[3，4]。本課題組前期研究發現，柴胡疏肝散具有促胃動力作用，并且其機制可能與抑制FD大鼠胃竇組織中胃動力相關細胞的自噬有關[5]。有研究表明，內質網應激可通過蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)/磷酸化真核翻譯起始因子2α(eIF2α)信號通路調控自噬[6]。2016年10月～2017年6月，本研究觀察柴胡疏肝散對FD大鼠胃排空的促進作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器來源 清潔級SD大鼠24只，雌雄各半，體質量(150±10)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，其合格證號：SCXK桂2015-0003。柴胡疏肝散(柴胡6 g、陳皮6 g、川芎4.5 g、枳殼4.5 g、白芍4.5 g、香附4.5 g、炙甘草1.5 g)中藥飲片購自廣西醫科大學第一附屬醫院，按照中藥常規煎法制備成生藥含量0.63 g/mL的中藥溶液，4 ℃冰箱保存備用。多潘立酮購自西安楊森制藥公司，批號150324778，規格10 mg/片，用蒸餾水配制成0.6 mg/mL的藥液備用。PERK單克隆抗體由美國Novus公司提供；p-eIF2α單克隆抗體由美國CST公司提供；SP-9000免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑由北京中山金橋生物科技有限公司提供；PBS緩沖液及中性樹膠封片劑，由上海碧云天生物科技有限公司提供。RM2235石蠟切片機購自德國Leica公司；CX41光學顯微鏡及Image-Pro Plus 6.0(IPP6.0)圖像分析系統購自日本Olympus公司。

1.2 動物分組、模型制備及藥物干預 SD大鼠適應性喂養3 d，隨機均分為正常組、模型組、柴胡疏肝散組和多潘立酮組。除正常組外，其余大鼠均參照文獻[7]方法進行造模。每日用包裹了海綿的長鉗鉗夾大鼠尾部末端1/3處，以不破皮為度，令其尖叫或與其他大鼠打斗，每次30 min，2次/d，每2次間隔至少8 h，持續4周。期間如大鼠被抓傷，可用0.5%碘伏消毒受傷部位，以防感染。于造模第1天開始給予藥物干預，柴胡疏肝散組給予0.63 g/mL柴胡疏肝散水煎劑1.5 mL灌胃，多潘立酮組給予0.6 mg/mL多潘立酮水溶液1.5 mL灌胃，正常組和模型組均給予生理鹽水1.5 mL灌胃，2次/d，共干預4周。

1.3 大鼠胃排空率測算 參照文獻[8]，大鼠末次給藥后禁食不禁水24 h，予以營養性半固體糊(羧甲基纖維素鈉10 g、全脂奶粉16 g、糖8 g、淀粉8 g、蒸餾水200 mL)灌胃，1.5 mL/100 g體質量。30 min后用10%水合氯醛麻醉，開腹，迅速結扎賁門和幽門，剪取完整的胃，濾紙吸干稱取重量為全胃重。沿胃大彎剪開胃壁并用生理鹽水沖洗干凈胃壁，濾紙吸干，稱取重量為空胃重。胃排空率(%)=[1-(全胃重-空胃重)/總灌胃量]×100%。

1.4 大鼠胃竇部黏膜組織病理變化觀察 采用HE染色法。取大鼠胃竇部黏膜組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，取出組織，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，常規切片4 μm，45 ℃水浴中撈片，80 ℃烤箱烤片，30 min；切片放入二甲苯中浸泡10 min×3次；依次放入無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇各2 min，自來水漂洗5次；蘇木素染核10 min，自來水漂洗5次；浸入1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水漂洗5次，碳酸鋰飽和水溶液返藍1 min，流水沖洗15 min；0.5%伊紅染漿2～5 min，自來水洗片刻；95%乙醇和無水乙醇各脫水2次，每次2 min；二甲苯脫水透明2次，每次2 min；中性樹膠封片，×400鏡下觀察。

1.5 大鼠胃竇部黏膜組織PERK、p-eIF2α蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。實驗過程中用PBS分別代替兩種一抗作為空白對照以檢驗免疫反應特異性。步驟：石蠟切片脫蠟水化，泡入抗原修復液(檸檬酸鈉緩沖液)中，高壓鍋高溫修復5 min，自來水洗3次；滴加過氧化氫，避光10 min；PBS泡洗3次，每次5 min；滴加A液(山羊血清)封閉，室溫孵育10 min；甩干，滴加一抗(根據抗體說明書及預實驗結果，PERK最佳濃度為1∶1 000；p-eIF2α最佳濃度為1∶500)，4 ℃濕盒過夜；復溫，PBS洗3次，每次5 min，滴加B液(二抗)，孵育10～30 min；甩干，滴加C液，10 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加新鮮配置的DAB顯色劑，2～5 min，顯微鏡下觀察；自來水沖洗，蘇木素染色1～2 min；自來水漂洗干凈，鹽酸酒精泡30 s，自來水泡洗20 min返藍；晾干，中性樹膠封片；用光學顯微鏡(10×40倍)觀察，鏡下隨機選取5個視野的陽性細胞，用IPP圖像分析系統自動檢測各個視野的光密度值，并計算平均值作為目標蛋白表達水平。

