支氣管哮喘患兒血漿H2S水平變化及意義

黃海英，何慶娟，孫寶蘭，陳尚明

(南通大學附屬醫院，江蘇南通226200)

支氣管哮喘患兒血漿H2S水平變化及意義

黃海英，何慶娟，孫寶蘭，陳尚明

(南通大學附屬醫院，江蘇南通226200)

目的觀察支氣管哮喘患兒血漿硫化氫(H2S)水平變化，并探討其臨床意義。方法根據入院時病情將76例急性支氣管哮喘患兒(急性發作期組)分為輕度急性發作期組(n=33)、中度急性發作期組(n=24)、重度急性發作期組(n=19)，同期選取41例哮喘緩解期患兒為哮喘緩解期組、50例體檢健康兒童為對照組。測定各組肺功能和誘導痰細胞計數，用紫外可見分光光度法測定血漿H2S水平，酶聯免疫吸附法測定血漿TNF-α、IL-6水平。采用Pearson積矩相關分析血漿H2S水平與其他指標的關系。結果急性發作期組肺功能指標水平較對照組、哮喘緩解期組低(P均<0.05)。與對照組比較，急性發作期組、哮喘緩解期組誘導痰細胞總數及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞百分比，血漿TNF-α、IL-6水平高，巨噬細胞百分比、血漿H2S水平低(P均<0.05)，急性發作期組以上指標變化更明顯(P均<0.05)，且急性發作期患兒病情越嚴重，以上指標變化越明顯(P均<0.05)。支氣管哮喘急性發作期患兒血漿H2S水平與肺功能指標、巨噬細胞百分比呈正相關(P均<0.05)，與細胞總數、中性粒細胞百分比、嗜酸性粒細胞百分比、TNF-α、IL-6呈負相關(P均<0.05)。結論支氣管哮喘患兒血漿H2S水平降低，且病情越嚴重其水平越低。

支氣管哮喘；硫化氫；腫瘤壞死因子α；白細胞介素6

小兒支氣管哮喘是多種細胞(肥大細胞、T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等)參與的慢性非特異性氣道炎癥性疾病，具有病程遷延、反復發作的特點，嚴重影響患兒的生活質量[1]。硫化氫(H2S)是機體內含硫氨基酸代謝產生的內源性氣體，是繼一氧化氮、一氧化碳后的第3個新型信號分子，具有抗氧化應激、降血壓、抑制血管平滑肌細胞增殖及舒張血管平滑肌的作用[2]。H2S不僅具有維持氣道正常生理功能的作用，而且還通過促炎途徑參與了慢性阻塞性肺疾病[3]、哮喘[4]、肺損傷[5]等的發生發展。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)等炎性細胞因子是反映炎癥反應強度的重要介質，而炎癥反應激活參與了支氣管哮喘的發病過程。炎性細胞因子的過度釋放是導致支氣管哮喘病情進展的重要原因之一[6]。本研究通過測定不同病程支氣管哮喘患兒血漿H2S水平，探討其在疾病發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年1月～2017年1月本院收治的急性支氣管哮喘患兒76例(急性發作期組)，男41例、女35例，年齡4～14(7.4±2.8)歲，病程1～7(2.5±0.3)d。患兒納入標準：①符合中華醫學會兒科學會呼吸學組2008年修訂的小兒支氣管哮喘診斷標準及防治指南[7]；②患兒病情控制水平參照2009版全球哮喘防治創議診斷標準[8]；③近3個月內未接受細胞膜穩定劑、白三烯調節劑、類固醇類藥物治療；④入院前未接受可能影響本研究結果的藥物(茶堿類、H1受體拮抗劑等)治療。排除標準：①心臟功能不全者；②肝、腎功能障礙者；③合并有呼吸道感染疾病、免疫系統疾病及其他急慢性炎癥性疾病者。根據中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[9]將患兒分為輕度急性發作期組33例、中度急性發作期組24例、重度急性發作期組19例。同期選取41例哮喘緩解患兒為哮喘緩解期組，男23例、女18例，年齡5～14(8.2±2.4)歲。選取50例體檢健康兒童為對照組，男29例、女21例，年齡5～12(8.6±2.3)歲。各組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。該研究獲得本院倫理委員會批準；患兒家屬均在知情同意書上簽字。

1.2 肺功能測定 急性支氣管哮喘患兒均于入院接受治療時、哮喘緩解期組于出院時、對照組于體檢時采用肺活量計法(美國SENSORMEDICS2100肺功能儀)測定各組肺功能。受檢者取坐位，將鼻夾和口器安置好，囑其雙手壓住頰部并將頭抬高，放松并保持平靜呼吸，呼吸波結果平穩后記錄肺功能指標，包括第1秒用力呼氣容積(FEV1)占預計值百分比、用力肺活量(FVC)、FEV1與用力肺活量比值(FEV1/FVC)、呼氣峰流速(PEF)占預計值百分比。

