腹膜纖維化大鼠模型構建及其腹膜組織中熱休克蛋白的表達變化

王乙安，宴玥，趙恒，陸琪，凡碟，者星煒

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650000)

·基礎研究·

腹膜纖維化大鼠模型構建及其腹膜組織中熱休克蛋白的表達變化

王乙安，宴玥，趙恒，陸琪，凡碟，者星煒

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650000)

目的構建腹膜纖維化大鼠模型，探討其腹膜組織中熱休克蛋白(HSP27、HSP70、HSP90)的表達變化。方法將40只SD大鼠隨機均分為空白對照組及造模2周組、造模4周組、造模6周組。模型組每日給予4.25%葡萄糖持續非臥床性腹膜透析液(100 mL/kg)腹腔注射，建立腹膜纖維化大鼠模型，空白對照組每日給予等量的生理鹽水腹腔注射。各組于末次腹膜透析后48 h行腹膜平衡試驗評估腹膜轉運功能(超濾量、小分子溶質轉運率)；采集大鼠腹膜組織，用HE染色法和Masson染色法觀察其組織病理學變化；采用免疫組化法檢測大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達。結果隨腹膜透析時間延長，模型組大鼠腹膜超濾量逐漸降低，小分子溶質轉運率逐漸升高(P均<0.05)；腹膜逐漸增厚，間質有炎癥細胞浸潤伴水腫及毛細血管增生；腹膜基質層增厚，膠原纖維增多，各組大鼠腸系膜組織厚度、腹膜組織厚度比較差異有統計學意義(P均<0.05)。各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達比較差異有統計學意義(P均<0.05)。結論成功構建腹膜纖維化大鼠模型；其腹膜組織中HSP27、HSP70、HSP90蛋白呈高表達，且透析時間越長，以上指標表達變化越明顯。

腹膜纖維化；腹膜透析；熱休克蛋白27；熱休克蛋白70；熱休克蛋白90；大鼠

持續非臥床性腹膜透析(CAPD)是目前終末期腎臟病的重要替代療法之一[1]。但腹膜組織在非生物相容性腹膜透析液的長期刺激下發生形態學改變，引起腹膜纖維化[2]。腹膜纖維化致超濾喪失是CAPD患者退出腹膜透析治療的主要原因，限制了CAPD的臨床應用。TGF-β/Smad信號蛋白的活化是多種器官和組織(腎、肝、肺、腹膜)纖維化發生發展最關鍵的信號通路[3]。熱休克蛋白(HSP)家族是機體應激時表達的蛋白質,是膠原成熟的必要條件，可能在纖維化過程中發揮重要作用[4]。近年來研究顯示，HSP27[5]、HSP70[6]、HSP90[7]在多種組織纖維化中表達異常，但與腹膜纖維化的關系尚未見報道。2016年9月～2017年6月，本研究建立大鼠腹膜纖維化模型，觀察隨透析時間的延長大鼠腹膜形態學、功能的改變以及HSP27、HSP70、HSP90蛋白在大鼠腹膜組織中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料來源 SD雄性大鼠40只，體質量(200±20)g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，每籠5只，于恒溫(22±2)℃、恒濕55%±5%條件下標準飼料喂養，自由飲水。4.25%葡萄糖透析液購自廣州百特醫療有限公司；兔抗大鼠TGF-β1、Smad2/3多克隆抗體購自Santa Cruze公司；兔抗大鼠HSP27、HSP70、HSP90多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；山羊血清封閉液購自Bioss公司；即用型快捷免疫組化二抗試劑盒購自邁新公司；陽離子防脫破片購自北京中杉金橋公司；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 動物分組及模型制備 將40只大鼠隨機均分為空白對照組及造模2周組、造模4周組、造模6周組。模型組每日給予4.25%葡萄糖腹膜透析液(100 mL/kg)腹腔注射；空白對照組每日給予等量生理鹽水腹腔注射。大鼠取頭低位，以右下腹靠腹股溝中點處為穿刺點，朝左上方進針，針頭與腹平面呈30°。注射過程中留意有無刺到腹壁及觀察有無肛門、尿道漏液。

1.3 取材方法 造模組分別于末次腹膜透析后48 h、空白對照組于喂養6周肌內注射10%水合氯醛進行麻醉，腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液25 mL，4 h后打開腹腔，抽取腹腔內腹膜透析液2 mL作為4 h腹透液標本；從腹透液袋中抽取透析液2 mL作為0 h腹透液標本。用紗布吸干腹腔內剩余液體，稱重，計算出液量。分別于腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液25 mL前(0 h)及4 h后從大鼠眼內眥抽靜脈血2 mL。將透析液、靜脈血分別以1 500、3 000 r/min離心10 min取上清液，置入-80 ℃冰箱保存，進行后續血生化檢測。沿兩側腹中線上、中位置且避開穿刺部位取材，留取腹膜組織，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進行形態學分析及免疫組化檢測；取大鼠幽門下段5～20 cm腸系膜組織，平展于清潔的白色有機玻璃上，肉眼觀察腸系膜組織變化。

