大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同品系小鼠移植皮膚存活時(shí)間的影響及機(jī)制

郝貴亮，解童玲，李玉奎，楊宗軍

(1青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266000；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同品系小鼠移植皮膚存活時(shí)間的影響及機(jī)制

郝貴亮1，解童玲1，李玉奎2，楊宗軍1

(1青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266000；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

目的探討經(jīng)尾靜脈注射大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)對(duì)不同品系小鼠移植皮膚存活時(shí)間的影響及機(jī)制。方法分離SD大鼠BMMSC培養(yǎng)至第3代。用皮膚取樣器切取60只ICR乳鼠圓形皮片(直徑12 mm)，將其移植至成年C57BL/6小鼠背部，建立不同品系小鼠間皮膚移植免疫排斥模型。將60只模型小鼠隨機(jī)均分為PBS組及低、中、高劑量BMMSC組，分別經(jīng)尾靜脈注射PBS、5×104個(gè)BMMSC、10×104個(gè)BMMSC、20×104個(gè)BMMSC各0.2 mL。記錄各組移植皮膚存活時(shí)間。術(shù)后第7天，HE染色觀察移植皮膚病理組織學(xué)變化；每組隨機(jī)取5只小鼠處死取其脾臟組織及血清，分別用RT-PCR及ELISA法檢測(cè)IL-10、TNF-α、IFN-γ。結(jié)果中、高劑量BMMSC組皮膚存活時(shí)間較PBS組、低劑量BMMSC組長(zhǎng)(P均<0.05)；中、高劑量BMMSC組皮膚存活時(shí)間比較，P>0.05。術(shù)后第7天，病理切片鏡下觀察顯示PBS組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最明顯，高劑量BMMSC組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最少。術(shù)后第7天，與PBS組比較，低、中、高劑量BMMSC組脾臟組織TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量低(P均<0.05)。與PBS組比較，中、高劑量BMMSC組血清IL-10水平高(P均<0.05)，低、中、高劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)；與低劑量BMMSC組比較，中劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)，高劑量BMMSC組血清IL-10水平高、TNF-α水平低(P均<0.05)。結(jié)論經(jīng)尾靜脈注射適當(dāng)劑量的大鼠BMMSC可延長(zhǎng)不同品系小鼠移植皮膚存活時(shí)間；該作用可能與BMMSC調(diào)控受體小鼠IL-10、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)有關(guān)。

皮膚移植；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；免疫排斥；小鼠

大面積燒燙傷發(fā)生后，快速有效封閉創(chuàng)面可減少感染、休克等的發(fā)生，并提高患者生存率，皮膚移植是有效封閉創(chuàng)面的重要手段之一。臨床用于移植的皮膚主要有三個(gè)來(lái)源：自體、異體和異種。對(duì)大面積燒燙傷患者來(lái)說(shuō)，自體皮膚移植往往不足，而后兩者會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的排斥反應(yīng)。燒燙傷患者在2～3周進(jìn)入全身感染的高峰期，此時(shí)有效皮膚覆蓋是治療成功的關(guān)鍵。異種移植皮膚的臨時(shí)覆蓋時(shí)間僅為2周，同種異體皮膚也僅3周。如何延長(zhǎng)異體移植皮膚的存活時(shí)間是皮膚移植亟待解決的問(wèn)題[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)具有低免疫原性和抑制免疫排斥等作用。2014年8月～2016年3月，本研究構(gòu)建不同品系間小鼠皮膚移植的免疫排斥模型，經(jīng)尾靜脈注射BMMSC至模型小鼠體內(nèi)，觀察移植皮膚的存活時(shí)間，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器來(lái)源 SD大鼠(雄性、6～8周齡、體質(zhì)量120～150 g)、ICR乳鼠(雄性、2～4日齡、體質(zhì)量2～3 g)、C57BL/6小鼠(雌雄各半、8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g)由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；DMEM、FBS購(gòu)自Gibco公司；PBS購(gòu)自Hyclone公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；多聚甲醛、水合氯醛、蘇木素、伊紅、無(wú)水乙醇等購(gòu)自生工生物有限責(zé)任公司；ELISA試劑盒購(gòu)自博士德生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ROX qPCR Master Mix(2×)、3423型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；CKX41型倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；IQ5型熒光定量PCR儀、680型酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 BMMSC分離、培養(yǎng)及鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[2]利用梯度離心和貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMMSC，培養(yǎng)至第3代時(shí)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSC CD73、CD105、CD45、CD90、CD14、CD34、HLA-DR的陽(yáng)性率。分離后的BMMSC在體外培養(yǎng)24 h后已有部分貼壁，培養(yǎng)至第3代時(shí)，BMMSC呈條索狀排列，流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示： CD73、CD105、CD90陽(yáng)性率均在95%以上，而CD14、CD34、HLA-DR、CD45陽(yáng)性率均低于5%，證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為BMMSC[3]。

