細(xì)胞周期調(diào)控基因及Bcl-2、c-Jun基因在人肝細(xì)胞脂肪變性過程中的表達(dá)變化

包成，畢玉晶，楊瑞馥，智發(fā)朝

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院·廣東省南方消化病研究所，廣州510515；2北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)

細(xì)胞周期調(diào)控基因及Bcl-2、c-Jun基因在人肝細(xì)胞脂肪變性過程中的表達(dá)變化

包成1，2，畢玉晶2，楊瑞馥2，智發(fā)朝1

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院·廣東省南方消化病研究所，廣州510515；2北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)

目的觀察細(xì)胞周期調(diào)控基因及Bcl-2、c-Jun基因在人肝細(xì)胞L02脂肪變性過程中的表達(dá)變化。方法以油酸和軟脂酸(2∶1)混合液處理L02細(xì)胞0、5、10、20 h，建立人肝細(xì)胞脂肪變性模型。用油紅O染色檢測L02細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量；用熒光定量PCR技術(shù)檢測L02細(xì)胞脂肪變性過程中CDK2、CDK4、CyclinD1、Bcl-2、c-Jun mRNA表達(dá)。結(jié)果隨造模時間延長，L02細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴聚集越來越多，至造模20 h，肝細(xì)胞染成橘紅色。L02細(xì)胞內(nèi)CDK2 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，造模5 h達(dá)最高(P均<0.05)，隨后逐漸下降；CDK4 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，造模10 h達(dá)最高(P均>0.05)，隨后逐漸下降，造模20 h最低(P均>0.05)；不同時間點Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量隨造模時間延長而升高，造模10 h達(dá)最高(P<0.05)，隨后降低；造模5、10、20 h的c-Jun mRNA相對表達(dá)量均較造模0 h高(P均<0.05)，但無變化規(guī)律。結(jié)論人肝細(xì)胞L02脂肪變性過程中癌癥相關(guān)基因CDK2、CDK4、Bcl-2、c-Jun表達(dá)先升高后降低，Cyclin D1表達(dá)變化不明顯。

肝細(xì)胞脂肪變性；細(xì)胞周期；細(xì)胞周期蛋白；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子;B細(xì)胞白血病-淋巴瘤基因2；c-Jun基因

脂肪肝是最常見的與代謝紊亂相關(guān)的慢性肝病，在全世界發(fā)病率高，約為11%～46%，并有潛在的嚴(yán)重后遺癥[1]。脂肪肝疾病譜包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌。細(xì)胞周期分為G1、S、G2、M期。細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換主要受細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和CDK抑制因子(CKI)調(diào)控。細(xì)胞周期調(diào)控異常與癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)。細(xì)胞周期紊亂可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。B細(xì)胞白血病-淋巴瘤基因2(Bcl-2)是抗凋亡基因，可通過抑制細(xì)胞凋亡從而介導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生[2]。c-Jun家族癌基因在多種惡性腫瘤發(fā)展過程中起重要作用[3]。脂肪肝可以逐步發(fā)展為肝癌。研究在肝細(xì)胞脂肪變性過程中癌癥相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)變化，對探討脂肪肝發(fā)展為肝癌的過程具有重要意義。2016年8月～2017年1月，本研究旨在探究癌癥相關(guān)基因(CDK2、CDK4、CyclinD1、Bcl-2、c-Jun基因)在人肝細(xì)胞脂肪變性的體外模型中不同造模時相的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器來源 人肝細(xì)胞株L02由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈送；DMEM培養(yǎng)液購自Neuronbc公司，胰蛋白酶購自GE Healthcare Life Sciences公司，軟脂酸、油酸、油紅O試劑、蘇木精試劑購自Sigma公司；倒置顯微鏡購自Zeiss公司，熒光定量PCR儀器購自Roche公司，SYBR premix ExTaq購自Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 將L02細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d換液1次。待細(xì)胞生長至80%～90%時用胰蛋白酶消化，按1∶5比例傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板進(jìn)行實驗。加入0.5 mmol/L油酸和軟脂酸(2∶1)混合液處理人L02肝細(xì)胞株，建立肝細(xì)胞脂肪變性模型。