1.3 誘導痰細胞檢測 急性支氣管哮喘患兒于入院時、哮喘緩解期組于出院時、對照組于體檢時參照文獻[10]進行誘導痰細胞檢測。囑受檢者檢測前漱口，吸入沙丁胺醇200 μg，15 min后霧化吸入濃度為3%的高滲鹽水40 mL。收集痰液并加入濃度為4%的二硫蘇糖醇溶液40 mL，混勻。將50 μL痰液放入細胞池中進行誘導痰細胞計數，包括細胞總數及淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞比例。

1.4 血漿H2S、TNF-α及IL-6水平檢測 急性支氣管哮喘患兒于入院時、哮喘緩解期組于出院時、對照組于體檢時清晨抽取空腹肘靜脈血3 mL，用肝素抗凝，以2 000 r/min離心10 min，留取血漿，于-70 ℃環境下待測。采用不同濃度的硫氫化鈉繪制標準曲線，反應液SAPBⅡ(NaOH、四乙二胺二鈉、抗壞血酸、去離子水混合溶液)與標準樣本以1∶1的比例充分混勻。采用紫外可見分光光度法測定血漿H2S水平，采用酶聯免疫吸附法測定血漿TNF-α、IL-6水平。TNF-α試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司，IL-6試劑盒購自北京方程生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 各組肺功能指標比較 各組FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC、PEF占預計值百分比比較差異有統計學意義(P均<0.05)。與對照組比較，哮喘緩解期組、急性發作期組FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC、PEF占預計值百分比低(P均<0.05)，急性發作期組最低(P均<0.05)。輕、中、重度急性發作期組FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC、PEF占預計值百分比較，P均>0.05。見表1。

表1 各組肺功能指標比較

2.2 各組誘導痰細胞比例比較 各組細胞總數及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞比例比較差異有統計學意義(P均<0.05)，進一步兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組血漿H2S、TNF-α、IL-6水平比較 各組血漿H2S、TNF-α、IL-66水平比較差異有統計學意義(P均<0.05)，進一步兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

2.4 H2S與其他指標的相關性 經Pearson積矩相關分析結果顯示，支氣管哮喘急性發作期患兒血漿H2S與肺功能指標(FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC、PEF占預計值百分比)呈正相關(r分別為0.398、0.411、0.439，P均<0.05)，與細胞總數、中性粒細胞比例、嗜酸性粒細胞比例呈負相關(r分別為-0.349、-0.361、-0.339，P均<0.05)，與巨噬細胞比例呈正相關(r=0.407，P<0.05)，與TNF-α、IL-6呈負相關(r分別為-0.492、-0.465，P均<0.05)。

表2 各組誘導痰細胞總數及各細胞比例比較

表3 各組血漿H2S、TNF-α、IL-6水平比較

3 討論

氣道炎癥在支氣管哮喘發病過程中具有重要作用，并且參與了疾病的轉歸過程[11,12]。臨床對于支氣管哮喘的診斷，主要根據臨床表現及肺功能檢查，但無法全面體現氣道炎癥，以致不能有效評估支氣管哮喘病情進展而指導臨床用藥。同時，年齡<6歲的支氣管哮喘患兒在肺功能檢測過程中依從性低，導致結果準確性低[13]。因此，尋找方便、高效、重復性好的評價指標輔助診斷支氣管哮喘，臨床價值重大。

機體內部產生的內源性氣體信號分子H2S參與調控了組織性病理生理狀態，其以氣體平滑肌細胞、肺組織內部的L-半胱氨酸為底物，在胱硫醚-r-裂解酶、胱硫醚-β-合成酶的催化作用下合成[14]。研究證實，H2S可通過舒張和降低血管平滑肌以調節心肌收縮力、抑制平滑肌細胞增殖；并且H2S還參與了代謝綜合征、肺動脈高壓、肺動脈休克、炎癥性反應等病理過程[15]。Wang等[16]研究顯示，H2S以炎性介質的形式介導了氣道炎癥和氣道的高反應性，通過給予外源性的H2S供體硫氫化鈉改善上述病理過程。

本研究結果顯示，對照組、哮喘緩解期組肺功能指標水平高于不同時期急性發作期組，并且對照組高于哮喘緩解期組，說明急性發作期支氣管哮喘患兒均存在肺功能損傷，隨病情緩解，肺功能損傷改善。該結果提示肺功能指標可作為評估支氣管哮喘病情改善的重要指標，與有關研究結果一致[14]。王彥等[17]結果顯示，支氣管肺泡灌洗后，中性粒細胞在重度急性支氣管哮喘患者痰液、氣道組織及支氣管肺泡灌洗液中明顯增加。Busse等[18]發現，中性粒細胞是支氣管哮喘發作時的特征之一，在氣道炎癥以及氣道重塑過程中具有重要作用。本研究結果顯示，支氣管哮喘患兒中性粒細胞比例高，與有關研究[14]結果一致。并且隨著病情的加重，中性粒細胞比例逐漸升高，提示中性粒細胞可作為評估支氣管哮喘病情嚴重程度的重要指標。此外，隨支氣管哮喘病情加重，細胞總數、嗜酸性粒細胞比例呈升高趨勢，巨噬細胞百分比呈降低趨勢，上述結果表明誘導痰細胞檢測可在一定程度上反映支氣管哮喘的發生發展。