1.3 不同品系間小鼠皮膚移植免疫排斥模型建立 按文獻(xiàn)[4]方法，用皮膚取樣器切取60只ICR乳鼠圓形皮片(直徑12 mm)，置于PBS中備用。4%水合氯醛腹腔注射麻醉C57BL/6小鼠，在其背部靠近左前肢處剪取直徑12 mm左右全層皮膚缺損，將ICR乳鼠皮片覆蓋在C57BL/6小鼠皮膚缺損處，建立不同品系小鼠間皮膚移植免疫排斥模型，凡士林紗布覆蓋后創(chuàng)可貼包扎固定。造模后將60只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為PBS組、低劑量BMMSC組、中劑量BMMSC組和高劑量BMMSC組，每組15只；分別注射PBS、5×104個(gè)BMMSC、10×104個(gè)BMMSC、20×104個(gè)BMMSC各0.2 mL。術(shù)后從第3天開(kāi)始拆包觀察移植皮膚排異情況并拍照。從手術(shù)之日起至移植皮膚出現(xiàn)變硬、發(fā)黑、壞死、翹起或脫落中的任一現(xiàn)象的面積大于50%的時(shí)間為移植皮膚存活時(shí)間，面積計(jì)算方法采用畫(huà)表格法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 移植皮膚病理組織學(xué)觀察 術(shù)后第7天，每組隨機(jī)取5只小鼠，切取移植部位皮膚用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明，浸蠟后行石蠟包裹切片，置于65 ℃烘箱2 h后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水行HE染色，中性樹(shù)脂封片后顯微鏡下觀察并采集照片。

1.5 模型小鼠脾臟組織白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR技術(shù)。術(shù)后第7天，每組隨機(jī)取5只小鼠，脫臼法處死后取其脾臟。TRIzol法提取脾臟組織總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)經(jīng)65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min在PCR儀中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR法按95 ℃ 3 min ，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)， 72 ℃10 min。根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列由生工生物有限責(zé)任公司合成。IL-10正義鏈：5′-AGACAATAACTGCACCCACTTCC-3′，反義鏈：5′-GTCGGTTAGCAGTATGTTGTCCAG-3′；TNF-α正義鏈：5′-CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA-3′，反義鏈：5′-GGCAGAGAGGAGGTTGACTTTC-3′；IFN-γ正義鏈：5′-GTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGA-3′，反義鏈：5′-GCTGAAGAAG-GTAGTAATCAGGTGTG-3′；β-Actin正義鏈：5′-GAG-ACCTTCAACACCCCAGC-3′，反義鏈：5′-GGAGAGCATAGCCCTCGTAGAT-3′。

1.6 模型小鼠血清中IL-10、TNF-α、IFN-γ檢測(cè) 采用ELISA法。術(shù)后第7天，每組取5只小鼠，摘除眼球取血，4 ℃過(guò)夜，離心分離血清，按試劑盒詳細(xì)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清中IL-10、TNF-α、IFN-γ。

2 結(jié)果

2.1 各組移植皮膚存活情況 術(shù)后小鼠運(yùn)動(dòng)飲食正常，24 h開(kāi)始小鼠有大量出汗現(xiàn)象。PBS組術(shù)后第3天，3只小鼠移植皮膚出現(xiàn)發(fā)黑壞死；第5天，8只小鼠壞死面積已超過(guò)50%。低劑量BMMSC組術(shù)后第3天，2只小鼠移植皮膚出現(xiàn)發(fā)黑壞死；第5天，6只小鼠移植皮膚壞死面積大于50%。中劑量BMMSC組術(shù)后5天，皮膚紅潤(rùn)，無(wú)發(fā)黑、壞死、翹起、脫落等現(xiàn)象；第6天，開(kāi)始出現(xiàn)較弱的排異反應(yīng)；第9天，7只小鼠移植皮膚出現(xiàn)變硬、壞死等面積達(dá)50%。高劑量BMMSC組術(shù)后第5天，移植皮膚紅潤(rùn)柔軟，無(wú)排異反應(yīng)發(fā)生；第9天，8只小鼠移植皮膚發(fā)黑、壞死面積超過(guò)50%。PBS組、低劑量BMMSC組、中劑量BMMSC組和高劑量BMMSC組皮膚存活時(shí)間分別為(5.13±1.37)、(6.15±1.29)、(9.29±1.14)、(9.41±1.71)d；中、高劑量BMMSC組皮膚存活時(shí)間較PBS組、低劑量BMMSC組長(zhǎng)(P均<0.05)；PBS組與低劑量BMMSC組存活時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量BMMSC組皮膚存活時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組移植皮膚病理組織學(xué)變化 術(shù)后第7天，PBS組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最明顯，隨著B(niǎo)MMSC劑量的增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少，高劑量BMMSC組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最少。