2 結果

2.1 各組大鼠胃排空率比較 正常組、模型組、柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠胃排空率分別為59.83%±2.41%、45.60%±3.53%、56.68%±2.69%、52.25%±3.54%；與正常組比較，模型組大鼠胃排空率低(P<0.05)；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組胃排空率高(P均<0.05)；多潘立酮組與柴胡疏肝散組胃排空率比較，P>0.05。

2.2 各組大鼠胃竇組織病理變化 HE染色結果顯示，各組大鼠胃竇組織結構層次清晰，黏膜上皮完整，未見潰瘍、增生、化生等病理改變；各組織層中的細胞排列規則。模型組、柴胡疏肝散組和多潘立酮組可見少量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤。

2.3 各組大鼠胃竇組織中PERK、p-eIF2α蛋白表達比較 PERK蛋白定位于胞質，細胞著色呈棕黃色為陽性細胞。正常組、模型組、柴胡疏肝散組、多潘立酮組大鼠胃竇組織PERK蛋白表達水平(光密度值)分別為0.018±0.008、0.165±0.034、0.037±0.013、0.021±0.011；p-eIF2α蛋白表達水平(光密度值)分別為0.031±0.029、0.170±0.045、0.094±0.027、0.062±0.019。與正常組比較，模型組大鼠胃竇組織內PERK、p-eIF2α蛋白表達高(P均<0.05)；與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組胃竇組織內PERK、p-eIF2α蛋白表達低(P均<0.05)；與多潘立酮組比較，柴胡疏肝散組胃竇組織內PERK、p-eIF2α蛋白表達高(P均<0.05)

3 討論

FD是臨床常見的功能性胃腸病。近年來諸多研究表明其病因多與胃腸功能障礙有關[4，9]。胃竇間質細胞和胃竇平滑肌細胞是胃竇組織中最主要的兩種細胞，二者與胃腸功能障礙的發生有密切關系[10，11]。研究已經證實，胃竇間質細胞是調節胃腸運動的起搏者，決定著胃腸慢波的形成；而平滑肌細胞作為效應器則決定著胃腸運動的收縮與舒張。有研究表明這兩種細胞的數量變化或者結構破壞，可能是導致胃腸動力障礙性疾病的關鍵[11,12]。本課題組前期研究發現，柴胡疏肝散復方或單味中藥枳實治療FD的機制也與這兩種細胞密切相關[13,14]。進一步研究發現，其機制可能與抑制細胞的自噬有關[15]。有研究表明，內質網應激可以誘導細胞自噬的發生，而且Ding等[16]通過不同的內質網應激誘導劑作用于腫瘤細胞和正常細胞，結果表明，對于正常細胞，內質網應激誘導的自噬會導致細胞死亡，進而引起細胞數量的減少。因此本研究基于前期的研究基礎，進一步探索柴胡疏肝散對細胞自噬的抑制作用是否通過抑制FD大鼠胃竇組織內質網應激實現的。

在祖國傳統醫學中無FD這一病名，但根據其臨床特點，將其歸屬于“胃腕痛”“痞證”“嘈雜”“反胃”等范疇。中醫學認為，肝主疏泄，具有調暢氣機，助脾胃運化、條達情志等功能。肝疏泄正常，氣機調暢，脾胃才能發揮升降之樞紐作用；相反，肝疏泄不及，肝氣郁結，必將橫逆犯胃，從而使胃失和降。在FD的中醫分型中，肝郁氣滯是最常見的一型，疏肝理氣是其主要的治法[15]。柴胡疏肝散作為疏肝理氣的代表方劑，對FD具有良好療效。既往關于柴胡疏肝散治療FD的機制多從調節胃泌素、生長抑素、5-羥色胺等腦腸肽對胃腸道的調控著手。本研究直接從胃腸道這一主體出發，在組織細胞層面做進一步探索。采用制備肝郁氣滯模型最常用的夾尾刺激法制備FD大鼠模型，在造模過程中大鼠出現食欲下降、精神萎靡、體質量減輕、糞便稀軟、扎推易怒等外在表現。研究結果顯示，模型組大鼠胃排空率低于正常組，并且FD大鼠的胃組織病理切片結果排除了器質性病變，提示FD造模成功。與模型組比較，柴胡疏肝散組、多潘立酮組胃排空率均提高(P均<0.05)，表明柴胡疏肝散對FD大鼠胃排空具有促進作用。

