三七總皂苷對人骨髓瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響

張倩倩，李曉紅

(河北省中醫(yī)院，石家莊050011)

三七總皂苷對人骨髓瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響

張倩倩，李曉紅

(河北省中醫(yī)院，石家莊050011)

目的探討三七總皂苷對人骨髓瘤細(xì)胞U266增殖、凋亡的影響。方法將培養(yǎng)好的U266細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組及三七總皂苷低、中、高濃度組，分別加入無血清RPMI1640培養(yǎng)液、3.2 mmol/L的地西他濱及50、100、200 mg/L三七總皂苷各200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。采用MTT法測算細(xì)胞增殖抑制率，用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比例。采用簡單線性回歸分析濃度、時間依賴性。結(jié)果三七總皂苷組隨干預(yù)時間延長、藥物濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率、凋亡細(xì)胞比例升高。干預(yù)72 h，三七總皂苷高濃度組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡細(xì)胞比例高于空白對照組及三七總皂苷低、中濃度組(P均<0.05)，與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論三七總皂苷可抑制U266細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，且該作用具有時間濃度依賴性。

骨髓瘤；三七總皂苷；U266細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

多發(fā)性骨髓瘤是一種來源于漿細(xì)胞的惡性血液腫瘤，其發(fā)病率僅次于白血病，排在血液系統(tǒng)腫瘤的第2位。多發(fā)性骨髓瘤病情進(jìn)展迅速，生存期約4年[1]。目前臨床多采用激素聯(lián)合化療藥物治療多發(fā)性骨髓瘤，但多發(fā)性骨髓瘤異質(zhì)性很強(qiáng)，瘤細(xì)胞可在骨髓中迅速增殖，導(dǎo)致骨折、骨髓功能衰竭。多發(fā)性骨髓瘤生長的速度與骨髓微環(huán)境密切相關(guān)。復(fù)雜的生長環(huán)境導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤易形成耐藥性，因此臨床以個體化治療為主[2]。三七又名田七，具有散瘀止血、消腫鎮(zhèn)痛等功效[3]，其主要活性成分為三七總皂苷。三七總皂苷具有降低血脂、增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)免疫力、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗纖維化等作用。近年來還發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷具有抗腫瘤作用[4]。有研究報道，三七總皂苷可抑制肝癌細(xì)胞(HepG2、H22、SMMC-7721)、白血病細(xì)胞(HL-60)、宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)在體外增殖，還可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多重耐藥性[5]。2016年10月～2017年4月，本研究探討不同濃度三七總皂苷對骨髓瘤細(xì)胞U266增殖的影響，為研究三七總皂苷的藥理學(xué)功能提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 三七總皂苷純品購自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司；人骨髓瘤細(xì)胞U266購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gene公司；Hyclone小牛血清購自美國Thermo scientific公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；地西他濱、四氮唑藍(lán)(MTT)、臺盼藍(lán)購自美國Sigma-Aldrich公司；其余分析純試劑購自國藥集團(tuán)北京分公司。

1.2 細(xì)胞分組及藥物干預(yù) 將U266細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)后消化，置于96孔板，每孔1×104個。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組及三七總皂苷低、中、高濃度組，分別加入無血清RPMI1640培養(yǎng)液、3.2 mmol/L的地西他濱[6]及50、100、200 mg/L三七總皂苷各200 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.3 U266細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法。將各組細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，PBS清洗2次，加入5 mg/mL的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，在搖床上放置15 min。酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處光密度(A)值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(空白對照組A值-實驗組A值)/空白對照組A值×100%。

1.4 U266細(xì)胞凋亡比例檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。將各組細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS清洗2次，加入Binding buffer液500 μL重懸細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整為1×106/mL，取細(xì)胞懸液200 μL，加入Annexin V-FITC流式抗體5 μL混勻，再加入Propidium Iodide 5 μL混勻，避光室溫孵育20 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 三七總皂苷組隨藥物干預(yù)時間延長、藥物濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率升高。干預(yù)24 h，陽性對照組細(xì)胞增殖抑制率高于其他組(P均<0.05)，空白對照組與三七總皂苷各濃度組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；干預(yù)48 h，陽性對照組、高濃度三七總皂苷組細(xì)胞增殖抑制率高于其他組(P均<0.05)；干預(yù)72 h，三七總皂苷高濃度組細(xì)胞增殖抑制率高于空白對照組及三七總皂苷低、中濃度組(P均<0.05)，與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 各組細(xì)胞凋亡比例比較 三七總皂苷組隨藥物干預(yù)時間延長、藥物濃度增加，凋亡細(xì)胞比例升高。干預(yù)24、48、72 h，三七總皂苷高濃度組凋亡細(xì)胞比例高于空白對照組及三七總皂苷低、中濃度組(P均<0.05)，與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組凋亡細(xì)胞比例比較