2.3 各組脾臟組織IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)比較 術(shù)后第7天，與PBS組比較，低、中、高劑量BMMSC組脾臟組織IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組脾臟組織IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 各組血清IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較 與PBS組比較，中、高劑量BMMSC組血清IL-10水平高(P均<0.05)，低、中、高劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)；與低劑量BMMSC組比較，中劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)，高劑量BMMSC組血清IL-10水平高、TNF-α水平低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較

3 討論

燒燙傷是日常生活中比較常見(jiàn)的意外傷害之一，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)我國(guó)每年有500萬(wàn)～1 000萬(wàn)人被不同程度的燒燙傷[5]，尤其是大面積、Ⅱ度、Ⅲ度及其他重度燒燙傷患者如果不能得到及時(shí)治療，病死率極高；而最常用的治療方法之一就是皮膚移植。對(duì)于大面積燒燙傷來(lái)說(shuō)，自體皮膚移植很難實(shí)現(xiàn)，而異體或異種皮膚移植都不可避免出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)。因此降低甚至是消除移植后的免疫排斥反應(yīng)是器官移植面臨的主要問(wèn)題之一。目前研究最多的抑制移植免疫排斥的方法有：建立不同品系間嵌合體、阻斷第二信號(hào)等。建立不同品系間嵌合體常用射線(xiàn)照射或應(yīng)用骨髓生長(zhǎng)抑制劑的方法建立不同品系間骨髓嵌合體[6]；阻斷第二信號(hào)常通過(guò)結(jié)合抗原提成細(xì)胞CD80和CD86受體，從而阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)誘導(dǎo)免疫耐[7]。上述方法效果顯著，但有較高的危險(xiǎn)性。間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性和抑制移植后的免疫排斥反應(yīng)而備受關(guān)注，其主要來(lái)源有骨髓、脂肪、胎盤(pán)、臍血等，具有安全性高，取材來(lái)源廣泛等優(yōu)勢(shì)。

研究表明，IL-10的主要生物學(xué)活性是免疫抑制作用，可通過(guò)抑制活化的T細(xì)胞分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ，從而抑制遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[8]。陳富超等[9]發(fā)現(xiàn)，IL-10有抗家兔皮膚移植排斥反應(yīng)的作用。Singla等[10，11]認(rèn)為，免疫抑制劑主要通過(guò)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性抑制IFN-γ、TNF-α等的分泌，從而抑制皮膚移植等免疫排斥反應(yīng)[12，13]。TNF-α主要損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使移植皮膚因缺血而壞死[14，15]。因此，IL-10水平升高及IFN-γ、TNF-α水平降低均有助于降低免疫排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間。本研究通過(guò)建立不同品系間小鼠皮膚移植免疫排斥模型，探討B(tài)MMSC對(duì)移植皮膚存活時(shí)間的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。當(dāng)BMMSC通過(guò)尾靜脈注入受體小鼠體內(nèi)后，通過(guò)血液循環(huán)迅速到達(dá)移植部位，調(diào)節(jié)免疫因子IL-10、TNF-α及IFN-γ等的表達(dá)，達(dá)到降低移植皮膚免疫排斥作用。結(jié)果，中、高劑量BMMSC組移植皮膚的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)；低、中、高劑量BMMSC組TNF-α、IFN-γ 表達(dá)降低，中、高劑量BMMSC組IL-10 表達(dá)升高。進(jìn)一步證明以上論點(diǎn)。

綜上所述，適當(dāng)劑量的BMMSC通過(guò)尾靜脈注射至免疫排斥模型受體小鼠體內(nèi)可明顯延長(zhǎng)小鼠移植皮膚的存活時(shí)間，這可能與調(diào)節(jié)受體小鼠免疫因子IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達(dá)有關(guān)。

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楊宗軍(E-mail：a13789856688@126.com)

2017-07-05)