本研究中對照組體內血漿H2S水平最高，哮喘緩解期組血漿H2S水平低于對照組，隨著支氣管哮喘急性發作程度加重，H2S水平呈下降趨勢，提示H2S參與了支氣管哮喘的發生發展過程，可作為臨床評估支氣管哮喘病情嚴重程度的重要指標。TNF-α是由淋巴細胞、巨噬細胞等合成并分泌的具有趨化作用的炎癥細胞因子，可通過聚集炎癥細胞如嗜酸性粒細胞等于氣道上皮細胞而導致炎癥反應的發生，同時也能損傷氣道上皮細胞。IL-6是由淋巴細胞等合并分泌的具有致炎功能的炎癥介質，可抑制前列腺素在支氣管哮喘患兒體內的合成，進而加重炎癥反應。另有研究發現，IL-6通過促進嗜酸性粒細胞釋放白三烯、過氧化物酶而增加氣道的阻力及引發氣道高反應性，并進一步使氣道損傷，是反映支氣管哮喘病情嚴重程度的重要細胞因子[6,18]。本研究結果顯示，隨病情嚴重程度的增加，TNF-α、IL-6水平呈逐漸上升趨勢，表明支氣管哮喘病情越嚴重，炎癥反應越嚴重，與有關研究[19,20]結果一致。

進一步相關性分析結果顯示，支氣管哮喘急性發作期患兒血漿H2S與肺功能指標呈不同程度正相關，并且與誘導痰細胞有關。支氣管哮喘發作時，肺部損傷嚴重，氣道炎癥明顯，胱硫醚-r-裂解酶的活性降低，進而導致H2S水平降低。該結果提示H2S可反映支氣管哮喘肺功能損傷嚴重程度和氣道炎癥反應強度。此外，血漿H2S與炎癥細胞因子TNF-α、IL-6呈負相關性，其機制可能是因為支氣管哮喘越嚴重，炎癥反應越重，淋巴細胞等合成并分泌的炎癥因子水平增加，下調了胱硫醚-r-裂解酶基因的轉錄，以致H2S水平降低。上述結果提示，H2S可作為評估支氣管哮喘患兒病情嚴重程度的重要指標，有重要的參考價值。

綜上所述，血漿H2S在支氣管哮喘患兒體內呈不同程度降低，可能參與了支氣管哮喘的發生發展過程，并且與炎癥細胞因子TNF-α、IL-6呈負相關。動態監測H2S可作為評估支氣管哮喘患兒病情的重要指標，從而指導臨床合理用藥。

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ChangesofplasmaH2Slevelsinchildrenwithbronchialasthma

HUANGHaiying,HEQingjuan,SUNBaolan,CHENShangming

(AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226200,China)

ObjectiveTo observe the changes of plasma hydrogen sulfide (H2S) levels in children with bronchial asthma and to explore its clinical significance.MethodsA total of 76 children with bronchial asthma (acute exacerbation group) were divided into the mild acute exacerbation group (n=33), moderate acute exacerbation group (n=24), and severe acute exacerbation group (n=19) according to the condition of children admitted to hospital. Meanwhile, 41 of children with asthma remission were selected as the asthma remission group and 50 healthy subjects as the control group. The lung function and induced sputum cell count in each group was measured. The level of plasma H2S was determined by UV Visible spectrophotometry, and the levels of TNF-α and IL-6 in the plasma were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Pearson product moment correlation was used to analyze the relationship between plasma H2S levels and other indexes.ResultsThe lung function indicators of the acute exacerbation group were lower than those of the control group, asthma remission group (allP<0.05). The percentage of total cells, percentage of neutrophils, percentage of eosinophils, plasma levels of TNF-α and IL-6 in the acute exacerbation group and asthma remission group were higher than those in the control group(P<0.05), while the percentage of macrophages and the plasma H2S level in the acute exacerbation group and asthma remission group were lower than those in the control group (bothP<0.05), and the changes of the above indicators were more significant in the acute exacerbation group (allP<0.05). What's more, with the condition increase of bronchial asthma, the above indicators changed more obviously (P<0.05). Among the children with acute exacerbation of bronchial asthma, the plasma H2S level was positively correlated with the lung function parameters and the percentage of macrophages (bothP<0.05), and were negatively correlated with the total cells, the percentage of neutrophils, percentage of eosinophils, and the levels of TNF-α and IL-6 (allP<0.05).ConclusionsThe level of plasma H2S in children with bronchial asthma decreases. The more serious the conditions of bronchial asthma becomes, the lower the plasma H2S level is.

bronchial asthma; hydrogensulfide; tumor necrosis factor-α; interleukin-6

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.007

R562.2

A

1002-266X(2017)37-0021-04

江蘇省衛生廳面上科研課題(H201589)。

黃海英(1979-)，女，碩士，主要研究方向為小兒呼吸系統急癥。E-mail:jiangsunantong719@163.com

陳尚明(1978-)，男，碩士，主要研究方向為小兒呼吸內科疾病。E-mail:li863268@126.com

2017-07-19)