內質網是細胞內負責蛋白折疊、成熟和轉運的最主要的細胞器。更重要的是有研究表明內質網是感應微妙環境變化、細胞壓力、協調信號通路、調控細胞功能及細胞存活的重要細胞器之一[16]。許多生理病理情況下，如蛋白過度突變、病毒感染、能量營養缺乏、氧化還原狀態的改變都能損傷內質網蛋白折疊功能，從而導致內質網腔內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的大量聚集，進而產生內質網應激。在真核生物中，細胞為了應對這種壓力，啟動了一個重要信號反應機制，稱作未折疊蛋白反應(UPR)[17]。PERK/eIF2α信號通路就是UPR的一條重要分支，也是內質網應激狀態下最先激活的一條重要通路。發生內質網應激時，PERK與內質網膜上的伴侶蛋白BIP分離后通過自身的磷酸化導致eIF2α的磷酸化，進而減少蛋白的合成以幫助內質網恢復正常功能，但是內質網應激持續時間過長或者過度強烈時，PERK/eIF2α信號通路就無法恢復內質網的功能，而是促使細胞走向自噬[18]。Zou等[19]在研究脂多糖誘導HL-1細胞自噬時發現，內質網應激在這一過程中扮演重要角色，而且敲除細胞PERK基因后，細胞中自噬標志蛋白LC3Ⅱ表達下降，p62表達增加。由此說明PERK/eIF2α信號通路的激活在內質網應激誘導自噬的過程中是必要的。因此PERK的激活和p-eIF2α可以看作是內質網應激存在的核心標志物。本研究結果顯示，與正常組比較，FD大鼠胃竇組織內PERK和p-eIF2α蛋白表達均升高，提示FD大鼠胃竇組織內存在內質網應激現象。與模型組比較，柴胡疏肝散組FD大鼠胃竇組織內PERK和p-eIF2α表達均降低(P均<0.05)，且較多潘立酮組降低明顯(P均<0.05)，表明柴胡疏肝散能抑制FD大鼠胃竇組織內內質網應激PERK/eIF2α信號通路。

綜上所述，柴胡疏肝散促進FD大鼠胃排空的作用機制可能與其調控內質網應激信號通路PERK/eIF2α有關。

[1] Suzuki H. The application of the Rome Ⅳ criteria to functional esophagogastroduodenal disorders in Asia[J]. J Neurogastroenterol Motil, 2017,23(3):325-333.

[2] Van OL, Aziz Q. The role of psychosocial factors and psychiatric disorders in functional dyspepsia[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2013,10(3):158-167.

[3] Qiu XJ, Huang X, Chen ZQ, et al. Pharmacokinetic study of the prokinetic compounds meranzin hydrate and ferulic acid following oral administration of Chaihu-Shugan-San to patients with functional dyspepsia[J]. J Ethnopharmacol, 2011,137(1):205-213.

[4] 王煜姣,凌江紅,張鈺琴,等.疏肝理氣法對功能性消化不良大鼠行為學及胃腸動力的影響[J].時珍國醫國藥,2015,26(4):999-1001.

[5] 曾麗君,凌江紅,鄧靜,等.柴胡疏肝散對功能性消化不良大鼠胃竇肌間Cajal間質細胞自噬的影響[J].時珍國醫國藥,2017,28(5):1041-1044.

[6] Kouroku Y, Fujita E, Ueno T, et al. ER stress (PERK/eIF2alpha phosphorylation) mediates the polyglutamine-induced LC3 conversion, an essential step for autophagy formation[J]. Cell Death Differ, 2007,14(2):230.

[7] 張鈺琴,凌江紅,梁綱,等.柴胡疏肝散對夾尾應激大鼠腦和胃組織GASR mRNA和CCK-AR mRNA表達的影響[J].時珍國醫國藥,2010,21(5):1081-1083.

[8] 黃愛華,遲玉廣,曾元兒,等.枳實黃酮對功能性消化不良大鼠胃腸動力的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,23(6):612-615.

[9] 方盛泉,朱生梁,倪紅梅,等.功能性消化不良中醫證型與胃動力學的關系及其臨床意義探討[J].上海中醫藥大學學報,2005,19(2):27-28.

[10] 紀云西,凌江紅,龐黎明,等.胃腸道Cajal間質細胞、Ca2+與胃腸動力[J].實用醫學雜志,2013,29(11):1872-1873.