1.3 L02細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量檢測 采用油紅染色法。分別于油酸和軟脂酸混合液處理(造模)0、5、10、20 h收集相應(yīng)的脂肪變性L02細(xì)胞，加4%多聚甲醛孵育1 h，棄甲醛再加60%異丙醇并孵育5 min，棄60%異丙醇，均勻加油紅O工作液，搖勻并室溫避光孵育20 min，棄油紅O工作液，水洗2～5次，加蘇木精孵育1 min。棄蘇木精，水洗2～5次。用蒸餾水覆蓋細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并對細(xì)胞進(jìn)行拍照。脂質(zhì)形成的標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)油紅染色后L02細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)形成橘紅色脂滴。

1.4 L02細(xì)胞內(nèi)CDK2、CDK4、CyclinD1、Bcl-2、c-Jun mRNA表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR技術(shù)。分別于造模0、5、10、20 h收集L02細(xì)胞提取RNA。配消化DNA體系50 μL(10×DNase Ⅰ buffer 5 μL，rDNase Ⅰ 2 μL，RNA 4～7 μg，剩余以水填充)。于PCR儀中消化，37 ℃、30 min；加入DNA酶失活劑10 μL混勻滅活DNase，離心后取上清液用于逆轉(zhuǎn)錄。變性：配體系(N6隨機(jī)引物1 μL，消化離心后的RNA 23 μL)，于PCR儀中進(jìn)行變性，70 ℃ 10 min，變性后立即放置于-20 ℃冰箱8 min防止復(fù)性。逆轉(zhuǎn)錄：配體系(5×First-Strand buffer 8 μL，0.1 mol/L DTT 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNase抑制劑1 μL)，每管加入15 μL，再加入SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL。逆轉(zhuǎn)錄程序：25 ℃、10 min，50 ℃、60 min，70 ℃、15 min，4 ℃恒溫。配體系：SYBR premix 10 μL，上下引物各0.6 μL，H2O 6.8 μL，模板2 μL。引物序列：CDK2正向引物：5′-CATGAGGTGGTGACCCTGTGG-3′，反向引物：5′-GTCGTAGTGCAGCATTTGCG-3′；CDK4正向引物：5′- CATTCTGGTGACAAGTGGTGG-3′，反向引物：5′-CGGCTTCAGAGTTTCCACAGA-3′；Cyclin D1正向引物：5′-TTGTTGAAGTTGCAAAGTCCTGG-3′，反向引物：5′- CGGATGGTTTCCACTTCGC-3′；Bcl-2正向引物：5′- CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3′，反向引物：5′-GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3′；c-Jun正向引物：5′- GCCAGGTCGGCAGTATAGTC-3′， 反向引物：5′- GGACTCTGCCACTTGTCTCC-3′。采用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。用LCS480 1.50.SP4軟件(Roche)計算CDK2、CDK4、CyclinD1、Bcl-2、c-Jun mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

油紅O染色結(jié)果：隨造模時間延長，L02細(xì)胞里的橘紅色脂滴越來越多；造模20 h，L02細(xì)胞被染成橘紅色，說明L02細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。隨造模時間延長，CDK2 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，造模5 h達(dá)最高(P均<0.05)，隨后逐漸下降；CDK4 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，造模10 h達(dá)最高(P均>0.05)，隨后逐漸下降，造模20 h最低(P均>0.05)；不同時間點Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量隨造模時間的延長而升高，造模10 h達(dá)最高(P<0.05)，隨后降低；造模5、10、20 h的c-Jun mRNA相對表達(dá)量均較造模0 h高(P均<0.05)。見表1。

表1 L02細(xì)胞不同時間點癌變相關(guān)基因表達(dá)比較

3 討論

細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換主要受Cyclin、CDK和CKI的調(diào)控。Cyclins與CDK結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換[4]。CDK2的活性對細(xì)胞周期的運(yùn)行至關(guān)重要[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，CDK2、CDK4 mRNA在肝細(xì)胞脂肪變性過程中呈一過性表達(dá)升高，提示肝脂肪變可能會激活肝細(xì)胞CDK2和CDK4的活性，潛在影響細(xì)胞周期調(diào)控；而CyclinD1 mRNA在肝脂肪變過程中其表達(dá)并未出現(xiàn)明顯變化。Rb蛋白磷酸化不足時會出現(xiàn)CyclinD1過表達(dá)[6]，推測油酸和軟脂酸混合液可能會使Rb蛋白磷酸化。