1.4 腹膜轉運功能評估 采用腹膜平衡試驗。取透析液、靜脈血上清液，采用全自動生化分析儀測定透析液、血漿葡萄糖(Glu)、白蛋白(Alb)、總蛋白(Tp)、肌酐(Cr)、尿素(Ure)水平。計算透析液與血漿Alb比值(D/Ptp)、Tp比值(D/Palb)、Cr比值(D/PCr)、Ure比值(D/Pure)，4 h透析液Glu濃度與0 h透析液Glu濃度比值(D4/D0)。超濾量=最后出水量-25 mL；葡萄糖轉運量(MTG)=(透析液初始葡萄糖濃度×注入透析液體積)-(透析末葡萄糖濃度×終末透析液出量)；透析液與血漿溶質濃度之比(D/P)=透析液某時間點某溶質濃度/血漿該時間點該溶質濃度。

1.5 腹膜組織及腸系膜組織形態學變化觀察 將留取的腹膜組織及腸系膜組織用4%的多聚甲醛固定48～72 h，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度4 μm)，脫蠟。采用HE染色法，蘇木素、伊紅染色，梯度脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察腹膜組織及腸系膜組織形態學變化。每組取6個樣本，每個樣本做3張切片，每張切片觀察10個視野，測量5個不同位點腸系膜組織厚度，取平均值。切片脫蠟后，采用Masson染色法，分別經天青石蘭染液、Weiger鐵蘇木素液、麗春紅酸性品紅液染色，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察膠原沉積情況并測量腹膜組織厚度。每張切片觀察10個高倍視野，測量5個不同位點腹膜組織厚度，取平均值。

1.6 腹膜組織中TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達檢測 采用免疫組化法。石蠟切片脫蠟后，檸檬酸緩沖液修復抗原，山羊血清封閉，滴加稀釋后的一抗(TGF-β11∶100、Smad2/3 1∶100、HSP27 1∶100、HSP70 1∶300、HSP90 1∶300)，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，鏡下控制反應時間，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，陽性信號為棕黃色,信號越強，顏色越深，觀察棕褐色沉積的部位與深淺。每張切片隨機選擇10個高倍視野進行圖像采集，使用Image J圖像處理軟件對染色結果進行分析。有效測量面積范圍內目標染色區累積光密度值(IOD)/有效測量區域面積累積IOD作為目標蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組腹膜轉運功能比較 超濾量、D4/D0各組比較：空白對照組>造模2周組>造模4周組>造模6周組；小分子溶質轉運率(D/PCr、D/Pure、D/Ptp、D/Palb、MTG)各組比較：空白對照組<造模2周組<造模4周組<造模6周組。以上指標四組兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腹膜轉運功能指標比較

2.2 各組大鼠腹膜及腸系膜組織病理變化比較

2.2.1 HE染色結果 壁層腹膜組織HE染色顯示，空白對照組壁層腹膜表面覆蓋一層連續的扁平間皮細胞，細胞完整呈多邊形，核扁圓形，位于細胞中央，間皮下基質薄而致密；造模2周組腹膜間皮細胞腫脹變圓，間質有炎細胞浸潤伴水腫；造模4周組腹膜增厚，間皮細胞腫脹變圓，部分脫落，間質有炎細胞浸潤伴水腫，間皮下基質增厚伴毛細血管增生；造模6周組腹膜明顯增厚，間皮細胞皺縮，脫落，纖維裸露，炎細胞減少。腸系膜HE染色結果顯示：隨造模時間延長，腸系膜組織厚度增厚、腸外縱肌層增厚。腸系膜肉眼可見隨著造模時間的延長，腸系膜透明度減低，系膜上小血管明顯增生，且腸系膜根部有白色纖維樣物質沉積。各組大鼠腸系膜組織厚度兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

2.2.2 Masson染色結果 空白對照組腹膜組織薄而連續，致密光滑，隨著造模時間的延長，間皮下致密層增厚，膠原纖維增多，腹膜組織厚度增加；隨著腹膜透析時間延長，以上改變更加明顯。各組大鼠腹膜厚度兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腸系膜組織及腹膜組織厚度比較

2.3 各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達比較 各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白相對表達量兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