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是來源于分化階段B細(xì)胞的血液腫瘤，發(fā)病后的中位生存期約為3年，僅有1/4患者生存期5年以上[7]。目前，地西他濱作為胞苷類似物廣泛應(yīng)用于治療多發(fā)性骨髓瘤，其在低劑量時可通過去甲基化的方式抑制腫瘤相關(guān)基因活化，而這些基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，使得腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1期，同時還影響腫瘤細(xì)胞的黏附、凋亡、增殖、遷移等功能；高劑量時可直接殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。但長期應(yīng)用地西他濱可能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥，使得多發(fā)性骨髓瘤患者出血傾向加重。因此需要尋找更為安全有效的藥物治療多發(fā)性骨髓瘤。

中醫(yī)將多發(fā)性骨髓瘤歸于“骨蝕”范疇，認(rèn)為該病為“虛邪之入于身也深，寒與熱相互搏”所致[9]。根據(jù)中醫(yī)辨證施治的思想，我們對多發(fā)性骨髓瘤實施化療的同時采用補(bǔ)腎化濁法治療，取得滿意效果。所用藥物包括全蟲、地龍、蜈蚣、三七、黨參等多味中藥，具有清解邪毒、健脾益氣、化痰祛瘀的功效。三七在治療腫瘤方面有獨(dú)特功效，其為五加科人參屬植物，以干燥根及根莖入藥，味甘，微苦，性溫，歸肝、胃經(jīng)，有散瘀止血、消腫止痛的功能。現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究已經(jīng)證實，三七的活性提取物三七總皂苷能夠抑制不同組織來源的人源性腫瘤細(xì)胞生長，而且在動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)三七總皂苷能夠抑制移植瘤的生長，并且不良反應(yīng)小，對肝、腎、骨髓等多種器官均無明顯損傷[5,10,11]。三七總皂甙具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的效應(yīng)，主要通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期發(fā)揮對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、胃細(xì)胞株MKN-28和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的抑制作用。其藥理學(xué)機(jī)制與抑制NF-κB蛋白活性，干預(yù)NF-κB通路有關(guān)。

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，由于漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)大量增殖，造成溶骨性破壞和凝血功能障礙，臨床可表現(xiàn)為骨痛、自發(fā)性骨折、感染、貧血、出血及高黏滯綜合征、急慢性腎衰竭等。根據(jù)中國醫(yī)師協(xié)會血液科醫(yī)師分會制定的《2011年中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》治療方案，多發(fā)性骨髓瘤的治療以抑制骨髓瘤細(xì)胞生存、阻止腫瘤生長和抑制血管生成為主，選用的藥品包括沙利度胺、雷利度胺、硼替佐米和地西他濱等；而對于輔助化療則主張選用不同靶點(diǎn)的藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖，降低腫瘤的抗藥性。三七總皂苷可以有效抑制細(xì)胞增殖的調(diào)控蛋白NF-κB表達(dá)，有效抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖。這一點(diǎn)與地西他濱相似，可使得S期和G2～M期細(xì)胞比例明顯降低，G0～G1期細(xì)胞比例明顯增加。本研究結(jié)果顯示，高濃度的三七總皂苷作用效果可以到達(dá)甚至超過地西他濱對多發(fā)性骨髓瘤的抑制作用；濃度為200 mg/L的三七總皂苷干預(yù)48、72 h后，U266細(xì)胞的凋亡比例明顯增加。這說明大量的腫瘤細(xì)胞仍然處于G0/G1期，并未進(jìn)一步增殖。

綜上所述，多發(fā)性骨髓瘤作為一種惡性的血液系統(tǒng)腫瘤一直是臨床治療的難點(diǎn)之一，三七總皂苷可有效抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。由于三七總皂苷不良反應(yīng)少，對肝、腎、骨髓等多種器官均無明顯損傷，具有潛在臨床應(yīng)用價值。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.009

R329.2

A

1002-266X(2017)37-0029-03

河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃(2011083)。

李曉紅(E-mail:hblxh2002@163.com)

2017-07-18)