細(xì)胞周期通過正負(fù)調(diào)節(jié)因子作用來維持正常運(yùn)行，當(dāng)調(diào)節(jié)因子失衡時，異常細(xì)胞逃離正常細(xì)胞周期的監(jiān)測，從而為細(xì)胞癌變的發(fā)生提供基礎(chǔ)[7]。癌癥中細(xì)胞周期調(diào)控基因會發(fā)生異常，如CDK2在癌癥組織中可長期呈高表達(dá)[8]。因此CDK調(diào)節(jié)功能和細(xì)胞周期檢查位點功能的缺失可與癌癥的分子病理機(jī)制有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可促進(jìn)注射了CT26結(jié)腸癌細(xì)胞的BALB/c小鼠主動脈微血管生成、實體瘤生長以及腫瘤肺轉(zhuǎn)移，免疫組化法檢測顯示，小鼠腫瘤組織中cyclin A、Cyclin D1和CDK2的表達(dá)明顯增加[9]，表明高脂飲食可以破壞正常細(xì)胞的周期調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)行無限增殖分化。細(xì)胞周期調(diào)控?zé)o論是在肝細(xì)胞脂肪變性還是肝細(xì)胞癌變的過程中都起到重要作用。本研究表明細(xì)胞周期調(diào)控對脂肪肝以后發(fā)展為肝細(xì)胞癌具有重要意義。

Bcl-2是一種抗凋亡基因，在生長因子受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，它通過抑制細(xì)胞凋亡從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，使細(xì)胞色素C從線粒體泄漏，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞脂肪變性模型可以誘導(dǎo)活化Bcl-2，表明Bcl-2對脂肪肝將來發(fā)展為肝細(xì)胞癌具有一定的影響。

c-Jun家族癌基因在惡性腫瘤的進(jìn)展中也起到重要作用。在癌旁異型增生肝組織以及肝癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)c-Jun異常表達(dá)[3]。JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是胰島素抵抗和脂肪酸誘導(dǎo)的肝毒性的關(guān)鍵介質(zhì)。肝細(xì)胞在脂毒性的狀態(tài)通過上調(diào)JNK和Bcl-2相互作用介質(zhì)而最終發(fā)生凋亡。有關(guān)腸癌動物模型的研究表明，c-Jun的致瘤功能依賴于JNK對其的磷酸化作用，因此JNK/c-Jun通路有致瘤作用[10，11]。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞脂肪變性可使c-Jun mRNA的表達(dá)升高，表明癌癥相關(guān)基因c-Jun在脂肪肝時期就有了轉(zhuǎn)錄水平的升高。

綜上所述，肝細(xì)胞脂肪變性模型實驗顯示，細(xì)胞周期調(diào)控基因、Bcl-2、c-Jun等癌癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著肝細(xì)胞脂肪變性過程的推進(jìn)，出現(xiàn)了不同程度的改變，而以上調(diào)控基因表達(dá)異常與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。提示本研究中癌癥相關(guān)基因可能參與了脂肪肝發(fā)展為肝癌的過程。這為研究脂肪肝的病理生理機(jī)制及治療方法提供了新思路。

[1] Berlanga A, Guiu-Jurado E, Porras JA, et al. Molecular pathways in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Clin Exp Gastroenterol, 2014,7:221-239.

[2] 苑建磊，蘭濤，周國慶，等.VEGF、Bag-1及Bcl-2在肝癌中的表達(dá)及意義[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,13(4):268-271.

[3] 張穎超，韓喜春，賈明庫，等.癌基因c-fOS和c-jun在肝細(xì)胞型肝癌中的表達(dá)及臨床意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報,2002,28(1):46-48.

[4] Gopinathan L, Tan SL, Padmakumar VC, et al. Loss of Cdk2 and cyclin A2 impairs cell proliferation and tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2014,74(14):3870-3879.