[11] 王垂杰,姜巍.功能性消化不良肝郁模型大鼠胃排空障礙與胃平滑肌超微結構的關系[J].中國中西醫結合消化雜志,2009,17(2):86-88.

[12] Adad SJ, Silva GB, Jammal AA. The significantly reduced number of interstitial cells of Cajal in chagasic megacolon (CM) patients might contribute to the pathophysiology of CM[J]. Virchows Arch, 2012,461(4):385-392.

[13] 張智,凌江紅,寧海恩,等.柴胡疏肝散含藥血清對大鼠胃Cajal間質細胞增殖及細胞周期的影響[J].世界華人消化雜志,2015,23(30):4792-4799.

[14] 李東鑫,凌江紅,王煜姣,等.枳實含藥血清對大鼠胃竇平滑肌細胞收縮效應及細胞內鈣離子濃度、鈣調蛋白表達的影響[J].世界華人消化雜志,2015,23(8):1224-1230.

[15] 王代梅,曹澤偉.健脾理氣中藥聯合伊托必利治療功能性消化不良療效觀察[J].山東醫藥,2011,51(52):58-60.

[16] Ding W, Ni H, Hou Y, et al. Differential effects of endoplasmic reticulum stress-induced autophagy on cell survival[J]. J Biol Chem, 2007,282(7):4702-4710.

[17] Naidoo N. ER and aging-Protein folding and the ER stress response[J]. Ageing Res Rev, 2009,8(3):150-159.

[18] Renata S, Reed JC. ER stress-induced cell death mechanisms[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1833(12):3460-3470.

[19] Zou X, Xu J, Yao S, et al. Endoplasmic reticulum stress-mediated autophagy protects against lipopolysaccharide-induced apoptosis in HL-1 cardiomyocytes[J]. Exp Physiol, 2014,99(10):1348-1358.

ChaihuShuganpowderpromotesgastricemptyingofratswithfunctionaldyspepsia

ZHOUZhou,LINGJianghong,XUKuan,ZHANGLimin,ZHANGYuqin,WANGYujiao,XIETianyi

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo observe the promotion of Chaihu Shugan powder on gastric emptying of functional dyspepsia (FD) rats and to investigate the underlying mechanism.MethodsTwenty-four healthy adult SD rats were randomly divided into the normal group, the model group, the Chaihu Shugan powder group, and the domperidone group. The FD rat model was established by tail clamping in all groups except the normal group. All rats were medicated from the first day of modeling, rats in the Chaihu Shugan powder group and domperidone group were treated with 0.63 g/mL Chaihu Shugan powder decoction 1.5 mL and 0.6 mg/mL domperidone suspension 1.5 mL by gavage, respectively, and rats in the normal group and model group were administered normal saline 1.5 mL by gavage, all medications were implemented twice a day and for 4 weeks. At 24 hours after the last medication, all rats were fed with semisolid nutrient paste (1.5 mL/100 g weight) to get the whole stomach by laparotomy with anesthesia after 30 minutes, and then we calculated rates of gastric emptying on the basis of weights of total stomach and empty stomach. The histopathological changes of gastric antrum mucosa were observed by HE staining. The immunohistochemistry (IHC) technique was used to measure the protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α signaling pathway (p-eIF2α) protein expression levels of gastric antrum mucosa tissues in rats.ResultsCompared with the normal group, the rate of gastric emptying in the model group decreased (P<0.05); compared with the model group, the gastric emptying rates of the Chaihu Shugan powder group and domperidone group increased (bothP<0.05). Cells in different tissue layers arranged well. A few lymphocytic and neutrophil infiltrated in antrum of rats in the model group, Chaihu Shugan powder group and domperidone group. Compared with the normal group, the expression of both PERK and p-eIF2α increased in the model group (bothP<0.05); compared with the model group, the expression of PERK and p-eIF2α decreased in the Chaihu Shugan powder group and domperidone group (bothP<0.05).ConclusionChaihu Shugan powder can promote the gastric emptying of FD rats by regulating the endoplasmic reticulum stress signaling pathway PERK/eIF2α.

functional dyspepsia; Chaihu Shugan powder; traditional Chinese medicine; endoplasmic reticulum stress; protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase; phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α; rats

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.002

R333.5

A

1002-266X(2017)37-0005-04

國家自然科學基金資助項目(81560763)。

周洲(1990-)，男，在讀碩士，主要研究方向為脾胃病的中西醫結合診療。E-mail:604488606@qq.com

凌江紅(1969-)，女，教授，主要研究方向為內科消化系統疾病、腦病的中西醫結合診療。E-mail：459183870@qq.com

2017-06-24)