3 討論

國內外大量研究表明，CAPD透析效率與血液透析相當，且對于心功能欠佳、血壓偏低、有出血傾向的患者效果更佳[1]。但透析過程中腹膜組織長期暴露在高滲、高糖的非生理性透析液中，引起腹膜形態學和功能的改變，繼而發生腹膜纖維化，導致小分子溶質轉運率升高和超濾衰竭[2]。最終患者無法持續進行CAPD。腹膜透析時腹膜纖維化呈漸進性，過程隱匿，不易被察覺。目前，國內外判別腹膜纖維化的主要方法是觀察腹膜組織形態變化及檢測間皮細胞和間充質細胞標志物表達的變化。臨床上則采用定期行腹膜平衡試驗觀察小分子溶質轉運率的變化來判斷患者腹膜情況及是否發生超濾衰竭，但該方法特異性不強，且與腹膜纖維化的嚴重程度無相關性。HSP因參與膠原的合成，近年來引起關注。

表3 各組大鼠腹膜組織TGF-β1、Smad2/3、HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達比較

CAPD患者腹膜功能的改變主要為腹膜溶質轉運率增高，超濾量下降，而腹膜溶質高轉運以小分子溶質轉運率增加為特征，其中小分子溶質包括Glu、Alb、Tp、Cr、Ure等[8]。本研究通過采用4.25%葡萄糖透析液建立腹膜纖維化大鼠模型，發現從造模第2周起，大鼠腹膜形態開始發生改變，腹膜間皮細胞數量減少，大量新生血管形成，炎癥細胞浸潤，腹膜基質層膠原堆積，超濾量降低，小分子溶質轉運率增高。且隨著透析時間延長，以上指標改變更加明顯，至第6周達高峰。與相關文獻[9]結果一致，證明成功建立了大鼠腹膜纖維化模型。

多器官、組織的纖維化如腎、肝、肺等器官以及腹膜纖維化的發生發展均與TGF-β有關[3]。TGF-β主要通過激活下游信號蛋白Smads，促進成纖維細胞增殖和聚集，使上皮細胞轉化為成纖維細胞。本研究結果顯示，透析組大鼠TGF-β1、Smad2/3的表達逐漸升高，且隨著腹膜纖維化的進展呈升高趨勢，與相關文獻[10]結果一致。

HSP是機體應激時表達的一種蛋白質，既能通過模式識別受體激活先天免疫系統啟動或促進炎癥反應，也能作為前膠原的“分子伴侶”參與膠原合成及成熟，并調控膠原產量，進而促進纖維化進程[4]。近年來研究發現，HSP家族在肺、肝、腎等多種纖維化疾病中表達異常[5～7]。Vidyasagar等[11]研究發現，腎臟纖維化過程中HSP27的表達升高，且HSP27與纖維化相關因子TGF-β1、肌動蛋白、E-鈣黏蛋白相關。HSP70在纖維化中發揮不同的作用。Tanaka等[12]研究證實HSP70具有抗纖維化的作用，過表達HSP70的轉基因小鼠肺部炎癥和纖維化病變減輕；而抑制HSP70的表達可促進TGF-β1分泌及細胞外基質的合成，進而促進纖維細胞向肌成纖維細胞分化和增生，加劇小鼠肺纖維化進程。與之相反，部分研究發現，HSP70可激活先天免疫系統及促進炎癥反應，并促進膠原合成[6]。HSP70發揮的作用不同，可能是因為隨著造模時間的延長，機體度過恢復期，HSP70的保護作用逐漸減弱，促纖維化作用占主導地位，從而加重纖維化。故HSP70在纖維化中具體作用機制尚待進一步明確。抑制HSP90的表達可通過抑制肌成纖維細胞、纖維連接蛋白及膠原蛋白的表達來抑制腎臟纖維化與肝纖維化[13]。機制可能為：其低表達可阻遏TGF-β1靶基因的轉錄及磷酸化，從而抑制TGF-β1信號通路，阻止纖維化的發生。本研究發現，造模2～4周組中HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達量不斷增加，說明HSP27、HSP70、HSP90蛋白表達隨著腹膜纖維化進程而逐漸增加，提示在腹膜纖維化過程中，HSP27、HSP70、HSP90的主導作用為促進膠原的合成，參與腹膜纖維化的病理進展。

綜上所述，HSP27、HSP70、HSP90可能參與大鼠腹膜纖維化的發生發展。HSP可能成為早期診斷腹膜纖維化的新型分子標志物。因此深入探討HSP與腹膜纖維化的相關分子機制，對HSP家族分子進行調控，可能影響腹膜纖維化的進展，為臨床腹膜纖維化的診斷、治療及預后提供參考。

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