[5] Mueller S, Huard J, Waldow K, et al. T160-phosphorylated CDK2 defines threshold for HGF-dependent proliferation in primary hepatocytes[J]. Mol Syst Biol, 2015,11(3):795.

[6] Rao SS, Chu C, Khotz DS. Ectopic expression of cyclin D1 prevents activation of gene transcription by myogenic basic-helix-loop-helix regulators[J]. Mol Cell Biol, 1994,14(8):5259-5267.

[7] 盧斌，戴益民.肝癌發(fā)生中細(xì)胞周期調(diào)控的異常[J].世界華人消化雜志,2001,9(2):205-208.

[8] Kawana H, Tamaru J, Tanaka T, et al. Role of p27Kip1 and cyclin-dependent kinase 2 in the proliferation of non-small cell lung cancer[J]. Am J Pathol, 1998,153(2):505-513.

[9] Park H, Kim M, Kwon G T, et al. A high-fat diet increases angiogenesis, solid tumor growth, and lung metastasis of CT26 colon cancer cells in obesity-resistant BALB/c mice[J]. Mol Carcinog, 2012,51(11):869-880.

[10] 包翠芳,魏嘉,梁佳,等.前列地爾對局灶性腦缺血大鼠p-JNK及p-c-Jun表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2011,51(25):15-16.

[11] 倪桂蓮,崔融,陳干明,等.加巴噴丁對糖尿病神經(jīng)痛大鼠痛敏和脊髓Glu及下丘腦JNK的影響[J].中華全科醫(yī)學(xué),2015,13(11):1757-1759,1907.

Expressionchangesofcellcycleregulatorygenes,Bcl-2,andc-Junintheprocessofhumanhepaticsteatosis

BAOCheng1,BIYujing,YANGRuifu,ZHIFachao

(1NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

ObjectiveTo investigate the expression changes of cell cycle regulatory genes [Cyclin-dependent kinase2 (CDK2), Cyclin-dependent kinase4 (CDK4), and CyclinD1], B-cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2), and c-Jun in the process of human hepatic steatosis.MethodsL02 liver cell line was incubated with mixture of oleic acid and palmitic acid by the ratio of 2:1 (OP21) for 0, 5, 10, and 20 h to build the models of human hepatocyte steatosis. Oil Red O staining was performed to evaluate the fat content of the L02 liver cells. The mRNA expression levels of CDK2, CDK4, CyclinD1, Bcl-2, and c-Jun in the L02 cells at different time points were detected by real-time PCR.ResultsMore and more orange droplets were accumulated in the L02 cells with the time goes on, and the liver cells were dyed orange at 20 h. The mRNA expression level of CDK2 increased gradually, reached the peak at 5 h (P<0.05), and then decreased gradually; the mRNA expression level of CDK4 increased gradually, reached the peak at 10 h (P>0.05), then decreased gradually, and reached the lowest point at 20 h (P>0.05); no statistically significant difference was found in the expression levels of Cyclin D1 at different time points during the process (allP>0.05); the mRNA expression level of Bcl-2 increased over time, reached the peak at 10 h (P<0.05), and then decreased; the mRNA expression level of c-Jun was higher at 5, 10, and 20 h than that at 0 h (allP<0.05), but there were no regular changes.ConclusionDuring the process of hepatic steatosis, the relative mRNA levels of the cancer-related genes (CDK2, CDK4, Bcl-2, and c-Jun) first increase and then decrease, while the expression of Cyclin D1 does not change significantly.

hepatic steatosis; cell cycle; Cyclin; Cyclin-dependent kinase; Cyclin-dependent kinase inhibitor; B-cell lymphoma/leukemia-2; c-Jun gene

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.004

R575

A

1002-266X(2017)37-0012-03

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2015AA020702)。

包成(1990-)，男，在讀碩士，主要研究方向為脂肪肝。E-mail：908729477@qq.com

智發(fā)朝(1962-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為膽胰疾病和小腸疾病的微創(chuàng)治療。E-mail：zhifc41532@163.com

2017-06-13)